专利名称：大蒜中总氨基酸及其他盐基性物质的提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从大蒜中提取总氨基酸(其中包括大量含硫氨基酸和一般氨基酸)以及其他盐基性物质的总部位的制备方法。
背景技术：
大蒜为百合科植物，学名Allium salivum，其磷茎自古以来即为我国人民药食两用、现代医学证明大蒜具有抗血栓、抑制血小板凝集、抑制人体内胆固醇合成、抗炎菌、抗病毒以及肿瘤化学预防的作用(WHO monographs on selectedmedicinal plants vol.1，P.16-32，World Health Organization，Geneva)(联邦德国卫生局Bundesgesundheitsamt Deutschland.E委员会Commission E monographsP.134July 06.1988)而这些保健和治疗作用均与其中的含硫化合物密切相关(A.Kamel and M.SalehStudies in Natural Products Chem.Vol 23.P 455-485.Atta-ur-Rahman主编2000，Elsevier)。
大蒜中的含硫化合物包括半胱氨酸及其衍生物(甲基半胱氨酸，S-1-烯丙基半胱氨酸，S-2-烯丙基半胱氨酸，丙基半胱氨酸，甲硫氨酸以及它们的氧化型亚砜类化合物Sulfoxide)以及这些氨基酸组成的二肽类；这些含硫氨基酸及肽在大蒜中存在的酶(包括各种肽水解酶、肽转化酶，特别是γ-谷氨酸肽转化酶，过氧化氢氧化酶，蒜氨酸酶等)的作用下可转化成大蒜辣素Allicim，由于大蒜辣素化学性质不稳定，又可以进一步反应生成Ajoene类，dithiine类，硫醚类等多种类型的化合物。
早期国内外对大蒜的开发主要集中提供含硫挥发油类，即大蒜辣素及其进一步反应产物。近十多年来则更重视其中高含量的含硫氨基酸。诸如大蒜原生药粉的开发，特别是用冷冻干燥生产，以保持高含量含硫氨基酸的脱臭大蒜粉的口服制剂以作为保健品和药品。
由于上述含硫氨基酸系多种同类型化合物共同存在，以及它们化学上的不稳定性。使药效工作者很难得到高纯度样品进行生物测试。因此上述这些药效究属何种化合物产生，它们的药理效价、构效关系，相互的协同作用…等问题，很多目前尚不完全清楚，加上当前国际国内对植物药(中药)疗效的认识大部分倾向于认为是多种化学成份共同作用的结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从大蒜中提取其中总含硫氨基酸包括一般氨基酸及盐基性物质的混合部位的方法。
本发明为提供系统技术用于生产包括大蒜总氨基酸及其它盐基性成份的部位用于生产各种口服的保健品和治疗剂，并可再经精制用于生产注射或静脉滴注用。
本工艺所用大蒜原料可为新鲜大蒜、干大蒜片，得率可因生药原料的产地和探收时间存放条件的不同而不同，一般新鲜大蒜生产得率为2-4％，干大蒜片生产得率为3-5％。
本发明提供的制备技术包括下列步骤1、抑制酶活性(a))鲜大蒜原料于150℃烘烤30分钟使各种酶失活。
(b)鲜大蒜原料浸入沸水中或隔水蒸煮，保持沸腾30分钟至45分钟，以保证各种酶完全失活。
2、脱脂经抑制酶活性后的大蒜加适量水搅碎，以氯仿脱脂，以除去脂溶性物质部分，本工艺脱脂可用卤代烷、C1-C5低级酯、C1-C5低级醚等有机溶剂如石油醚，氯仿，四氯化碳，二氯甲烷，二氯乙烷，乙酸乙酯，乙酸丁酯，甲乙酮，乙醚、苯或甲苯等。
3、提取经脱脂后的大蒜液的提取剂为水，或含水甲醇、含水乙醇、含水丙醇等含水水溶性溶剂加入溶剂约10-20倍量，温浸提取2小时，过滤，滤渣重复提取一次，合并提取液，提取用醇浓度可为50-90％。
4、溶剂沉淀和膜处理经水或含水醇提取所得溶液用3千-5万分子量的膜超滤，收集滤过液(3千-5万分子量的膜可以是集束中空纤维膜，平板膜，卷式膜和陶瓷膜等)除去截留的高分子物质。
5、离子交换上述处理液通过聚苯乙烯型大孔磺酸型离子交换树脂，例如D001、HD-82、D061、S-9等强阳性离子交换树脂使氨基酸、生物胺等活性物质吸着于树脂上，再用水或50％醇洗柱，洗去糖类，皂类，酚类物质等非氨基酸类的中性或酸性物质，洗净的树脂柱以1-5％氨水或氨性乙醇洗脱，至洗脱液呈现碱性，直至茚三酮定性反应为阴性，减压浓缩至1/3体积，除去过量的氨水。
6、活性炭吸附加适量活性炭以进一步除去色素类物质，过滤，滤液再以水或50％乙醇洗，减压浓缩至小体积喷雾干燥，即为本有效部位，为微黄色粉末。
7、精制如作为注射剂或静脉滴注用，应进一步精制，并除去其中的热源及蛋白质，方法为重复一次离子交换处理及再经一次膜过滤，具体方法同上。
产品中包括的化学成份有(1)含硫氨基酸半胱氨酸Cysteine，甲基半胱氨酸S-methyl cysteine(SMC)，硫-1-烯丙基半胱氨酸S-1-propenyl cysteine，硫-2-丙烯基半胱氨酸，S-2-propenyl cysteine(即S-丙烯基半胱氨酸S-allyl cysteine简称SAC)，硫丙基半氨酸S-propanyl cysteine，甲硫氨酸Metheonine以及它们的亚砜类，诸如硫-2-烯丙基半胱氨酸亚砜(蒜氨酸Alliin)，硫-1-烯丙基半胱氨酸亚砜(即异蒜氨酸isoalliin)甲硫氨酸亚砜Methiin环蒜氨酸cycloalliin等。
(2)普通氨基酸甘氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、门冬氨酸、赖氨酸、乌氨酸、丝氨酸、蛋氨酸以及上述这些氨基酸(特别是谷氨酸与上述含硫氨基酸)构成的二肽，上述含硫氨基酸及肽的相对含量可因大蒜原料的不同产地，采集时间，存放条件及时间的不同而有所不同(见表1)。
此外本部位中定性使知还含有少量的大蒜辣素及其降解产物，微量的硒氨基酸及其降解产物，生物胺类化合物。
本品为淡黄色固体，易溶于水，甲醇及含水乙醇，难溶于三氯甲烷、四氯化碳、二氯甲烷，乙酸乙酯，乙酸丁酯，甲乙酮，乙醚，石油醚等有机溶剂中按本品编号Ex-A 040224产品的分析数据。
氨基酸分析报告游离 22.93mg/10ml
用氨基酸自动分析仪测定普通氨基酸含量游离氨基酸含量36.30％水解氨基酸含量76.35％蒜氨酸含量参照美国药典USP25版(2004年)Official Monographys P.2550Garlic项下Content of alliin规定的方法测定对照样品为按常规方法合成的蒜氨酸经反复纯化测定蒜氨酸含量为8.6％。
用本工艺生产保健品可用鲜大蒜或干大蒜片生产药品，要求选用特定产地和贮藏方法的大蒜原料以保证50％以上化学成份清楚、恒定和可控，用于生产针剂除选用特定产地和贮藏方法的优质大蒜原料，并需将口服制剂原料进一步纯化，特别是膜过滤纯化以达到80％以上化学成份，清楚、恒定、可控，除去其中的热原和蛋白质，并符合国家规定的指纹图谱规范要求。
图1是提取出的产品氨基酸指纹图谱。
图2是蒜氨酸的HPLC图。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不限制本发明。
实施例(一)当年去皮500克大蒜鳞茎瓣，投入到2500毫升水中煮沸三十分钟，杀大蒜生物酶，在此期间保持大蒜的完整。杀酶完成后从水中捞出，自然冷却到室温。将杀过酶的大蒜瓣粉碎并加入二倍量的三氯甲烷或二氯甲烷同时搅拌十分钟，完成后，使渣、液分离，液体部分用液-液分离器分出水层，把大蒜组织和水层部分再用三氯甲烷或二氯乙烷脱脂一次。脱脂的大蒜和水被加入15倍水，加热浸提2小时，温度控制在40～70度之间，提取结束后，用抽滤法使渣液分离，收集浸提液。渣重新加15倍量水再以上法浸提一次，渣液分离，合并两次浸提液。浸提液先用0.1微米膜滤去浸提液中的微粒，然后再用3千或五千分子量超滤膜超滤，超滤温度控制在25度左右，压力控制在2～3kg。收集通过液。通过液减压浓缩，浓缩温度控制在50度，浓缩到2000毫升体积时放出自然冷却至室温。
上述浓缩液通过D001离子交换树脂，树脂用量为500毫升，树脂在被使用前要清洗并处理成氢型。料液以每分钟30毫升左右的流速通过。通完料液后，树脂用两倍柱床体积的去离子水清洗残液，再用两倍柱床体积的50％乙醇洗去可能被树脂吸附的醣类，糖苷类物质。随后以1％氨水洗脱，直至洗脱液用茚三酮作定性反应呈阴性。洗脱液合并减压浓缩，浓缩至250毫升左右除去溶液中多余的氨水。浓缩液加入适量颗粒活性炭，搅拌30分钟，静止3小时以上，用0.45微米尼龙膜过滤，滤液减压浓缩至干，得微黄色大蒜有效部位20.3克。经含量分析，其中蒜氨酸含量为8.6％。氨基酸含量大于80％。
实施例(二)隔年去皮大蒜鳞茎瓣500克，隔水蒸煮三十分钟杀生物酶，杀酶完成后自然冷却到室温。将杀过酶的大蒜瓣粉碎并加入二倍量的甲乙酮或乙酸乙酯浸泡搅拌10分钟，静止过夜脱脂。第二天使渣液分离，液体部分用液-液分离器分除甲乙酮或乙酸乙酯，把大蒜组织和水液部分再用甲乙酮或乙酸乙酯脱脂一次。脱脂后的大蒜加入15倍50％甲醇回流提取2次，每次2小时，提取结束后，使液渣分离，收集提取液。合并两次提取液减压浓缩，浓缩至含醇量小于10％。浓缩液先用0.1微米膜滤去提取液中的微粒，再用一万或三万分子量超滤膜超滤，超滤温度控制在25度，压力控制在2kg左右。收集通过液。通过液合并减压浓缩，浓缩温度控制在50度，浓缩到2000毫升时放出自然冷却至室温。
上述浓缩液通过HD-82离子交换树脂，树脂用量为500毫升，料液以每分钟30毫升左右的流速通过。料液通过后，树脂用两倍柱床体积的去离子水洗去残液，再用两倍柱床体积的50％乙醇洗去可能被树脂吸附的醣类，糖苷类物质。随后以5％氨性乙醇洗脱，直至洗脱液用茚三酮作定性反应呈阴性，洗脱液合并减压浓缩，浓缩至250毫升左右，除去溶液中多余的氨水后，在浓缩液中适量加入颗粒活性炭，搅拌30分钟，静止3小时以上，用0.45微米尼龙膜过滤，滤液减压浓缩至干，得微黄色大蒜有效部位11.7克。经含量分析，其中蒜氨酸含量为5.1％，氨基酸含量大于80％。
实施例(三)当年去皮大蒜鳞茎瓣500克，置于150度烤箱内30分钟杀酶，待冷却至室温后，投入到二倍量二氯乙烷或四氯化碳中，粉碎并沸腾回流30分钟，脱脂，回流后用真空过滤去除二氯乙烷或四氯化碳，用液-液分离器分出水层，同法操作二次。对脱脂后的大蒜和分出的水层加入15倍30％丙醇，热浸提4小时，温度在60度左右，提取结束后，离心渣液分离，收集提取液。渣中新加15倍30％丙醇再以上法抽提一次，渣液分离。合并两次提取液减压浓缩，温度控制在50度左右，浓缩到含醇量小于10％止，静置冷却到室温。接着用0.1微米膜滤去浓缩液中的微粒，然后再用五万分子量超滤膜超滤，超滤温度控制在25度，压力控制在2～3kg。收集通过液。通过液减压浓缩，浓缩温度控制在50度，浓缩到400毫升体积时放出自然冷却至室温。
上述浓缩液通过强酸性苯乙烯系D061阳离子交换树脂，树脂用量为500毫升，树脂在通入料液前被处理为氢型，料液以每分钟30毫升左右的流速通过。料液通过后，树脂用两倍柱床体积的去离子水洗去残液，再用两倍柱床体积的50％乙醇洗去可能被树脂吸附的醣类，糖苷类物质。随后以5％氨水洗脱，直至洗脱液用茚三酮作定性反应呈阴性，洗脱液合并减压浓缩，浓缩至1升左右以除去溶液中多余的氨水。浓缩液加入适量颗粒活性炭，搅拌30分钟，静止3小时以上，用0.45微米尼龙膜过滤，滤液减压浓缩至干，得微黄色大蒜有效部位13.1克。经高效液相色谱分析，其中蒜氨酸含量为5.7％，总氨基酸含量大于80％。
实施例(四)大蒜鳞茎干片1000克，加20倍量50％乙醇粉碎并回流二小时，提取，回流结束，离心分离液渣，渣加15倍量50％乙醇再回流一次，渣液分离。提取液真空浓缩，温度控制在50度，浓缩到4升左右此时几乎不含醇，自然冷却到室温。冷却液以每次500毫升乙酸丁酯或乙醚等有机溶剂萃取二次，脱脂。脱过脂的水液进一步减压浓缩到小体积，约1000毫升时趁热加入2000毫升95％乙醇或异丙醇，醇沉，放置过夜，取上轻液，减压浓缩，浓缩温度控制在50度，浓缩到1000毫升时放出自然冷却至室温。
上述浓缩液通过S-9离子交换树脂，树脂用量为1000毫升，树脂在通入料液前被处理为氢型，料液以每分钟30毫升左右的流速通过。料液通过后，树脂用两倍柱床体积的去离子水洗去残液，再用两倍柱床体积的50％乙醇洗去可能被树脂吸附的醣类，糖苷类物质。随后以3％氨水洗脱，直至洗脱液用茚三酮作定性反应呈阴性，洗脱液合并减压浓缩，浓缩至1升左右以除去溶液中多余的氨水。浓缩液中加入颗粒活性炭适量，搅拌30分钟，静止3小时以上，用0.45微米尼龙膜过滤，滤液减压浓缩至干，得微黄或浅棕色大蒜有效部位51.6克。经高效液相色谱分析，其中蒜氨酸含量为6.2％，总氨基酸含量大于80％。
权利要求
1.一种从大蒜中提取制备总氨基酸及其他盐基性物质的提取工艺包括a、生物酶失活；b、脱脂；c、用水或含水有机溶剂提取；d、膜超滤；e、强阳离子树脂富集；f、活性炭脱色；g、精制。
2.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于运用烘烤，烫煮，蒸煮的工序使大蒜中的诸种生物酶失活。
3.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于大蒜脱脂溶剂采用卤代烷烃、甲乙酮、乙酸乙酯、乙醚、苯或甲苯。
4.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于提取大蒜总氨基酸及盐基性物质的提取剂为水或含水甲醇、含水乙醇、含水丙醇含水水溶性溶剂。
5.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于膜超滤采用三千分子量到五万分子量的超滤膜。
6.根据权利要求1所述的提取工艺，其特征在于离子交换树脂是聚苯乙烯型大孔磺酸型离子交换树脂。
7.根据权利要求6所述的提取工艺，其特征在于聚苯乙烯型大孔磺酸型离子交换树脂为D001、HD-82、D061、S-9等强阳性离子交换树脂。
全文摘要
本发明涉及提取制备大蒜的有效部位，即包括多种大蒜含硫氨酸以及它们的二肽类，其制备过程包括(1)失活各种酶，(2)脱脂，(3)抽提，(4)沉淀或超滤，(5)离子交换富集，(6)脱色，(7)再精制各步骤。本工艺生产的产品，得率2－4％总氨基酸含量80％以上蒜氨酸含量5－10％以上以用于制作保健品药品口服及注射剂。
文档编号C07C323/58GK1775741SQ20041006815
公开日2006年5月24日 申请日期2004年11月15日 优先权日2004年11月15日
发明者陈仲良, 殷梦龙, 丁一政 申请人:上海南和药物保健有限公司