专利名称：双氯芬酸偶联衍生物、其合成方法及抗炎作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及双氯芬酸(DC，下同)与取代的呋咱和硝氧甲基苯酚相偶联的化合物，它们的合成方法及其在制备抗炎、镇痛药方面的应用。
非甾体抗炎药(NSAIDs)是一类临床上广为应用的抗炎、镇痛药物，但其消化道副作用较为严重，如胃溃疡、穿孔、出血等。究其原因主要是NSAIDs在抑制炎症部位前列腺素(PGs)的同时，也抑制了胃肠道具有粘膜保护作用的PGs的合成。降低胃肠道副作用是近年来研究和开发新型NSAIDs的基本出发点。90年代初环氧酶(COX)两种亚型COX-1和COX-2的发现是NSAIDs发展史上的一大突破，使人们有可能研究抑制炎症部位PGs的COX-2选择性抑制剂，但其对肾脏和中枢神经系统是否产生毒性须长期临床观察后才能定论。90年代NSAIDs的另一重大进展是一氧化氮(NO)供体型NSAIDs，它的问世得益于80年代后期对NO的深入研究，其设计思想是基于NO与PGs在胃肠道作用的类似性和互补性，将具有NO释放性质的基团偶联到传统的NSAIDs分子中，这种NO-NSAIDs(一氧化氮供体型非甾体抗炎药，下同)在体内释放NO和原药NSAIDs，保留或增强抗炎作用，减少或消除NSAIDs引起的胃肠道副作用。
近年来已有数项专利涉及硝酸酯类的NO-NSAIDs，主要是硝酸烷基酯的制备及其抗炎和抗血栓活性。英国Metgrove公司合成了DC的饱和硝酸酯(PCT，专利号WO94/04484),Arena等人合成了芳基丙酸类NSAIDs的硝酸丁酯(PCT，专利号WO94/12463),Serra Masia等合成了醋氯芬酸及其衍生物的饱和硝氧烷基酯(EP,专利号0738 706A1),Mimoso等人合成了一系列NO-NSAIDs，其中NSAIDs包括芳基丙酸类，芳基乙酸类及昔康类，NO释放基团为亚硝酸酯，硫代亚硝酸酯及斯德酮亚胺等(PCT，专利号US96/32946),Del soldato等人制备了一系列阿司匹林类化合物的芳基硝酸酯(PCT，专利号97/16405)，中国的蔡雄等也制备了多种NSAIDs的饱和及不饱和的硝酸酯(CN，公开号1144092A)。这些专利化合物在体内释放一氧化氮和原药NSAID，具有和原药相当的抗炎和抗血栓活性，但胃肠道副作用明显减小。例如Nitrofenac，为一已知硝酸酯类NO-DC(专利号WO94/04484)，其抗炎活性与DC相当，胃肠道副作用小于DC(Wallace JL,CirinoG.A diclofenac derivative without ulcerogenic properties.Eur JPharmacol1994,257:249-255)(Elliott SN,Mcknight W,Cirino G,et al.A nitricoxide-releasing nonsteroidal anti-inflammatory drug accelerates gastriculcer healing in rats.Gastroenterology 1995,109:524-530)。
本发明的目的在于提供一种比现有药物更好的新型NO-NSAID，它们在体内释放NO和DC，发挥抗炎作用，同时也减少或消除DC的胃肠道毒副作用，可作为抗炎镇痛药，用于治疗风湿性、类风湿性关节炎、骨关节炎等疾病。
本发明的目的还在于提供一种新型NO-NSAID的可工业化生产的制备方法。
本发明的技术方案如下通式Ⅰ化合物 其中R1代表O,NH；R2代表-(CH2)n-,n=3-5；CH2C≡CCH2；CH2CH(CH3)CH2CH2；CH2CH2OCH2CH2；-PhCH2-(m,p)。通式Ⅱ化合物 其中R3代表-PhCH2-(o,m,p)；-Ph-(m,p)。通式Ⅲ化合物 其中R3代表-PhCH2-(o,m,p)；-Ph-(m,p)。通式Ⅳ化合物 通式Ⅰ化合物制备方法，其特征在于双氯芬酸钠(DC-Na)与卤代醇反应后再与取代的呋咱氮氧化物缩合，或者DC与含羟基或氨基的呋咱氮氧化物(Ⅰp)在二环己基碳酰亚胺(DCC)存在下缩合， 其中R1代表OH,NH2；R2代表-(CH2)n-,n=3-5；CH2C≡CCH2；CH2CH(CH3)CH2CH2；CH2CH2OCH2CH2；-PhCH2-(m,p)。
具体反应步骤为 其中X代表Br,Cl；n=3-5；或者 通式Ⅱ化合物制备方法，其特征在于DC与含羟基的呋咱氮氧化物(Ⅱp)在DCC存在下缩合， 其中R3代表-PhCH2-(o,m,p)；-Ph-(m,p)。具体反应步骤为 通式Ⅲ化合物制备方法，其特征在于DC与含羟基的呋咱氮氧化物(Ⅲp)在DCC存在下缩合， 其中R3代表-PhCH2-(o,m,p)；-Ph-(m,p)。
具体反应步骤为
通式Ⅳ化合物制备方法，其特征在于DC与硝氧甲基酚(Ⅳp)在DCC存在下缩合。 具体反应步骤为 通式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ化合物用于制备抗炎、镇痛药。
通式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ化合物的药理实验如下。1．抗炎活性1.1对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响实验方法见徐叔云，卞如濂，陈修主编，《药理实验方法学》第二版，北京人民卫生出版社，1991年版。
DC-Na购自湖北宜城五联制药厂，规格为药用，下同。
Nitrofenac按专利(EP，专利号738706)方法合成，其结构经波谱确证。Nitrofenac为已知硝酸酯类NO-DC(WO94/04484)，有文献报道，其抗炎活性与DC相当，且胃肠道副作用小于DC，故将其作为参比药物，下同。
所有药物均用0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配成1.57×10-3mol/L的混悬液，与DC-Na等摩尔浓度。油状物则先加入药液总体积5％的二甲基亚砜，再加入总体积95％的0.5％CMC-Na，充分混匀。DC-Na给药剂量设定为20mg/kg，此剂量由人用剂量换算而来。
实验前小鼠禁食12小时，但不禁水。对小鼠灌胃给药，给药体积为0.4ml/10g。给药1小时后将小鼠右耳廓两侧用微量进样器均匀涂布二甲苯20μl致炎，左耳廓作对照。致炎30分钟后将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基线取下两耳，用打孔器(直径为7mm)于同一部位各取一个耳片称重。致炎侧耳片重量减去对照侧耳片重量即为肿胀度。将各组数据进行t检验，比较组间差异的显著性。
表1．化合物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(n=10,x±s)化合物肿胀度(1mg) 化合物肿胀度(mg)CMC-Na 11.31±3.23# Ⅰ49.97±2.39DC-Na7.30±2.10*Ⅰ57.32±2.30*Nitrofenac 8.67±3.56 Ⅱ110.64±1.65#Ⅰ18.74±1.20 Ⅱ27.25 ± 1.86**Ⅰ29.91±2.87 Ⅱ39.55±0.74*Ⅰ39.00±3.61 Ⅳ16.31±1.45*与CMC-Na相比，*P＜0.05,#P＜0.01与DC-Na相比，#P＜0.05由表1可见，化合物Nitrofenac,Ⅰ1,Ⅰ2,Ⅰ3,Ⅰ4,Ⅰ5,Ⅱ2,Ⅱ3和Ⅳ1抗炎活性与DC-Na相当，无显著性差异(P＞0.05)。1.2对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响实验方法见Cirino G,Peers SH,Flower RJ,et al.Human recombinantlipocortin 1 has acute local anti-inflammatory properties in the rat pawedema test.Proc Natl Acad Sci USA,1989,86:3428。
选择活性化合物Ⅰ1,Ⅰ2,Ⅰ3,Ⅰ4,Ⅰ5,Ⅱ2,Ⅳ1和Nitrofenac作为受试物，并均用0.5％ CMC-Na配成3.14×l0-3mol/L的混悬液，与DC-Na等摩尔浓度。油状物则先加入药液总体积5％的二甲基亚砜，再加入总体积95％的0.5％ CMC-Na，充分混匀，DC-Na给药剂量设定为10mg/kg，此剂量由人用剂量换算而来。每组10只大鼠，实验前禁食18-22小时，但不禁水。对大鼠灌胃给药，给药体积为1ml/100g。给药30分钟后，向大鼠右后足跖腱膜下注射1％角叉菜胶(灭菌生理盐水配制)0.1ml，测定致炎前和致炎后1,2,3,4,5小时大鼠右后足跖体积，以其致炎前后的足跖体积差值为肿胀程度，进行t检验，比较组间差异的显著性。
注射角叉菜胶致炎后的5小时内大鼠右后足跖容积明显增加。预先给予DC-Na，能够显著降低足跖容积的增加量。与CMC-Na组相比，Ⅳ1在2小时、3小时和4小时点明显减轻了足肿胀度(2小时点P＜0.001；3、4小时点P＜0.05)，尤其在2小时点，Ⅳ1的抗炎作用强于DC-Na(P＜0.01)。与CMC-Na组相比，Nitrofenac在3小时点(P＜0.01)和4、5小时点有显著差异(P＜0.05)；Ⅰ4在3、4小时点有显著差异(P＜0.05)；Ⅰ5在4小时点有显著差异(P＜0.01)。Nitrofenac和Ⅰ4、Ⅰ5的抗炎活性与DC-Na相当。Ⅱ2在5小时点的抗炎作用明显强于DC-Na(P＜0.05)。2．对大鼠胃肠道的影响实验方法参照徐叔云，卞如濂，陈修主编的《药理实验方法学》第二版，北京人民卫生出版社，1991。
选择化合物Ⅰ4,Ⅰ5,Ⅱ2,Ⅳ1和Nitrofenac作为受试物。给药剂量及药物配制同1.2。每组8只大鼠(DC-Na组11只)，连续灌胃给药7天，测定给药前和给药末期体重的变化，于末次给药后观察并比较药物对大鼠胃肠道的影响。
所有大鼠禁食12小时后，摘眼球取血测定血液学指标(红细胞计数、血红蛋白含量)，用颈椎脱臼法处死大鼠，立即打开腹腔，从直肠收集粪便按试剂盒法进行隐血试验，并取出胃肠道，纵向剖开进行肉眼观察，综合评价动物胃肠道出血情况。2.1对大鼠体重的影响表2．化合物对大鼠体重的影响化合物 初期体重(g)末期体重(g)CMC-Na203.88±16.62 227.57±24.60DC-Na 201.67±19.99 191.00±17.49*Nitrofenac 208.63±14.72 211.14±10.30Ⅰ4196.57± 9.76 210.12±15.20Ⅰ5200.88±17.98 217.00±25.33Ⅱ2197.12±19.00 210.00±23.92Ⅳ1201.50±14.74 213.12±15.66与CMC-Na相比，*P＜0.05由表2可见，DC-Na组大鼠在给药末期体重明显降低(P＜0.05)，而其它所有化合物组大鼠的体重与给药前相比均无显著差异(P＞0.05)。2.2大鼠胃肠道的解剖学观察表3．化合物对大鼠胃肠道的影响化合物给药期间动物存活动物胃肠道死亡率 评价等级CMC-Na 0/8 0DC-Na 5/11 3Nitrofenac 1/8 2Ⅰ40/8 1Ⅰ50/8 1Ⅱ20/8 0Ⅳ10/8 00级无溃疡1级粘膜表面糜烂2级深部溃疡或腔面弥漫性坏死3级溃疡穿孔由表3可见，DC-Na组有5只大鼠死亡，Nitrofenac组1只大鼠死亡，其他组均未见死亡现象。由胃肠道评分值可知，Ⅰ4、Ⅰ5、Ⅱ2、Ⅳ1组大鼠的胃肠道副作用均小于DC-Na组和Nitrofenac组。2.3隐血试验实验采用改良的Pyramidon滤纸法进行。
隐血试剂盒Fecal OB-Ⅱ购自Baso Diagnostic Inc.
表4隐血试验结果CMC-Na NitrofenacⅠ4Ⅰ5Ⅱ2Ⅳ1平均分 814.00 11.25 11.38 11.75 9.88Gradit 1.0 2.1667 1.7083 1.7292 1.7917 1.4792Ridit0.5 1.0833 0.8542 0.8646 0.8958 0.7396显著性检验 1.0 2.78**1.551.61 1.790.90与CMC-Na相比，**P＜0.01由表4可见，除Nitrofenac组外，所有受试化合物组与CMC-Na组相比均无显著性差异(P＞0.05)。2.4血液学指标表5．化合物对大鼠血液学指标的影响化合物红细胞计数(×1012/L)血红蛋白含量(g/L)CMC-Na7.77±0.706#131.33±9.83##Nitrofenac 6.93±0.538*113.71±6.52**Ⅰ47.44±0.840 129.38±9.13##Ⅰ57.85±1.047 130.62±11.88##Ⅱ29.00±0.837###144.20±6.18###Ⅳ18.46±0.864##142.86±8.40###与CMC-Na相比，*P＜0.05,**P＜0.01,与Nitrofenac相比，#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001由表5可见，受试化合物Ⅰ4,Ⅰ5,Ⅱ2和Ⅳ1组大鼠的血红蛋白含量以及Ⅱ2和Ⅳ1组大鼠的红细胞计数较Nitrofenac高，提示Ⅰ4,Ⅰ5,Ⅱ2和Ⅳ1组大鼠的失血情况较轻。3．NO体内释放研究实验按试剂盒方法—硝酸还原酶法进行。
NO试剂盒购自南京聚力生物医学工程研究所。
选择化合物Ⅰ4,Ⅰ5,Ⅱ2,Ⅳ1和Nitrofenac作为受试物。其给药剂量、方式及药液配制同1.2，测定大鼠血清中NO的含量。
表6．大鼠血清中NO含量(μmol/L)测定结果(n=6,x±s)化合物 1小时 3小时CMC-Na 18.63±8.07###15.93±5.80###Nitrofenac 54.08±6.05***49.77±9.91***Ⅰ425.94±6.52###28.72±9.75*##Ⅰ529.62±11.74##28.89±7.08**##Ⅱ227.24±8.21###27.78±2.75**###
Ⅳ128.87±8.75###51.77±23.25**与CMC-Na相比，**P＜0.01,***P＜0.001与Nitrofenac相比，#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001由表6可见，与CMC-Na相比，Nitrofenac在1小时和3小时NO释放量明显增加(P＜0.001)，化合物Ⅰ4、Ⅰ5、Ⅱ2在3小时点NO释放量明显增加。Ⅳ1在3小时点的NO释放量与Nitrofenac相当(P＞0.05)。
以下为本发明化合物的实施例，这些实施例并不意味着对本发明的限制。
权利要求
1．通式Ⅰ化合物 其中R1代表O,NH；R2代表-(CH2)n-,n=3-5；CH2C≡CCH2；CH2CH(CH3)CH2CH2；CH2CH2OCH2CH2；-PhCH2-(m,p)。
2．通式Ⅱ化合物 其中R3代表-PhCH2-(o,m,p)；-Ph-(m,p)。
3．通式Ⅲ化合物 其中R3代表-PhCH2-(o,m,p)；-Ph-(m,p)。
4．通式Ⅳ化合物
5．权利要求1的通式Ⅰ化合物制备方法，其特征在于双氯芬酸钠(DC-Na)与卤代醇反应后再与取代的呋咱氮氧化物缩合，或者双氯芬酸(DC)与含羟基或氨基的呋咱氮氧化物(Ⅰp)在二环己基碳酰亚胺(DCC)存在下缩合， 其中R1代表OH,NH2；R2代表-(CH2)n-,n=3-5；CH2C-≡CCH2；CH2CH(CH3)CH2CH2；CH2CH2OCH2CH2；-PhCH2-(m,p)。
6．权利要求2的通式Ⅱ化合物制备方法，其特征在于DC与含羟基的呋咱氮氧化物(Ⅱp)在DCC存在下缩合， 其中R3代表-PhCH2-(o,m,p)；-Ph-(m,p)。
7．权利要求3的通式Ⅲ化合物制备方法，其特征在于DC与含羟基的呋咱氮氧化物(Ⅲp)在DCC存在下缩合， 其中R3代表-PhCH2-(o,m,p)；-Ph-(m,p)。
8．权利要求4的通式Ⅳ化合物制备方法，其特征在于DC与硝氧甲基酚(Ⅳp)在DCC存在下缩合，
9．权利要求1-4中的通式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ化合物用于制备抗炎、镇痛药。
全文摘要
本发明涉及取代的呋咱和硝氧甲基苯酚通过连接基团,以酯键或酰胺键分别与双氯芬酸(DC)相偶联而成的一氧化氮供体型非甾体抗炎药(NO－DC),它们在体内释放一氧化氮,显示和临床应用的双氯芬酸钠(DC－Na)相当或增强的抗炎活性,但胃肠道副作用显著小于DC－Na,且小于专利报道的硝酸酯类NO－DC,因此具有更高的安全性和更广泛的应用。
文档编号C07D271/00GK1305997SQ01108030
公开日2001年8月1日 申请日期2001年1月8日 优先权日2001年1月8日
发明者张奕华, 李瑞文, 季晖, 于晓琳 申请人:中国药科大学