专利名称：：秦艽环烯醚萜苷提取方法
技术领域：
：本发明为中药提取的方法，主要涉及中药有效组分提取的方法，尤其涉及秦艽环烯醚萜苷的提取方法。
背景技术：
：秦艽本品为龙胆科植物秦艽/^cra/7//flPall.、麻花秦艽欲a附z'weaMaxin.、粗茎秦艽C7ms7.c(3幽DuthieexBurk或小秦艽Cewria"a^/mWc"Fisch的干燥根。前三种按性状不同分别习称"秦艽"和"麻花艽"，后一种习称"小秦艽"。春、秋二季采挖.除去泥沙；秦艽及麻化艽晒软。堆置"发汗"至表面呈红黄色或灰黄色时，摊开晒干，或下经"发汗"直接晒干；小秦艽趁鲜时搓去黑皮，晒干。主要分布于西南、西北、华北、内蒙。麻花艽分布于青海、甘肃、西藏、四川及宁夏，湖北西部亦有分布。秦艽性味苦、辛，微寒，归胃、肝、胆经，祛风湿，舒筋络，善退黄疸，兼能通便。《本草纲目》称其为手足阳明经药，兼入肝胆，可治"手足不遂、黄疸、烦渴之病"，"取其去阳明之湿热"。《药性论》称秦艽"利大小便"。研究表明，秦艽中的龙胆苦苷能抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀、醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增加，对抗酵母多糖A、角叉菜胶所致的大鼠足跖肿胀，并有一定的剂量依赖关系。秦艽的免疫药理作用结果表明，秦艽能明显降低小鼠的胸腺指数，并能明显抑制SRBC所致的小鼠DTH。目前，临床上已广泛用于病毒性疾病、神经性疾病、呼吸道疾病、心脑血管疾病及其他疾病的治疗，并取得满意疗效。秦艽中主要含环烯醚萜苷类化合物。此外还有糖类、挥发油等现有的秦艽环烯醚萜苷提取方法，一般采用水提取，浓縮，干躁，即得，这种方法提取的环烯醚萜苷含量低，用本发明可以克服此缺点。
发明内容本发明的目的是提供一种秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，是以水加热回流提取秦艽，经乙醇醇沉，滤过，滤液浓縮后，吸附到大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓縮、干燥，获得纯化的秦艽环烯醚萜苷。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，将秦艽以以水加热回流提取1~4次，最优选为3次。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，每次提取秦艽质量与水的体积比为1~14倍，优选提取体积为412倍，最优选提取体积为8倍。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，每次提取的时间为0.52h，最优选时间为1.5h。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，将秦艽提取液浓縮后以80%乙醇醇沉。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，大孔树脂选用日本三菱公司HP20、SP825、SP850、SP700、SP70，优选大孔树脂SP825、SP700、SP70，最优选SP70。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，秦艽提取液的上样量(秦艽质量树脂体积)为0.5:18:1，优选1:1~4:1，最优选1.5:1。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，洗脱流速为洗脱液流速为lBV/h5BV/h，最优选为2BV/h。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，洗脱剂乙醇溶液的洗脱浓度为5%至95%，最佳的洗脱浓度为5%至40%。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，大孔树脂洗脱剂的洗脱体积为110倍柱体积，最佳洗脱体积为5倍柱体积。本发明提供的秦艽环烯醚萜苷大孔树脂纯化方法，获得纯化的秦艽环烯醚萜苷含量大于55%。本发明具有以下优点-1、本发明涉及的秦艽环烯醚萜苷树脂纯化的方法是一种操作简便、快捷的方法。2、所选用的大孔树脂具有吸附量大，解吸率大的特点。3、本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。4、用本发明方法纯化秦艽提取物，环烯醚萜苷含量可达55%以上，且重现性好，树脂可重复使用。图1.秦艽静态吸附与解吸率曲线图2.秦艽动态吸附泄漏曲线图3.秦艽动态解吸曲线图4秦艽比上柱量曲线图5.秦艽洗脱终点曲线具体实施例方式本发明将结合具体实施例作进一步说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。说明秦艽环烯醚萜苷含量测定方法①仪器与试药仪器北京普析通用仪器有限公司TU-1卯1型紫外可见分光光度仪，联想数字处理中心。日本岛津LIBRORAEL-200万分之一电子分析天平，上海亚荣2000A型旋转蒸发仪，日本三菱公司SP70、SP700、SP825、SP850、HP20型大孔树脂。试药龙胆苦苷对照品(供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号110770-200409)，使用前置五氧化二磷减压干燥器中干燥24小时，使之恒重。水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。②检测波长274nm，空白对照甲醇。③对照品溶液的制备精密称取龙胆苦苷对照品10.2mg，置25ml量瓶中，以水溶解并稀释至刻度，摇匀。即得对龙胆苦苷照品溶液。④工作曲线制作精确量取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0ml置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。于274nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，龙胆苦苷对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程为Y=18.939X+0.0155，R2=0.9999。龙胆苦苷浓度在4.0881.60|iig/ml范围内呈线性关系。⑤供试品溶液的制备取秦艽提取物适量，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，再精密移取1.0ml至25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。(D含量测定取样品溶液置274nm处测定吸光度，记录吸光度值，代入工作曲线计算环烯醚萜苷含量。实施例l本发明的一种纯化方法(l)秦艽水提醇沉秦艽以8倍体积水加热回流提取三次，每次1.5h，合并三次滤液，减压浓縮至比重为1.11-1.15(50-60°C)，加95%乙醇使醇浓度至80%，静置过夜。醇沉液减压浓縮至无醇味后加水稀释使溶液体积达到生药重量的2倍，过滤，备用。(2)上柱将秦艽提取液上柱，控制流出液流速为0.5BV/h，上样量为药材重量树脂体积为1.5:1，至提取液全部进入树脂床。(3)洗脱以5BV体积的5%乙醇冲洗树脂床，控制流出液流速为2BV/h，以除去杂质。然后以5BV体积的40%乙醇，控制流速为2BV/h，收集洗脱液，减压浓缩至一定体积，进行喷雾干燥，即得纯化产物。实施例2选用不同条件进行水提醇沉采用本发明提供的方法，选用不同条件进行秦艽环烯醚萜苷提取实验。表1秦充水提工艺因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注以D因素为误差项①选定加水量(A),煎煮时间(B),提取次数(C)为影响因素,每个因素三个水平，设计三因素三水平的正交试验，见表l。称取秦艽药材10g，共9份，每份提取后滤液合并，减压浓縮至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，移取1.0ml至10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定有效组分的含量，结果见表2。方差分析结果见表3。表3秦艽水提工艺正交试验方差分析表方差来源离差平方和自由度方差F值显著性A0.00520.003151.755B0.02820.014829.550***C0.05020.0251493.337*氺承误差0扁03320細017*:F010(2,2)=9.00**:F0.o5(2.2)=19.00F0.oi(2,2):=99.00结果方差分析结果表明以提取有效组分量为指标，3个因素均有极显著性差异。加水最对提取物总量影响最小，从时效因素考虑，选定其工艺为A!B3Q，即加8倍量水回流3次，每次90分钟。结论选择加8倍量水回流3次，每次卯分钟。②验证秦艽优选水提工艺称取秦艽药材20g，加8倍水煎煮3次，每次90分钟，滤过，滤液合并，减压浓縮至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，移取1.0ml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，重复3次。另取秦艽药材20g，加入12倍水煎煮3次，每次90分钟，滤过，滤液合并，减压浓縮至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度,摇匀，移取1.0ml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀重复3次。按上述方法测定有效组分的含量，结果见表4。表4验证秦艽水提工艺结果实验次数123平均A^3C3有效组分含量(％)A3B3C3有效组分含量(％)8.2308.7048.2008.6478.2478.6298.2268.694结果从表4可以看出，A3B3C3比A,B3C3只高约5.0。/。,从热能消耗、生产时效等方面考虑，选择A,B3C3，且具有良好的重现性。结论优选水提工艺具有良好的重现性。③秦艽醇沉正交试验为了进一步提高有效成分的含量和纯度，需将秦艽水提浸膏醇沉。选定浓縮液比重(A)，乙醇浓度(B)为影响因素，设计二因素三水平正交试验，见表5。取400g秦艽药材，按上述方法提取，将提取液合并，平均分成10份(每份40g生药)，取其中3份减压浓縮到比重为1.21-1.25(50-60。C)，其中3份浓缩至比重为U6-1.20(50-60°C)，其中3份减压浓縮至比重为1.11-1.15(50-60°0。相同比重浓縮液分别加95%乙醇使醇浓度至60%、70%、80%，静置过夜，滤过，滤液分别减压浓縮至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml量瓶中，稀释至刻度并摇匀，再移取1.0ml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定其中有效组分含量。结果见表6、7。表5秦艽醇沉正交试验因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果由表可知，醇沉最佳工艺为A,B3，即浓縮至比重为1.11-1.15(50-60°C)，醇沉浓度为80%。结论选择浓缩至比重为Ul-U5(50-60°C)，醇沉浓度为80%。④验证优选醇沉工艺称取秦艽药材40g，加入8倍水煎煮3次，每次90分钟，滤过，滤液合并，减压浓縮至比重为1.114(55°C)，加入95%乙醇使醇浓度至80°/。，搅匀，静置过夜，滤过，减压浓縮至干，精密称取干膏适量，以水溶于10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，再移取l.Oml至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。按上述方法测定其中有效组分含量。结果见表8。表8秦艽验证优选醇沉工艺结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果从表8可以看出，优选醇提工艺具有良好的重现性。结论优选醇提工艺具有良好的重现性。实施例3确定大孔树脂提取最佳工艺选取树脂种类、药液浓度、吸附速率、上样量、乙醇洗脱浓度、洗脱速率、洗脱终点6因素分别进行单因素试验，确定各因素的最佳值。。上柱液制备称取秦艽药材500g，按上述优选提取工艺提取，8倍量水煮三次每次1.5小时，合并滤液，减压浓縮至约150ml，比重为1.241(55°C)，加95%乙醇使醇浓度至80%，搅匀，静置过夜，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，以水稀释至500ml，滤过，上清液备用，测得有效组分含量为37.7mgmr1。②静态吸附取5种处理好的大孔树脂各10g，分别加入秦艽水溶液30ml(有效组分浓度为7.54mg'm1—1)，每5min振摇一次，2h后分别取各树脂吸附后的溶液0.5ml于10ml量瓶中，于274nm处测定吸光度，计算各树脂对秦艽有效组分的吸附率。见表ll、图l。③静态解析将静态吸附的树脂过滤抽干，加30ml40%乙醇解吸，每5min振摇一次，2h后分别取各树脂吸附后的溶液O.lml于10ml量瓶中，按上述方法测定有效组分浓度，计算各树脂对秦艽有效组分的解吸率。见表9、图1。表95种大孔树脂对秦艽有效组分的吸附与解吸附率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表103种大孔树脂对秦艽有效组分动态吸附结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>结果从表9可以看出，5种树脂的吸附率都较大(大于90%)，HP20和SP850的解吸率都较小。因此选取SP70、SP700、SP825三种树脂做以下实验。结论取SP70、SP700、SP825三种树脂做动态吸附试验。改动态吸附取静态吸附优选处理好的3种树脂各15ml于柱内(lcmX13cm)，加秦艽水溶液(有效组分浓度为7.54mg，ml")于柱顶，以0.5BV/h的流速进行动态吸附，按树脂床体积收集流出液，于274nm处测定吸光度，计算有效组分的含量，绘制各树脂的泄漏曲线，结果见表IO、图2。结果从图2可以看出，达到吸附饱和时，SP70和SP825所吸附的有效组分的量最大。结论选取SP70和SP825做动态解吸试验。③动态解吸取处理好的SP70和SP825树脂各20ml于柱内(lcmX13cm)将浓度为7.54mgml"的秦艽水溶液30ml，以0.5BV/h的流速进行吸附后，用40。/。乙醇以2BV/h的流速进行洗脱，按树脂床体积收集洗脱液，测定有效组分的含量，结果见表ll，图3。表11秦艽动态解吸结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果从图3可以看出，SP70较SP825的解吸效果好，因此选择SP70作为最佳树脂。结论:选择SP70树脂。⑥药液浓度考查取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg"mr1)10ml，分别稀释至相当于生药浓度为lg'ml"、0.5g*mr!、0.33g'ml"、0.2g'mr1、0.1g*mr'，加入20ml(lcmX13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后，以40%乙醇洗脱，测定洗脱液有效组分的总量。结果见表12。表12秦艽药液浓度考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>结果从表12可以看出，当药液稀释至5倍(相当于原生药浓度0.2g*mr')时，解析率最高，稀释至2倍与稀释至3倍相当，且比不稀释要高约2%，综合考虑生产时效因素，选择稀释至2倍，即溶液体积生药H=2ml:lg。结论上柱液浓度为溶液体积达到生药重两倍。⑦吸附速率考查取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg，ml—1)10ml，加入20ml(lcmX13cm)SP70树脂上，分别以0.5BV/h、lBV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、的流速进行吸附后，用5BV40。/。乙醇以2BV/h的流速进行洗脱，测定洗脱液有效组分的总量。结果见表13。表13秦艽吸附速率考察结果吸附速率(BVh'1)0.51334洗脱液总有效组分量(mg)3.483.413.333.243.02解吸率(％)92.3190.5288.2685.9880.05结果从表13可看出，当吸附速率为0.5BV'h"时，吸附效果最好。结论:吸附速率为0.5BVh—、⑧上样量考察取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg"mr1)加于20ml(lcmX13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附，按树脂床体积收集流出液，于274nm处测定吸光度，计算有效组分的含量，绘制比上柱量曲线。结果见表14、图4。表14秦艽上样量考察结果树脂床体积(BV)流出液有效组分浓度(mg，ml-l)11.4821.8733.2846.69514.18623.38了25.24结果从图4可以看出，上样量为3倍树脂床体积(BV)时开始泄漏，7倍倍树脂床体积(BV)时达到吸附饱和，因此实际工艺中选择1.5倍树脂床体积(BV)上样量，即生药重(g):树脂体积(ml)=1.5:1。结论上样量为生药重(g):树脂体积(ml)=1.5:1。②洗脱用乙醇浓度考察取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg.ml")50ml,加于100ml(2.5cmX23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附，分别用5BV水、5%、10%、20%、30%、40%、60%、80°/。乙醇以2BV/h流速进行洗脱，测定洗脱液有效组分的总量。结果见表15。表15秦艽乙醇洗脱浓度考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果从表15可以看出，当乙醇浓度为20%-40%时，有效组分的含量最高，因此选择先以20%乙醇洗脱，再以40%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱液。结论选择先以20%乙醇洗脱，再以40%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱液。洗脱速率考察取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg，ml—1)10ml，加于20ml(lcmX13cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后，以40%乙醇洗脱，流速分别为lBV/h、2BV/h、3BV/h、4BV/h、5BV/h、测定洗脱液有效组分的总量。结果见表16。表16秦艽洗脱脱速率考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果从表16可以看出，流速为lBV/h洗脱时解吸率最高，但与2BV/h洗脱相差不大，为提高效率，用2BV/h流速洗脱较优。结论洗脱速率为2BV/h。O洗脱终点考察将吸附饱和的树脂40%乙醇以2BV/h流速进行洗脱，按树脂床体积收集洗脱液(20ml)，测定洗脱液有效组分的总量。结果见表17、图5。表17秦艽洗脱终点测定结果树脂床体积数(BV)1015洗脱液浓度(mgml-l)25.81164.3449.9228.3321.5014.2211.398,983.700.03结果从图5可以看出，当洗脱液用5倍树脂床体积时，已基本将有效组分洗净。结论以5倍树脂床体积的乙醇洗脱。验证优选秦艽大孔树脂提取工艺取秦艽水溶液(有效组分浓度为37.7mg'mr1)150ml，加去离子水稀释至300ml(有效组分浓度为18.85mg'ml")，加于100ml(2.5cmX23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后先以500ml5。/。乙醇2BV速率洗脱，再以500ml40%乙醇2BV速率洗脱，收集40%乙醇洗脱液至500ml,减压浓縮至干，75。C真空干燥，测定有效组分的含量，计算得率，重复3次。结果见表18。表18秦艽总有效组分得率及含量测定结果实验次数123平均干膏重(g)2.4372.4212.3982.419得率(％)1.621.611.601.61有效组分含量(％)79.9680.4080.8080.39结果从表18可以看出，经SP70大孔树脂处理处理过的秦艽水溶液，环烯醚萜苷含量可超过55%，达到80%左右，得率约1.6%，且具有良好的重现性。实施例4SP70大孔树脂反复使用稳定性考察称取秦艽药材lkg，按上述优选水煮及醇沉工艺提取，提取液定容至1000ml。取秦艽水溶液150ml，加水稀释至300ml，加于廳ml(2.5cmX23cm)SP70树脂上，以0.5BV/h的流速进行吸附后先以500ml20%乙醇2BV速率洗脱，再以500ml40%乙醇2BV速率洗脱，收集40%乙醇洗脱液至500ml，再以500ml75%乙醇洗柱，40%乙醇洗脱液减压浓縮至千，75。C真空干燥至恒重，测定有效组分的含量，计算得率，在同一树脂柱上按上述步骤重复5次。结果见表19。表19SP70大孔树脂反复使用5个周期稳定性考察<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>结果从表19可以看出上述树脂工艺在5个周期内产品得率及有效组分含量较稳定，SP70树脂可以反复使用。结论使用SP70树脂产品得率及有效组分含量在5个周期内较稳定。本发明涉及的参考文献1.中华人民共和国药典2005年版(一部).北京化学工业出版社，2005.218，190-192.2.纪兰菊,等.青藏高原原四种龙胆植物化学成分初步研究.高原生物学集刊(11集).北京:科学出版社，1992,1:133.孙文基，等.天然活性成分简明手册.北京:中国医药科技出版社,19982:564.李艳.秦艽中苦味苷的提取工艺研究.西北药学志.2003，18(2):62.5.朱浩，侯世祥，孙毅毅，等.大孔吸附树脂吸附纯化不同中药有效部位特性研究.中国中药杂志,1998,23(10):607.6.毕岳琦,侯世祥,毛生俊,等.不同类型苷类在大孔吸附树脂上的吸附纯化特性研究.中国中药杂志，2003，28(3):217.权利要求1、秦艽环烯醚萜苷提取方法，具体方法是将秦艽水提取，经乙醇醇沉，滤过，滤液，浓缩液吸附到大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得秦艽环烯醚萜苷。2、如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是将秦艽以水加热回流提取14次，最优选为3次。3、如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是每次提取秦艽质量与水的体积比为114倍，优选提取体积为612倍，最优选提取体积为8倍。4、如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是每次提取的时间为0.52小时(h)，最优选时间为1,5h。5、如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是乙醇醇沉的浓度为20%90%，优选60%90%，最优选为80%。6、如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是大孔树脂选用日本三菱公司HP20、SP825、SP850、SP700、SP70，优选大孔树脂SP825、SP700、SP70，最优选SP70。7、如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是秦艽提取液大孔树脂的上样量(秦艽质量树脂体积)为0.5:18:1，优选1:1~4:1，最优选1.5:1。8、如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是大孔树脂洗脱剂为有机醇，优选项为乙醇。9、如权利要求1所述的秦充环烯醚萜苷提取方法，其特征是大孔树脂洗脱液流速为1倍柱体积/小时(BV/h)5BV/h，最优选为2BV/h。10、如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是大孔树脂洗脱剂乙醇溶液的洗脱浓度为5%至95%，最佳的洗脱浓度为5%至40%。11、如权利要求1述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是大孔树脂洗脱剂的洗脱体积为110倍柱体积，最佳的洗脱体积为5倍柱体积。12、如权利要求1所述的秦艽环烯醚萜苷提取方法，其特征是获得纯化的秦艽环烯醚萜苷含量大于55%。全文摘要本发明公开了一种秦艽环烯醚萜苷提取方法，该方法是将秦艽水提取，经乙醇醇沉，滤过，滤液浓缩，浓缩液吸附到大孔树脂上、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得秦艽环烯醚萜苷的方法。本发明涉及的秦艽环烯醚萜苷提取方法是一种操作简便、快捷的方法。所选用的大孔树脂具有吸附量大，解吸率大的特点。本发明方法以乙醇为溶剂，既价廉又无毒。用本发明方法提取秦艽环烯醚萜苷含量可达55％以上，且重现性好，树脂可重复使用。文档编号C07H17/04GK101168552SQ20061013770公开日2008年4月30日申请日期2006年10月27日优先权日2006年10月27日发明者颂郭申请人:颂郭