专利名称：：新型亚胺杯芳烃衍生物和氨基杯芳烃衍生物，其制备方法，由该方法制备的自组装单层...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新型亚胺杯芳烃书f生物，其制备方法，以及由该方法制备的自组装单层，使用该自组装单层固定J氐聚DNA的方法，以及由该方法制备的低聚DNA芯片。本发明更具体涉及一种能够将含有连续鸟嘌呤碱基的低聚DNA通过分子识别固定至^皮璃基底或金基底上单层中的固体基底表面的亚胺杯芳烃化合物以及通过使用自组装单层制备低聚DNA单层(即低聚DNA芯片)的方法。此外，本发明涉及新型氨基杯芳烃々于生物，其制备方法，以及由该方法制备的自组装单层，通过所述自组装单层中低聚DNA的不可逆的，自动分子识别固定4氐聚DNA的方法，以及由该方法制备的低聚DNA芯片。本发明更具体涉及一种能够将含有连续鸟嘌呤碱基的低聚DNA通过多碱基的不可逆/自动分子识别固定至固体基底表面的氨基杯芳烃化合物，一种在如玻璃或金基底等固体基底上将其制备为单层生物芯片基底的#支术以及一种将<氐聚DNA以高密度作为单层固定在由所述制备技术制备的生物芯片基底上从而制备低聚DNA芯片的方法。
背景技术：
：在国家人类基因组研究所和赛雷拉基因公司在人类基因组计划下竟争性探索和研究人类基因组后，人类基因信息图于2000年完成，从而促进了使用DNA功能研究，变异DNA研究，以及其中的信息进行诊断性低聚DNA芯片的开发。该用于探索单核苷多态性(SNP)的低聚DNA可特别被预期用于诊断有缺陷DNA引起的遗传疾病，或处于早期阶-敬的癌症等。此外，纟笨索和^f究用于生产低聚DNA芯片(其中一系列的低聚DNA被固定在基底上)的技术已成为世界范围的趋势，该低聚DNA芯片提供了基于病毒类型的准确病毒感染途径的信息，对于有害或无害等的分析以及基于一组致癌病毒的分型7十癌症等的发生的预测。事实上，可用于测定人乳头瘤病毒(HPV)类型的低聚DNA芯片已经在韩国被韩国食品药品管理局(KFDA)世界上首次审定为用于预测宫颈癌发生可能性的诊断和予贞防医学生物芯片。此外，该i貪断宫颈癌的^氐聚DNA芯片已被KFDA审定，并已才更入^吏用。低聚DNA芯片包含了固定在基底上的15-50mer短DNAs(低聚:DNAs)。因此，尽管用于分析:DNA变体的c-:DNA芯片通常采用简单的物理p及附法，该J氐聚DNA芯片仍然采用几十年前开发的方法，例如基于通过醛和胺之间化学键的亚胺键合法的固定方法；或基于在醛和胺功能基团之间的化学键合后进行还原反应提高键合的胺键合法的固定方法。这是由于目前还未能成功开发出在再现性和1"更利性上优于醛-芯片的生物芯片基底。然而，在醛-芯片基底中，通过合成技术连接至低聚DNA末端的胺功能基团被通过亚胺键连接化学键合至该醛-芯片；因此，在固定DNA数量和可与c-DNA在实际杂交反应中组合的固定低聚DNA的数量的理论最大密度之间存在着巨大的差别。此外，由于受固定条件的重大影响，固定〗氐聚DNA的密度经常变化，因此难以成功开发具有再现性的芯片。—种采用链酶亲和素-生物素的键合方法的技术已得到广泛应用，且所迷的技术是一种制备低聚DNA的方法，其通过将链酶亲和素-生物素通过物理吸附，化合键合等方法固定在固体基底上，然后Y吏该4连酶亲和素-生物素分子识别连^妻了该生物素的^f氐聚DNA的生物素功能基团(Science,1993;Vol.262，pp1706-1708)。然而，该采用化学键合法或链酶亲和素-生物素键合法的技术在性能上仍落后于醛-芯片基底。同时，在蛋白芯片中，抗体的活性位点存在于固定在表面上的蛋白的一个位置上，因此如果仅有能结合抗原的所述位置被定位时则应当能获得结果。然而，在低聚DNA芯片中，至少多数低聚DNAs中的部分石威基必须与在杂交反应中4矣近的c-DNAs相4建合，且该键合石咸基的数量应当通过使该cDNAs尽量接近该低聚DNAs固定的基底得到最大化。为此，2003年的欧洲协会建议在固定低聚DNAs之间^呆留一些空间以允"i午c-DNAs自由进入，现在获得该种空间的技术已成为本领域的热点研究对象。以分子水平固定在表面上的低聚DNAs易于自发组装在一起，因此要将该技术应用于化学键合低聚DNA芯片相对比较困难。相应的，可将20-25-mer便足够的4氐聚DNA的〗氐聚DNA延长至50-mer,/人而侵^妄近的c-DNA无需下落至底部，且提高了杂交反应中键合的石威基数量以重现诊断的结果。然而，要^f吏该结果清晰可读至少需要几个小时到超过一天，因此该技术并不比关于禽流感等分析的传统诊断技术更加出色。
发明内容才支术问题在如化学键合法和链酶亲和素-生物素法等固定低聚DNAs的传统方法中发现了如下问题1.固定密度的均一性化学4建合法是最为广泛使用的方法，且已知在低聚DNAs被固定时，在醛功能基团(-CHO)和胺功能基团(-NH)之间发生了化学反应，从而化学固定了低聚DNAs;在该反应中脱掉了一个H20以使低聚DNA以亚胺键(-C二N-)的形式得到固定。然而，由于该反应发生于水;容'液中，该固定密度并不均一，即，不可复制。此外，该低聚DNA的密度很难维持均一性，因为在水溶液中容易发生亚胺键恢复为原始的功能基团的逆反应。另外，为减少该种逆反应，可采用如NaBH4等还原剂对亚胺4建进行还原反应，但该种还原反应会影响低聚DNAs的键合，从而难以始终保持固定低聚DNAs的长度。由于每次生产结果的不一致性，新型低聚DNA芯片的开发将是一个长期过程，这被看作是低聚DNA芯片生产中的巨大障碍。与此同时，该固定低聚DNA可通过4建合与所述低聚DNA密度成比例连接了荧光物质(例如，Cy-3)的c-:DNAs，然后检测c-DNAs的存在及其浓度以进行i貪断。因此，如果无法持续维持4氐聚DNA的密度，则该^氐聚DNA无法作为商业产品进行生产，鉴于同样原因，许多投入了资金的公司仍未能获得他们预期的结果。[14]2.在j氐聚DNAs之间获4寻空间供c-DNAs进入的必要性(不可能发生超高速杂交反应)病原体的模板基因通过聚合酶链式反应(PCR)扩增的c-DNAs必须最终被连接至4氐聚DNA芯片。然而，如图7所示，如果固定DNAs之间的距离过短，贝'Jc-DNAs无法轻易到达低聚DNAs的下部。目前许多低聚DNA芯片需要数小时到超过一天的杂交反应，这主要是由于缺乏允许c-DNAs轻易接近固定低聚DNAs底部能与之键合的碱基的空间。因此一种在低聚DNAs间获得适当水平的空间的4支术成为一种需要，^旦人们并未对此得到有效的解决方案。为解决这一问题，有必要开发通过连续碱基的表面键合以获得适当水平的空间使c-DNAs能轻易接近DNA芯片的技术。3.功能基团的连接该通过化学键或链酶亲和素-生物素4建合固定低聚DNA的技术仅在将生物素或胺功能基团连接至低聚DNA时才可能存在。然而，在低聚DNA合成后再连接该种功能基团的成本是少量功能基团已被连接的低聚DNA传统合成方法的三到十倍。此外，即使仅固定了几十个低聚DNAs来生产供销售的低聚DNA芯片，仍需要4全测成百上千的样本，且其所需的成本(不计生产终产品的成本)^更需要数百或数百万美元，这成为开发〗氐聚DNA芯片的另一障碍。为减少该种问题，有必要开发一种通过不连接功能基团的低聚DNAs生产低聚DNA芯片的技术。4.与三种石咸基A,C和G连4妻的胺功能基团与醛-芯片基底的功能基团之间的化学键合该醛-芯片基底可生产低聚DNA芯片，其中该低聚DNAs通过表面的醛功能基团和连接了胺功能基团的低聚DNAs的反应进行固定。然而，该胺功能基团已连接至所述的与该低聚DNA连接的众多碱基中占四分之三的三种碱基，且当与低聚DNA末端连接的胺功能基团与醛反应时在中部的低聚DNAs比已固定碱基时要快得多，因此可用于与接近的，荧光连接的c-DNA进行多氢键合的碱基数量不足。醛还可以通过氢键与另外接近的c-DNA的碱基键合，从而将其去除，在低聚DNAs被固定后应进行化学处理，已知已生成DNA芯片的复制变得更为困难。5.—种诊断SNP的技术低聚DNA芯片在各种技术中最有利于分析DNAs以对存在于多种病毒(如禽流感，猪瘟疫，癌症扩散病毒等)中的各类DNA进行分型。然而，该种病毒大部分为/人原始病毒类型变异生成的新形式，同样的，在多凄t情况下在病毒许多病毒组仅在一或两个碱基序列上表现出区别。相应的，开发低聚DNA芯片中最重要的部分在于制备一种能够在开关水平鉴别单个石威基的变化(即，能诊断SNP)的低聚DNA芯片。许多研究者同意采用当前最常用的醛-芯片基底生产的低聚DNA芯片在固定低聚DNAs之间没有鉴别该单碱基变体所必需的足够空间，并且因此无法生产用于鉴别单碱基变体的诊断性低聚DNA芯片。6.生产低价芯片的技术如果通过连接如胺，生物素等功能基团固定低聚:DNA，则该低聚DNA的成本可上升超过十倍，且该芯片必须覆盖高浓度的DNAs以阻止表面碱基4A合。于是生产该种低聚DNA芯片的成本将变得极高。技术方案[23]本发明的目的在于4是供能够分子识别具有连续鸟噤呤基团的低聚DNA的亚胺杯衍生物，及其制备方法，从而解决上述传统低聚DNA固定方法的问题，如固定密度的均一性问题，在低聚DNAs之间荻得足够空间的问题，功能基团的连接问题等。本发明的另一目的在于提供一种低聚DNA单层，其中各类低聚DNAs通过所述亚胺杯芳烃书f生物与^皮璃基底(一种胺^皮片)或金基底(金薄层或金)的结合可未经任何处理:故密集填充并<呆留适当水平的空间；也就是提供一种能够制作低聚DNA芯片的亚胺杯芳烃^"生物单层。本发明更为具体的目标为提供一种低聚DNAs单层，其中具有至少七个连续鸟。票呤的低聚DNAs未经任何处理:故密集填充并保留了适当水平的空间，也就是提供一种能够制作低聚DNA芯片的亚胺杯芳烃书于生物单层。在另一方面本发明的目的在于提供一种低聚DNA芯片，其能够同时解决不能进行超高速杂交反应、不能确保i貪断SNP的技术、与三个碱基A,C和G连接的胺功能基团与醛-芯片基底的功能基团之间的化学键合，在芯片上难以均一密度固定低聚DNAs等所有传统低聚DNA芯片的问题。也就是说，本发明的目的在于提供能够不可逆分子识别连续鸟噪呤基团的氨基杯芳烃衍生物，一种以其自组装形式制备的低聚DNA芯片的基底的生产方法，以及一种通过在芯片基底表面的自发分子识别不可逆固定低聚DNAs生产的叶氐聚DNA芯片。本发明的另一目的在于4是供一种^氐聚DNAs单层，其中通过将上述化合物作为单层与具有胺功能基团的玻璃基底(胺玻片)等固体基底，或与金基底(金薄层或金)相连接，各类低聚DNAs可未经处理以最大密度固定并保留适当水平的空间，也就是说，提供一种以氨基杯芳烃衍生物生产的能制作低聚DNA芯片的芯片基底。本发明的另一目的在于提供一种低聚DNA单层，其中该连续鸟嘌P令石咸基净皮成线性固定在该表面上，乂人而^吏该4氐聚DNAs未经处理以最大密度固定并保留适当水平的空间，也就是说4是供一种用于生产4氐聚DNA芯片的技术。图1为在玻璃基底(胺玻片)上本发明的亚胺杯芳烃4汙生物自组装单层的制备过程的示意图。图2为在金基底上本发明的亚胺杯芳烃书f生物自组装单层的制备过程的示意图。图3为本发明具有连续鸟。票呤碱基的低聚DNA的固定方法示意图。图4和5显示了仅具有连续鸟。票P令石咸基的^氐聚DNA的选择性固定方法，并显示了用带荧光的c-DNA分析固定低聚DNA密度的结果。4氐聚DNA时需要至少7个连续鸟。票p令功能基团。[35]图7显示了为-睑证在向本发明的亚胺杯芳烃书于生物自组装单层固定低聚DNA时该鸟。票呤碱基通过分子识别被选才奪性识别，使用具有类似结构的咪唑功能基团进行竟争性反应的结果。图8为在玻璃基底上本发明的氨基杯芳烃衍生物自组装单层的制备过程的示意图。图9为在金基底上本发明的氨基杯芳烃衍生物自组装单层的制备过程的示意图。图10和1为本发明具有连续鸟嘌呤碱基的低聚DNA通过自动分子识别进行固定的方法示意图以及最大密度固定的实际试验结杲。图12为检测进行最大密度固定的最佳连续鸟嘌呤碱基数的试验结果。图13为c-DNA可以由固定4氐聚DNA时通过确保连续石咸基之间的适当空间而得到的固定低聚DNA之间的空间而接近芯片底部的示意图。图14和15为显示通过高速杂交SNP鉴别可能达到开关水平的实际试验结果。图16为显示鸟嘌呤碱基与其它碱基固定相比可进行选择性高速固定的实际竟争性反应结果。本发明的新型亚胺杯芳烃衍生物具有下列式1或2的结构。所述的亚胺杯芳烃彩f生物是具有至少7个连续鸟噤。令碱基的^f氐聚DNA的固定方法中所采用的自组装单层的关键化合物。[式1][46]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(其中Rl5R2,R3和R4独立选自组合-H,-CH3，-C2H5，-C3H7-OCH3,-CI,-(:6115和-COOR,并且在所述-COOR中，R代表-CH或一，5)。[式2][49][50](其中R!，R2，R3和R4独立选自组合-H,-CH3，-C2H5，-C3H7，-OCH3，-CI,《6115和-(2001^，并且在所述-COOR中，R代表-CH3或-C2H5;此外，所述的YbY2,Y3和Y4独立选自组合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m—CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z和-CO-(CH2)m—广C6H4-(CH2)c-Z(其中n=2-15,m=1-10，c=0-10,Z=-SH，-CHO,-COOH或一NH2))。本发明还提供制备所述式1和2的亚胺杯芳烃衍生化合物的方法。具有下列式3的该5,11,17,23-四氨基杯[4]芳烃化合物可通过在参照下列引用的参考文献1中所述的方法将杯[4]芳烃转化为5,11,17，23-四硝基杯[4]芳烃后经还原反应合成得到[引用的参考文献1:JournalofOrganicChemistry,1990,Vol55,pp5639-5643;JournalofOrganicChemistry,1979，Vol44，pp1233-1238;]。[式3][55]本发明所述式1的亚胺杯芳烃衍生化合物可通过以所述式3的5,11，17，23-四氨基杯[4]芳烃化合物作为起始原料，将式3的胺功能基团与具有下列式4的芳香醛反应合成得到(参见下文实施例中的反应2)。[式4][58]CHOR(其中R选自组合-H,-CH3,-C2H5,-C3H7,-OCH3,-CI,-C6H5和-COOR',并且在所述-COOR'中，R'代表-CH3或-C2Hs)。此外，本发明式2的该亚胺杯芳烃衍生化合物可通过式1化合物与醛化合物的反应合成得到，其中一种卣素被连接至末端基团，从而在该末端基团中醛或硫醇被连接至式1的第一和第三-OH基团位置(参见下列实施例的反应3-5)。[62]所述的卣化醛选自以下组合X-(CH2)n-CH=0,X-(CH2)n-SH,X-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,X-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH,X-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z以及X-CO-(CH2)m-广C6H4-(CH2)c-Z,其中n=2-15，m=l-10,c=0-10,X=-C1,-Br，-I或-08020^4(^13,Z=-SH,-CHO,-COOH或-丽2。此外，本发明提供了一种向金基底连接一种带有硫醇基团的亚胺杯芳烃衍生物制备得到的自组装单层固体基底。此外，本发明提供了一种通过亚胺键将亚胺杯芳烃衍生物连接至如玻璃，硅晶片或晶体等固体基底制备得到的自组装单层固体基底，以及一种通过如酯，醚和酰胺键等化学4建将亚胺杯芳烃衍生物连接至如玻璃，硅晶片或晶体等固体基底制备得到的自组装单层固体基底。此外，本发明提供了一种低聚DNA单层(即，一种低聚DNA芯片)，及其制备方法，其中各类低聚DNA通过将所述式2的亚胺杯芳烃衍生化合物与连接了胺功能基团的金基底或玻璃基底相连4妄^皮高密度固定。图1图示了在i皮璃基底上本发明的亚胺杯芳烃书于生物自组装单层的制备过程。在连接了胺功能基团的玻璃基底上制备亚胺杯芳烃衍生物自组装单层的具体方法如下首先，该连4妄了所述胺功能基团的玻璃基底(玻璃玻片)可参照下述引用的参考文献2[引用的参考文献2:Langmuir，1997,Vol13,pp4305-4308;Lang籠ir，1996,Vol12,pp5338画5342]通过在具有充足硅烷醇(-Si-OH)功能基团的玻璃基底上的化学反应得到的带有胺末端基团的玻璃基底(胺玻片或胺芯片)的形式进行制备。从而制备得到连接了胺功能基团的玻璃基底并将式2化合物以0.1-5mM的浓度添加入氯仿和THF混合溶液(CHCl3:THF=9:1)。1-5小时后，以氯仿，丙酮和乙醇的顺序洗涤并干》喿，然后完成如图1所示的亚胺杯芳烃自组装单层。所述单层的形成可通过红外线外部反射光i普确认。市场上的各类玻片均可用作所述的玻璃基底。对于4建合中所用的亚胺4走，该4建可在水中长期存i文时断裂。然而，由于低聚:DNA等活物质在制备时通常溶于pH介于7-8的緩沖溶液中，经确i人在用其立即形成亚胺4建时不存在问题。单层的制备过程。在金基底上制备亚胺杯芳烃衍生物自组装单层的具体方法如下将连接了石克醇的式2的化合物以0.1-5mM的浓度溶解于如氯仿(CHC1;0等有才;L溶剂中制备溶液。金基底被放入所制备的溶液并放置l-5小时后，将其耳又出并以氯仿，丙酮和水的顺序洗涤，并干燥，然后完成如图2所述的亚胺杯芳烃书于生物自组装单层。所述的金基底可以是任何类型的金薄膜；然而，一般而言，优选在玻璃，熔融硅，硅晶片，塑料基底等在真空镀以2-10nm的铬(Cr)或钛(Ti)等物质后以50-200nm的厚度真空镀金的基底。一般而言，所制备的金基底在即将使用前^皮置于食人鱼溶液(强硫酸:30%过氧化氢=3:)中约1分钟，然后以纯净水洗涤并吹氮气干燥后进行使用。所述单层的形成可通过红外线外部反射光谱确认。[73]此外，本发明l是供了一种通过固定4氐聚DNA而制备低聚DNA芯片的方法以及由该方法制备得到的低聚DNA芯片，其中通过多分子识别将连续鸟嘌P令石咸基固定到所述固体基底。更具体地，本发明^是供了一种通过所述亚胺杯芳烃衍生物的四个氮原子分子识别连续鸟嘌呤功能基团的多分子识别固定低IRDNA的方法。本发明的低聚DNA固定方法形成了所有采用低聚DNA的分析方法的基础，这是目前为止全世界未见类似研究报导的新型方法。图3为本发明具有连续鸟嘌呤基团的低聚DNA的固定方法示意图。该具有用于固定的连续鸟。票呤基团的低聚DNA为5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.1)。^!夺与其结合的带荧光的c-DNA为5'-Cy3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.2),其具有与固定低聚DNA互补的DNA序列。此时，该l氐聚DNA的固定密度可通过将荧光物质Cy-3(Telechem，美国)连接至该末端基团从而仅在该连接位点显示荧光得到测定。在将低聚DNA以54(ig/ml(6.75pmol/ml)的浓度溶解于含有15%丙三醇的溶液500mMKC1中后，该4氐聚DNA可通过涂4隻于用购自ProteogenCo.(Korea)的4敖阵列制备的直径约为150um的亚胺杯芳烃单层上得到固定。约1-4小时后，以含有0.1%SDS(十二》克基石黄酸钠)的2XSSC(IXSSC=碎宁4蒙酸钠15mM+NaCl150mM)'溶液洗涤，以0.1XSSC溶液洗涤3分钟并干燥制备。经确定该制备低聚DNA单侧在至少6个月的测量中未显示出4壬<可变4匕。[78]图4和5为显示了在本发明的低聚DNA单层荧光分析该寸氐f:DNA密度的示意图。该具有用于固定至图3中制备的J氐聚DNA单层的连续鸟嘌口令基团的4氐聚DNA为5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.])。将与其结合的带荧光的c-DNA为5'画Cy3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.2),其具有与固定低聚DNA互补的DNA序列。此外，该低聚DNA的固定密度可通过将焚光物质Cy-3(Telechem，美国)连一妾至该末端基团从而仅在该连接位点显示荧光得到测定。该单层以含0.17nmol/ml的与固定^f氐聚DNA荧光连4妻的c-DNA的60(al4xSSC+0.002%SDS+50。/。丙三醇混合溶液进^f亍涂布，然后在50。C下将DNA杂交30分钟。随后先以含0.1%SDS的4xSSC溶液在室温下洗涤，再以4xSSC溶液洗涤，并干燥。所得产品可用扫描仪(GSIlite,美国)进行确认。对于用于固定的低聚DNAs,可采用分别具有如下DNA序列的低聚DNA:具有9个连续A,T,C，G碱基序列、一种连接了生物素(类似鸟嘌呤的功能基团)的低聚DNA以及一种无连续碱基序列的4氐聚DNA。相应的，经试一险确i^f又连续鸟嘌呤石咸基^皮选冲奪性固定。该用于固定比4交的DNA序列如下所示9T5'-TTTTTTTTTTAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.3)9A5'-AAAAAAAAATAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.4)9C5'-CCCCCCCCCCAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.5)生物素5'画生物素-TATATAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.6)no5'-AATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.7)该通过杂交与之结合的c-DNA可经合成具有互补;成基序列。5'-Cy3画GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.2)同时可以通过将荧光物质(Cy3)与荧光扫描仪的连接相对分析所连接的c-DNA的密度，即，连接了c-DNA的固定低聚DNA的密度。才艮据实际试-验结果，在上述条件中以相同方式涂^隻和固定各低聚DNA后，该c-DNA以能固定在表面的低聚DNA最大量的三倍进行涂覆，从而使充分荧光连接的c-DNA与所有固定低聚DNA在此结合。然后，进行洗涤和干燥并以荧光扫描仪进行分析。实际^式-验结果为以6X6显示结果的图5的中图，该结果以数值进行荧光分析得到且该分析显示于图5右侧的柱状图中。实际试-验结果显示具有9个连续鸟。票呤基团的低聚DNA9G所呈现的荧光约比连接了不同连续碱基，或连接了生物素，或未连接连续碱基的低聚DNA高10-40倍。所述结果显示仅当固定低聚DNA时存在连续鸟嘌呤石成基时，该低聚DNA才能以可分析的水平固定在亚胺杯芳烃的表面上。图6显示了向本发明的亚胺杯芳烃书f生物自组装单层固定低聚DNA时必需有至少7个连续鸟嘌呤功能基团。该低聚DNA固定在图3所示的条件下进行，且该c-DNA可根据上述条件使用同样用于图4的带荧光低聚DNA进行杂交。1G5'-GAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.8)4G5'-GGGGAATCAACCCACAGCTGCA画3'(SEQIDNO.9)7G5'-GGGGGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.10)9G5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.1)12G5'画GGGGGGGGGGGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.11)15G5'-GGGGGGGGGGGGGGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.12)[104]c-DNA5'-Cy3画GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.2)(Cy-3;荧光物质)在上述相同条件下;余覆，洗涤并干燥低聚DNA。才艮据实际试-验结果，在上述条4牛中以相同方式〉余^隻和固定各^f氐聚DNA后，该c-DNA以能固定在表面的低聚DNA最大量的三倍进行涂覆，从而使与所有固定低聚DNA荧光连接的c-DNA在此结合。然后对其进行洗涤和干燥以通过荧光扫描仪进行分析。实际试验结果为以6X6显示结果的图6的中图，该结果以数值进行荧光分析得到且该分析显示于图6右侧的柱状图中。当连续鸟。票呤碱基序列约为1或4时，其结果为几乎没有表面固定。此外，当其具有7个连续鸟嘌呤(7G)时显示强烈荧光，并在具有9个连续鸟。票p令(9G)时显示出最强的荧光。同时，当<氐聚DNA具有长于9个连续鸟噤呤石咸基的12个(12G)和15个(15G)连续鸟嘌呤碱基时，该荧光灵敏度开始下降。该结果显示9个鸟嘌呤碱基是足以通过分子识别进行固定的水平，且理-论上当^吏用更长的鸟嘌呤石成基时，固定具有12G的低聚DNA比固定具有9G的低聚DNA需要多出约1/3的空间，因而该荧光灵敏度下降至约1/3的水平。具有15G的低聚DNA需要多于9G约额外2/3的空间，因此理论上被固定的数量下降至约3/5的水平(即60%),实际上荧光灵壽丈度与9G相比下降了约55%。综合所述结果，可以理解固定所需的连续鸟。票P令数量至少为7个。所述连续鸟嘌呤的^:量优选为7-15个，更优选为9-12个，最有选9个。[109]图7装单层固定低聚DNA时该鸟嘌呤碱基通过分子识别被选4奪性识别，使用具有类似结构的咪唑功能基团进行竟争性反应的结果。图7显示了连续鸟噤p令石咸基通过分子识别进行固定的结果，该结果通过一项在固定中包含一种能够进行与鸟噪呤碱基类似的分子识别的咪唑的研究获得。由于咪唑在亚胺杯芳烃中具有比鸟。票呤碱基相对弱的分子识别，因此可在高于待固定低聚DNA的浓度下进行分子识别的竟争性反应。在与图3相同的固定条件下进行固定并采用图4所用的相同方法中的c-DNA进行荧光灵壽丈度的测量。图7的左图显示了实际试验结果，右图显示了依赖于荧光灵每丈果显示该下降起始于约20mM的水平，且在30mM的水平下降至一半，而在100mM和以上时低聚DNA几乎不进行固定。该结果显示低聚DNA通过亚胺杯芳烃衍生物中的9个连续鸟。票呤碱基的多分子识别进行固定。识别进行9个连续鸟噤呤石咸基的不可逆固定。通过荧光分析表示的固定低聚DNA数量特别显示了高于传统已知方法的5-30倍的固定密度。同样地，本发明:提供了一种能在单层表面固定连续鸟嘌呤石成基时获得具有其长度(2.5-3.5nm)的空间的新型低聚DNA固定方法，从而在以诊断或研究等目的分析具有特定碱基序列的基因时通过纟是供至少具有^:百个石成基序列的c-DNA下降至低聚DNA底部并与固定低聚DNA强烈键合所需的足够的空间(2.5-3.5nm)，将c-DNA杂交所需的时间由原先的至少12小时显著下降至1-2小曰寸以内。作为本发明的另一方面，本发明的新型氨;&杯芳烃衍生物具有以下式5-8的结构。所述氨基杯芳烃衍生物是具有固定连续鸟嘌呤基团的^f氐聚DNA的固定方法中所用的自组装单层的关^t化合物。[式5](其中R1;R2,R3,R4，R5，R6，R7，R8，R、R'2,R'3,R'4，R'5，R'6，R'7，R's独立选自组合-H,-CH3，-C2H5,-C3H7,-OCH3,曙Cl,-C6H5,-OH.-OCH2CH3，-Br，-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5，-OC6H4CH3,-OC6H4C(CH3)3，-OC6H4CF3,-OC6H4Cl,-OCOCH3，-NHCOCH3，-CONHCH3,-CN,COOH和-COOR,且在所述-COOR中，R代表—CH3或一C2Hs)。OHOHOHHO[119][式6][120]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula>(其中Ri，R_2，R3,R4,R5，R7，R，R'i,R'2，R'3，R'4，R'5，R'6，R'7，R'8独立选自组合誦H，-CH3,-C2H5,-C3H7，-OCH3，-Cl，-C6H5,-OH,-OCH2CH3，-Br，-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3，-OC6H4C(CH3)3，-OC6H4CF3，-OC6H4Cl，-OCOCH3,-NHCOCH3，-CONHCH3，-CN，COOH和-COOR，且在所述-COOR中，R代表-CH;或-C2H5。此夕卜，所述的Y!,Y2,Y3和Y4独立选自组合-H,-(CH2)n-CH=0，-(CH2)n-SH，-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0，-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z，和-CO-(CH2)m-l-C6Hr(CH2)c-Z(其中n=2-15,m=1-10,c=0-10，Z=-SH，画CHO,-COOH，-NH2，且"QH4-和C6H5#1定义为苯-基基团))。[式7][124](其中Ri,R2,R3,R4，R5，R6,R7,R8,R'i，R'2,R'3，R'4,R's,RV"R'7，R'8独立选自組合-H，-CH3，-C2H5，-C3H7,-OCH3,-Cl，-C6H5，-OH，-OCH2CH3，-Br，-CF3，-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3,-OC6H4C(CH3)3，-OC6H4CF3，-OC6H4Cl,-OCOCH3,-NHCOCH3,-CONHCH3，-CN，COOH和-COOR，且在所述-COOR中，R代表—CH3或—C2H5)。[式8][126][127](其中R,，R2,R3,R4,R5，R6，R7,R8，R'i,R'2，R'3,R、，R's,R、,R'7,R'8独立选自组合-H,-CH3，-C2H5,-C3H7,-OCH3,-Cl，-C6H5,-OH,-OCH2CH3，-Br，-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3，-OC6H4C(CH3)3，-OC6H4CF3,-OC6H4Cl,-OCOCH3，-NHCOCH3,-CONHCH3,匪CN,COOH和-COOR,且在所述-COOR中，R代表-CHb或-QH5。然而,排除R,R2，R3，R4，R5，R6,R7，R8，R'i,R'2，R'3,R'4，R's,R'6,R'7,R'8同时为-H的情况。此外，所述的Yl5Y2，Ys和丫4独立选自组合-H，-(CH2)n-CH=0，-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)C-Z,和-CO-(CH2)m-l-C6H4-(CH2)c-Z(其中11=2-15,m=1-10，c=0-10，Z=-SH，-CHO,-COOH,-NH2,且-C6H4和-(:6115^皮定义为苯基基团))。本发明提供制备所述式5-8的氨基杯芳烃衍生化合物的方法。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>[131]所述式9的四氨基杯[4]芳烃可通过参照所引用的参考文献1的方法将杯[4]芳烃转化为四硝基杯[4]芳烃后进行还原反应合成得到。本发明所述式5和7的氨基杯、芳烃衫于生〗匕合物可通过将用已知方法合成的式9的四氨基杯[4]芳烃化合物作为起始原料，将式9的胺功能基团与下文实施例13中的苄基氯或苄基溴衍生物反应合成得到。备选地，在式9的功能基团与芳香醛参照下文实施例16的方法反应后4吏用还原剂进行还原反应，即是与节基氯或千基溴书t生物反应合成式5和7的氨基杯芳烃衍生物。本发明式6和8的氨基杯芳烃衍生化合物(其中醛或硫醇通过下列-O.H,即，醇功能基团中的第一和第三醇功能基团与烷基基团末端相连4妄)可通过将式5和7的4b合物与具有醛等功能基团的化合物(其中卣素参照下列实施例17-19被连接至末端基团)反应得到。此外，本发明提供了一种用于制备能通过将所述式6或8的氨基杯芳烃书f生物连接至带有胺等各种功能基团的金基底或如玻璃等固体基底以高密度固定各种类型的低聚DNA的低聚DNA单层的4氐聚DNA芯片的制备方法。此外，本发明4是供了一种通过亚胺和酰胺4t连4妻氨基杯芳烃衍生物(其中醛功能基团被连接至所述式6或8的氨基杯芳烃衍生物的末端基团)和选自玻璃，硅晶片和晶体的带有胺功能基团的固体基底制备得到的自组装单层固体基底。此外，本发明才是供了一种通过选自酯，醚或酰胺4建的化学键连接氨基杯芳烃衍生物(其中醛功能基团被连接至所述式6或8的氨基杯芳烃衍生物的末端基团)和选自玻璃，硅晶片和晶体的带有胺功能基团的固体基底制备得到的自组装单层固体基底。此外，本发明提供了一种通过不可逆分子识别将未经处理的具有连续碱基的低聚DNA固定至所述低聚DNA芯片基底制备一种低聚DNA单层，即一种低聚DNA芯片的方法。图8显示了在如玻璃，硅晶片，熔融石圭等固体基底上制备本发明的氨基杯芳烃衍生物自组装单层的过程。在连接了胺功能基团的玻璃基底上制备氨基杯芳烃衍生物自组装单层的具体方法如下连接了之前使用的胺功能基团的玻璃基底(玻璃玻片)可参照下述引用的参考文献2通过在具有充足硅烷醇(-Si-OH)功能基团的玻璃基底表面上的化学反应得到的带有胺末端基团的玻璃基底(胺玻片或胺芯片)的形式进行制备。将如此制备的连接有胺功能基团的玻璃基底加入氯仿和THF的混合溶液，其中式6或8的化合物以0.1-5mM的浓度溶于其中(CHCL3:THF=9:1)。1-5小时后，以氯仿，丙酮和乙醇的顺序洗涤，并干燥，然后完成如图8所示的氨基杯芳烃衍生物自组装单层，即A型BMTDNA芯片基底。所述单层的形成可通过红外线外部反射光i普确i^。市场上的各类^:片或玻璃均可用作所述的玻璃基底。对于键合中所用的亚胺键，该键可在水中长期存放时断裂。然而，由于4氐聚DNA等活物质在制备时通常溶于pH介于7-8的緩沖溶液中，经研究结果确认在用其立即形成亚胺^fe时不存在问题。3口果^。图8所示一夸该制备A型BMTDNA芯片基底力文入含有如BH:3-TH:F或1-5%NaBH4等还原剂的有才几溶剂中1-10分钟，该亚胺净皮还原成更强的胺，因此可为长期〗呆存或在不同pH范围内制备DNA芯片提供出色的稳定性。图9显示了在金基底上本发明的氨基杯芳烃衍生物自组装单层的制备过程。在金基底上制备氨基杯芳烃衍生物自组装单层的具体方法如下将连接了碌L醇的式6或8的化合物以0.1-5mM的浓度溶解于如氯仿(CHCl3)等有机溶剂中制备溶液。金基底被放入所制备的溶液并力文置1-5小时后，^1夸其耳又出并以氯〗方，丙酮和水的顺序洗涤，并干燥，然后完成如图9所述的氨基杯芳烃书f生物自组装单层。所述的金基底可以是任何类型的金薄膜；然而，一般而言，优选在玻璃，溶融硅，硅晶片，塑料基底等在真空4度以2-10nm的铬(Cr)或钛(Ti)等物质后以50-200nm的厚度真空镀金的基底。优选将所制备的金基底在即将使用前置于食人鱼溶液(强硫酸:30°/。过氧化氢=3:1)中约l分钟，然后以纯净水洗涤并吹氮气干燥。所述单层的形成可通过红外线外部反射光谱确认。[148]此外，本发明^是供了一种通过多分子识别连^妾连续鸟。票口令碱基和所述固体基底固定低聚DNA以制备低聚DNA芯片的方法，以及由该方法制备得到的低聚:DNA芯片。本发明更具体提供了一种通过所述氨基杯芳烃衍生物的四个氮原子分子识别连续鸟嘌呤功能基团的多分子识别固定低聚DNA的方法。技术提供了基础技术，这是一种迄今为止全世界未见类似研究结果的新型方法。图lO和ll为通过自动分子识别制备高密度低聚DNA芯片的4支术示意图，以及组成单层的氨基杯芳烃纟汙生物凄t量的理i仑计算示意图。它是将实际低聚DNA浓度与通过理论计算得到的可固定在氨基杯芳烃书f生物单层上最大4氐聚DNA浓度比较而得的实际试验结果。固定低聚DNA的理-沦最大量可通过下文方程计算。通过X射线测定法得到的氨基杯芳烃的直径为2.1-2.2nm。当其在表面上作为单层进行自组装时所需分子的数量与通过连接三个氨基杯芳烃书f生物中心的直线构成的两个三角形的面积相同。因此，一个杯芳烃A'f生物在表面上占据的面积可通过以下方程获得[方程]2.1譲x2.1nmxsin60。=3.82xl(T14cm2[156]因此，每lcm2中存在的氨基杯芳烃衍生物的数量为1/3.82x10-14cm2=2.62x10n=43.5pmol/cm2。由于6-7结合氨基杯、芳烃衍生物的面积可用于固定一个低聚DNA,可固定的最大低聚DNA密度为43.5/(6-7)pmol/cm2=6.2-7.25pmol/cm2。参照实》也例24的方法，将用于固定的低聚DNA5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.16)与带荧光的c-DNA5'画cy3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT國3'(SEQIDNO.19)杂交并以最大密度连接至低聚DNA芯片后，根据实施例13的方法在洗涤和干燥后通过荧光扫描仪(GSI，美国)测得的荧光灵敏度的测量结果显示于图11的杂交结果2)中。作为使用荧光扫描仪在干燥相同的用于在不同;农度下杂交的c-DNA5'-cy3画GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.19)后测量类似荧光灵每文度的结果，在以3.8pmol/cm浓度涂^隻并干燥后可获得类似水平的荧光灵牵丈度，该水平是理论计算值的一半。该结果显示于图11的1)中干燥荧光低聚DNA的结果中。该结果显示参照本发明开发的BMT低聚DNA芯片基底可通过固定接近理论最大值的低聚DNA制备低聚DNA芯片，并可在杂交30分钟后获得约最大荧光的50%，且这是世界上首个同时支持超高速杂交和实现高密度固定技术的低聚DNA芯片制备技术。图12为参照实施例22通过鸟噪p令^咸基连续连4妄的具有相同石咸基序列的低聚DNA以5倍的浓度固定低聚DNA(6.75nmol/mL，lnL),参照实施例22进4亍杂交，洗涤并干燥以发现最佳连续石咸基数量后，使用荧光扫描仪(GSI，美国)分析的结果。在图12的试验中采用了表4所示的石咸基序列，在杂交中采用了表4所示的荧光c-DNA。实际i式-验结果为以6X6显示结果的图12的中图所示的扫描数据，该结果以数值进行荧光分析得到且该分析显示于图12底部的柱状图中。当连续鸟噤呤碱基序列约为1或4时，其结果为几乎没有表面固定。然而，当其具有7个连续鸟。票呤(7G)时显示强烈荧光，并在具有9个连续鸟嘌呤(9G)时显示两倍于7个连续鸟嘌呤(7G)的荧光水平。当使用具有长于9个连续鸟噤呤石咸基的12个(12G)和15个(15G)连续鸟。票呤碱基的低聚DNA时，据显示荧光灵壽文度下降至9个连续鸟噤p令石咸基时的1/2,1/3的水平。这显示9个连续鸟嘌呤碱基是足以通过分子识别固定低聚DNA的水平且在使用更长的鸟嘌呤碱基时，理论上12G的低聚DNA需要大于9G的空间，因此焚光灵壽文度下降至1/2的水平。15G的4氐聚DNA与9G相比需要约2/3的额外空间，因此被固定的低聚DNA下降至约30%的水平，而荧光灵壽文度纟皮下降至9G的约1/3的水平。综合这些结果，可以看到固定所需的最佳连续鸟嘌呤的数量为9。如果连续鸟嘌p令的lt量小于9G，则可能无法达到通过分子识别不可逆固定^氐聚DNA的充分水平。此外，从这些结果还可以看到连接鸟。票呤碱基的数量大于9G时，待固定的面积(即固定所需的面积)将大于9G,这从而导致了实际固定的低聚DNAs数量的下降。图13为c-DNA可以通过固定低聚DNA时通过连续石成基而荻得的适当的空间而确保的固定低聚DNA之间的空间接近芯片底部且维持了超高速接近所需的足够空间水平的示意图。与此同时，它还显示了6-7氨基杯芳烃4汙生物实际固定时的表面面积可用于固定低聚DNA。在图14和15中，表5所示的石咸基序列参照实施例23分别固定了不同的A,C,G，T型4氐聚DNA。然后，在参照实施例23的为斥企测带荧光的DNA(Cy3-DNA)而与c-DNA进4亍的杂交只于能与之结合的互补c-DNA进4亍杂交后，如实施例23所述，该带焚光的表5的低聚DNA被用于实施例23所述的荧光连接中。此后可进行洗涤和干燥以通过荧光扫描4义(GSI，美国)进行荧光灵敏度分析。图14和15显示了这是一种甚至能够在如30分钟左右的短杂交时间中进行可在开-关水平辨别和分析荧光灵壽丈度，同时在开-关水平辨别SNP的超高速杂交的低聚DNA芯片。此外，该结果显示作为本发明目标的低聚DNA芯片的制备技术是一种支持超高速杂交并以高复制简便分析单核苷多态性(SNP)的新型技术。图16为显示单独鸟。票呤石威基与其它石成基固定相比进行选"^性高速固定的实际竟争性反应结果。使用以如实施例25相同浓度连接了9G的低聚DNA(9G-1),其不与带焚光的表6的低聚DNA结合，通过以低聚DNA(9G-1)1,2,4倍的浓度涂覆混合4类含有与带荧光低聚DNA(Cy-3-DNA)互补的碱基序列且连接9A,9G,9T,9C的低聚:DNA混合物以图16所示的顺序固定DNA。同时，如果9A,9C，9T，9G以相同浓度混合的低聚DNA的固定快于低聚DNA(9G-1),则可通过与参照实施例25进行的杂交过程中的带荧光低聚DNA结合显示荧光，而如果该连接9G的低聚DNA(9G-1)固定更快，则显而易见不会显示荧光。才艮据图16的实际实马全结果可以确定在固定9G的位点上，在固定时荧光灵敏度随低聚DNA浓度的上升而上升，乂人而当9G-1:9G=1:1时，可显示约为50%的焚光灵敏度，而在1:4时，可显示约80%的荧光灵敏度。对于9T，9C可以确定该荧光灵每丈度上升极少，甚至在9A时Y叉显示了4倍于16G的量的轻微荧光灵敏度水平。因此，可以看到当实际固定时使用了连接9G的低聚DNA时，将用于杂交的石成基(即，将用于与c-DNA结合的碱基)部分不参与固定，也就是说，仅9G选择性结合的位点可制备能通过以最大密度与本发明的氨基杯芳烃衍生物单层结合进行复制的低聚DNA。总而言之，该结果显示可通过以根净居本发明开发的氨基杯芳烃衍生物自组装单层多分子识别连续鸟噤呤碱基在单层表面上不可逆固定4氐聚DNA从而制备^氐聚DNA芯片，且这是一种能通过40始终支持固定以使荧光分析显示的固定低聚DNA的量4妾近理i仑最大密度的可复制的低聚DNA芯片制备的基础技术。此外，在本发明中，连续鸟。票P令石成基^皮固定在单层表面的并呈图13所示的固定的低聚DNA确保具有与所述碱基相同长度的稳固空间。该空间可在以诊断或研究目的分析具有特殊^咸基序列的DNAs时使至少具有几十到上百个碱基序列的c-DNA能轻松地以超高速自由到达芯片基底表面，从而可以在如10分钟-1小时的极短时间通过使最大数量的石咸基互补结合进行超高速杂交。此外，本发明提出了一种制备低聚DNA单层的技术并结合了在固定DNAs之间充分获得空间从而即使小单核苷多态性也能简单诊断的技术，即，一种用于制备^氐聚DNA芯片的基础才支术。日J明并非〗义限于此。具体实施例方式实施例15,11,17，23-四氨基杯[4]芳烃的制备[反应式1〗同K/描述。然而本发[171]浅黄色固体产物5,11，17，23-四氨基杯[4]芳烃(TACA)可以5,11,17，23-四硝基杯[4]芳烃(TNCA)作为起始原料参照下述参考文献3[引用的参考文献3:VanWagenigen，A.M.A.;Snip,E.;VerboomW.;.Reinhoudt，D.N.;Boerrigter,H.;LiebigsAnn/Recueil1997.pp2235-2245]所述的合成方法以75%的产率合成得到。所述反应表示为反应式1。实施例25，11，17，23-四爷基亚胺-杯[4]芳烃的制备[反应式2]岡[177]将500mg的TACA(1.03mmol)和200mg的无水MgS04放入干燥圓底烧并瓦中，同时添加150ml的乙腈和0.84ml的苯曱醛(8.24mmol),然后在室温和氮气交纟炎下混合两小时。反应后，过滤去除固体产物，然后对溶液减压并去除残留溶剂。然后在完全溶解于5ml的CH2Cl2后，添加30ml正己烷使5，11,17,23-四千基亚胺-杯[4]芳烃(TBICA)结晶为浅粉色固体。减压过滤并减压去除残留溶剂获得TBICA(822mg,产率95.7%)。所述反应表示为反应式2。iHNMR(300MHz，CDC13):10.15(s，4H，OH),8.34(s,4H,N=CH)，7.82隱7.78(m，8H，Ar)，7.40-7.38(m,12H,Ar),7.01(s,8H，Ar),4.3l(d，4H,ArCH2Ar，J=13Hz)，3.63(d,4H,ArCH2Ar，J=13Hz)13CNMR(300MHz,CDC13):159.26,146.28，136.40,131.32,tl28.86，121.90,32.47岡实施例35,11,17,23-四卡基亚胺烷氧基-杯[4]芳烃的制备[反应式3]岡<formula>formulaseeoriginaldocumentpage44</formula>[185]将500mg的TBICA(0.6薩al),无水K2CO3(830mg,6mmol)和碟化钠(810mg，5.4mmol)放入干燥圓底烧瓶中，添加150ml的乙腈，然后在氮气交换下混合。IO分钟后，添加6-溴正己醛(644mg，3.6mmo1),然后将反应容器中的反应温度上升至80°C。然后将混合物搅拌24小时。反应后，减压去除乙腈，并使用150mlCH2Cl2溶解反应产物。由于反应过程中得到的KBr,KI，K2C03等物质不溶解，它们可通过减压过滤去除。将滤过溶液减压去除溶剂并完全溶解于5ml的乙酸乙酯中。然后如果添加40ml的正己烷，5，11，17,23-四节基亚胺烷氧基-杯[4]芳烃(TBICOCA)可作为黄色固体被萃取。使用CHCl3/正己烷使TBICOCA结晶获得浅黄色固体产物(570mg,产率90%)。所述反应表示为反应式3。NMR(300MHz,CDC13):9.81(t,2H，CHO),8.46(s,2H,N=CH)，8.24(s，2H,N=CH),7.86-7.82(m,4H,Ar),7.73-7.70(m，4H,Ar)，7.43-7.3l(m，12H,Ar),7.07(s,4H,Ar),6.83(s,4H，Ar),4.33(d,4H,ArCH2Ar，J=13Hz)，4.04(t,4H,OCH2),3.46(d,4H，ArCH2Ar,J=13Hz)，2.57(t，4H，CH2CHO),2.10(t,4H,OCH2CH2),1.88-1.70(m，8H，CH2CH2)13CNMR(300MHz,CDC13):202.07,197.11,159.61，158.90,148.21,147.19，145.93，143.10,H36.07,130.59-129.57,128.83-128.08,122.10,121.54，43.84，31.73，25.57[188][189]实施例4[190]5，11,17,23-四爷基亚胺-溴丁氧基-杯[4]芳烃的制备[191][反应式4]网TBICATBBCA[193]将TBICA(500mg，0.6mmo1)，无水K2CO3(830mg，6mmo1)和碘化钠(1.08g,7.2mmol)放入干燥圓底烧瓶中，添加150ml的乙腈，然后在室温下混合10分钟。向反应容器添加1，4-二溴丁烷(1.3g,0.72ml，6mmol)并将反应容器中的温度上升至80°C。然后将混合物反应24小时。在反应容器冷却至室温后，减压去除溶剂，并将残留产物溶解在150ml的CH2C12中。由于反应过禾呈中得到的KBr,KI,K2CO:;等物质不溶解，它们可通过减压过滤去除，并将滤过溶液减压去除溶剂。以乙酸乙酯/正己烷萃取后，减压过滤获得黄色固体产物5，11，17,23-四节基亚胺-溴丁氧基-杯[4]芳烃(TBBCA)。使用CHCl3/正己烷使固体重结晶以获得浅黄色TBBCA(480mg，产率72%)。所述反应表示为反应式4。[194]'HNMR(300MHz,CDC13):8.47(s,2H,N=CH),S.24(s,2H,N=CH)，7.98(s,2H，ArOH)，7.86-7.83(dd,4H,ArH)，7.73-7.70(dd,4H，ArH),7.41-7.3l(m,12H,ArH)，7.08(s,4H,Ar),6.83(s,4H,Ar),4.33(d，4H，ArCHAr,J=13Hz),4.06(t，4H,OCH),3.49(s,4H,ArCHAr，J=13Hz),3.45(t，4H,CHBr),2.37-2.29(m,OCH2CH2)2.24陽2.18(m,CH2CH2Br)[196]实施例5[197]5,11,17，23-四苄基亚胺巯基丁氧基杯[4]芳烃的制备[198][反应式5][199]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>)和石危代乙酸钟(l14.21mg，immol)放入干燥圆底烧瓶中，并溶解在60ml丙酮中，在室温和氮气交换下声波反应90分钟。反应后，减压去除溶剂，并溶解于30ml的CH2Cl2中。然后减压过滤不溶解的沉淀物，以水洗涤滤过溶液两次，分离有机层并以MgS04千燥。将有机层减压过滤得到固体然后将滤过溶液减压干燥并使用乙酸乙酯/正己烷重结晶，并减压过滤获得浅黄色固体晶体。将所得的固体晶体放入圆底烧瓶，并溶解于CH2Cl2:曱醇-5:l的混合溶液中，在室温和氮气交换下声波反应。1分钟后，加入1.0MKOH(lml，lmmol),声波反应30分钟。反应后，减压去除-容剂，然后、溶解于5ml的CH2C12中并以0.1MHC1溶液洗涤一次。分离有4几层并以MgS04干燥后，减压过滤，减压去除滤过溶液的溶剂以获得淡黄色5，11,17,23-四爷基亚胺巯基丁氧基杯[4]芳烃(TBIMBCA)。以乙酸乙酯/正己烷重结晶所得的TBIMBCA以获得白色固体晶体TBIMBCA(450mg，产率73%)。所述反应表示为反应式5。[201]，HNMR(300MHz,CDC13):8.48(s,2H,N=CH),8.17(s,2H,N=CH),7.84(m,4H,ArOH),7.68(m,4H,ArOR),7.38(m,6H,ArH)，7.28(m,6H,ArOR),7.10(s,4H,ArH),6.8l(s，4H，ArH)，4.34(d，4H,ArCHA2r),4.04(t,4H,ArOCH2)，3.47(d，4H,ArCH2Ar，J=13Hz)，3.03(t,4H,SHCH2),2.38(m,4H,ArOCH2CH2),2.1l(m,4H,CH2CH2)[202〗[203]实施例6[204]亚胺杯芳烃衍生物单层的制备[205]将实施例3中合成得到的TBICOCA溶解于如CHC13等有机溶剂中制备浓度为0.1-5mM的溶液。如图1所示，将连接了胺功能基团的玻片(胺芯片)放入制备得到的溶液中1-24小时，然后取出并以氯仿，丙酮和水洗涤，然后干燥，以制备本发明的亚胺杯芳烃单层。其它的亚胺杯芳烃衍生物单层参照相同的方法制备。[206][207]实施例7[208]金基底上亚胺杯芳烃衍生物单层的制备[209]将实施例5中合成得到的TBIMBCA溶解于如CHCl3等有牙几溶剂中制备浓度为0.1-5mM的;容液。如图2所示，将金基底i支入制备得到的溶液中1-24小时，然后耳又出并以氯仿，丙酮和水洗涤，然后干燥，以制备本发明的亚胺杯芳烃单层。其它的亚胺杯芳烃衍生物单层参照相同的方法制备。所述金基底可以各种形式4吏用，但一4殳而言，优选在玻璃，熔融硅，硅晶片，塑料基底等在真空镀以5-20nm的4各(Cr)或钛(Ti)等物质后以100-300nm的厚度真空镀金的基底。将所制备的金基底在即将使用前置于食人鱼溶液(强硫酸:30%过氧化氩=3:1的混合溶液)中约IO秒钟-I分钟，然后以水洗涤并在氮气交换下干燥，并立即^f吏用所述单层的形成可通过红外线外部反射光语(FTIR-ERS)分析。岡[211]实施例8[212]通过多分子识别固定低聚DNA的方法P13]在图3所示的^氐聚DNA固定中采用了Genetics(英国)的微阵列设备和ProteogenCo.(韩国)的微阵列设备。将具有9个连续鸟噤呤石咸基的4氐聚DNA以6.75pmol/ml溶于BMT点才羊溶液中以制备固定溶液。^吏用阵列插针如图1所示以所述固定溶液涂覆亚胺杯芳烃4汙生物单层^皮璃基底(玻片)并用与实施例所述6所述相同的方法以l-5nL的量将低聚DNA固定在直径为150-lSOjim的点中。1_4小时后，以500ml的BMTWa-A-1溶液洗涤玻片一分钟，并以BMTWa-A-2溶液洗涤两次，然后干燥。为封闭其它的低聚DNA固定位点，将洗涤后的^皮片力文入250ml的BMT封闭溶液并处理30分钟。然后以500ml的BMTWa-A-l;容液洗涤^皮片3分钟，并以BMTWa-A-2;容'液洗涤两次。然后将水去除以进4亍干燥。[214][215]实;^例9[216]通过多分子识别仅不可逆固定具有9个连续鸟。票呤碱基的^氐聚DNA的方法[217]在图4所示的低聚DNA固定中采用了Genetics(英国)的樣i阵列i殳备。为确定如下文表1的6种不同的固定功能基团9A,9G,9C，9T，no，生物素等的固定效率，将各寸氐聚DNA以6.75pmol/ml溶于BMT点样溶液中以制备固定溶液。使用阵列插针如图1所示以所述固定〉容液涂覆亚胺杯芳烃书于生物单层玻璃基底(J皮片)并用与实》4例所述6所述相同的方法以l-5nL的量将^氐聚DNA固定在直径为150-180pm的点中。l画4小时后，以500ml的BMTWa-A-l溶液洗涤3皮片一分钟，并以BMTWa-A-2〉容液洗涤两次，然后干火喿。为封闭其它的《氐聚DNA固定位点，将洗涤后的J皮片放入250ml的BMT封闭〉容液并处理30分钟。然后500ml的BMTWa-A-l溶液洗涤玻片3分钟，并以BMTWa-A-2溶液洗涤两次。然后去除水分以进行干燥，并制备得到图4所示的低聚DNA芯片。然后，稳定连4妄一种直4圣为0.8cm的小室以进4于杂交。[218]表1<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>[220]为了与下列带荧光的标的DNA进4亍杂交，可在1.5ml管中配制2(il带2pmol/(il荧光的标的DNA与58|ilBMThyb-mixA的混合〉容液。将混合;容液在100。C水中力。热3分钟，并放在冰上3分钟以进行冷却，将60^1的混合溶液放入连接了杂交室的玻片。然后，在恒温恒湿的烘箱中将玻片在50。C下杂交30分钟。在30。C的恒温器中以BMTWa-B-1(4xSSC,0.1%SDS)溶液洗涤经杂交的玻片2分钟，并以BMTWa-B-2(4xSSC)纟容液在室温下洗涤2次。干燥后，以孩1阵列扫描仪(GSILumonics,美国)定量分析荧光灵敏度。实际结果显示在图5中。所述结果显示具有9个鸟嘌呤的低聚:DNA以高密度固定，而其它石咸基不影响固定。[221][222]实施例10[223]在通过多分子识別不可逆固定具有1-5个连续鸟噪。令石威基的Y氐聚DNA时的岁丈率比净交方法[224]在图6显示的^f氐聚DNA固定中采用了Genetics(英国)的微阵列设备。为确定如下文表2的6种不同的固定功能基团1G,4G，7G，9G，12G，15G等的固定效率，将各4氐聚DNA以6.75pmol/ml溶于BMT点样溶液中以制备固定溶液。使用阵列插针如图1所示以所述固定溶液涂覆亚胺杯芳烃4汙生物单层玻璃基底(玻片)并用与实施例所述6所述相同的方法以l-5nL的量将低聚DNA固定在直径为150-180pm的点中。1-4小时后，以500ml的BMTWa-A-l溶液洗涤玻片一分钟，并以BMTWa-A-2溶液洗涤两次，然后干燥。为封闭其它的低聚DNA固定位点，将洗涤后的玻片放入250ml的BMT封闭溶液并处理30分钟。然后以500ml的BMTWa-A-l溶液洗涤玻片3分钟，并以BMTWa-A-2溶液洗涤两次。干燥后制备得到图4所示的低聚DNA芯片。然后，稳定连接一种直径为0.8cm的小室以进行杂交。[225]表2<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>[226][227]为了与实施例9中所用相同的带荧光DNA进4亍杂交，可在1.5ml管中配制2^1带2pmol/jxl荧光的标的DNA与58^ilBMThyb-mixA的混合溶液。将混合;容液在100。C水中加热3分4中，并i丈在冰上3分钟以进行冷却，将60fil的混合溶液放入连4妄了杂交室的玻片。然后，在恒温恒湿的烘箱中将玻片在50。C下杂交30分钟。在30。C的恒温器中以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)溶液洗涤经杂交的玻片2分钟，并以BMTWa-B-2(4xSSC)溶液在室温下洗涤2次。干燥后，以微阵列扫描仪(GSILumonics,美国)定量分析焚光灵敏度。实际结果如图6所示。所述结果显示为进行固定至少需要7个连续鸟。票呤碱基。此外，它们显示9个连续鸟嘌p令^咸基显示出最高的固定密度。[228][229]实施例11[230]通过与咪唑的竟争性反应验证低聚DNA的多分子识别固定["1]在图7显示的4氐聚DNA固定中采用了Genetics(英国)的4敛阵列设备。将碱基序列为5'-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.l)的低聚DNA以6.75pmol/ml溶于BMT点样溶液中以制备固定溶液。使用阵列插针如图1所示以所述固定溶液涂覆亚胺杯芳烃书f生物单层玻璃基底(玻片)并用与实施例所述6所述相同的方法以l-5nL的量将低聚DNA固定在直径为150-180nm的点中。以图7所示浓度组成的不同浓度咪唑涂覆该固定〉容液。3小时后，以500ml的BMTWa-A-1溶液洗涤3皮片1分钟，以BMTWa-A-2溶液洗涤两次并千燥。为封闭其它的^f氐聚DNA固定位点，将洗涤后的玻片放入250ml的BMT封闭溶液并处理30分钟。然后以500ml的BMTWa-A-l溶液洗涤玻片3分4中，并以BMTWa-A-2溶液洗涤两次。去除水分并干燥后制备得到图4所示的低聚DNA芯片。然后，稳定连接一种直径为0.8cm的小室以进4于杂交。[232][233]为了与实施例9中所用相同的带荧光DNA进行杂交，可在1.5ml管中配制2fil带2pmol/|il荧光的标的DNA与58(^1BMThyb-mixA的混合;容液。将混合溶液在100°C水中力。热3分钟，并方文在冰上3分钟以进行冷却，将60fil的混合溶液放入连接了杂交室的玻片。然后，在恒温恒湿的烘箱中将玻片在5(TC下杂交30分钟。在30。C的恒温器中以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)溶液洗涤经杂交的玻片2分钟，并以BMTWa-B-2(4xSSC)溶液在室温下洗涤2次。干燥后，以微阵列扫描仪(GSILumonics,美国)分析荧光灵敏度。实际结果如图7所示。所述结果显示咪唑通过多分子识别抑制了连续鸟嘌P令固定，且在包含了至少lOOmM的。米唑时几乎不进^i氐聚DNA的固定。也就是i兌，它们显示了咪唑通过分子识别进^亍竟争，具有9个连续鸟嘌呤碱基的低聚DNA的固定率有所下降。[234][235]在实施例8-11中用于固定，清洗等用途的溶液组成如下[236]BMT点样〉容液(4xSSC,15%丙三醇，1xPBS)[237]BMTWa-A-l(2xSSC,0.1%SDS)[238]BMTWa-A-2(0.1xSSC)[239]BMT去于闭;容液(5%牛奶酪蛋白溶液)[240]BMThyb-mixA(4xSSC,0.1%SDS，50%丙三醇，1xPBS)[241]BMTWa-B-1(4xSSC,0.1%SDS)[242]BMTWa-B-2(4xSSC)[244]实施例12[245]5，11，17，23-四氨基杯[4]芳烃的合成[246][反应式6][247][248]浅黄色固体产4勿5，11,17,23-四氨基^T、[4]芳经(TACA)可以5，11,17,23-四硝基杯[4]芳烃(TNCA)作为起始原料参照下述参考文献3所述的合成方法以75。/o的产率合成4f到。[249][250]实施例13[251]5,11,17，23-四(2,4-二曱基)二节氨基杯[4]芳烃的合成[252][反应式7][253]TACA2,4-DMTDBACA[254]将磁棒，TACA(l.Og,2.05mmol)和石與化钠(3.0g,20.5mmo1)放入干燥的圆底烧〗fe中，将混合物减压干燥。干燥后加入50ml的无水乙腈，然后将其在加热器中氮气交换下混合。5分钟后，将2，4-二曱基苄基溴(16.2g，82mmol)》文入反应容器，然后升温并搅拌。然后添加吡啶(6.62ml，82mmo1),使混合物反应6小时。反应后，使反应容器冷却至室温，将溶剂减压去除。然后，在溶解于150ml的CH2Cl2后，以水洗涤有机层两次。将干燥后的有机层减压过滤，并减压去除滤过溶液。然后以CH2Cl2/MeOH重结晶以获得2.1g的浅灰色固体产物5,11,17,23-四(2，4-二甲基)二爷氨基杯、[4]芳经(2,4-DMTDBACA)(产率80%)。[255]'HNMR(300MHz，CDC13);10.14(s，4H，ArOH)，7.287.12(m，24H,ArH),6.03(s,8H,ArH),4.24(s,16H,ArNCH2)，4.1l(d,4H,ArCH2Ar，13Hz)，3.10(d,4H，ArCH2Ar,13Hz),2.43(s,12H,ArCH3),2.28(s,12H，ArCH3)网[257]实施例14[258]5,11，17,23-四(2，4-二甲基)苯曱亚胺-杯[4]芳烃的合成[259][反应式8][260]TACA2,4-DMICA[261]将TACA(lOOmg，0.2mmol)和磁条放入干燥的圆底烧瓶。向反应容器添加15ml的乙腈并混合。添加2，4-二甲基苯甲醛(322mg,2.4mmol)后，在氮气交换和室温下混合2小时。反应后，将混合物减压过滤，并减压去除溶剂。然后将反应物溶解于适当量的CH2C12中，然后添加15ml的正己烷以获得浅棕色固体产物。将该产物再次溶解于3mlCH2Cl2中，并添加15ml的正己烷以获得155mg的亮浅棕色固体产4勿5,11,17,23-四(2，4-二曱基)苯曱亚胺-杯、[4]芳烃(2，4-DMICA)(产率81%)。[262]'HNMR(300MHz，CDC13);10.19(s,4H，ArOH)，8.54(s，8HN=CH)，7.79(d,4H,ArH),7.02(s，4H，ArH),7.01(d,4H,ArH),6.96(s,8H，ArH)，4.30(d，4H，ArCH2Ar，13Hz)，3.6l(s，4H，ArCH2Ar，13Hz),2.43(s，12H，ArCH3)，2.30(s，12H，ArCH3)网[264]实施例15[265]5,11,17,23-四(2，4-二甲基)节氨基杯[4]芳烃的合成[266][反应式9][267]2,4-DMCA2,4-TDMBACA[268]将2,4-DMICA(100mg，O.lmmol)和磁条放入干燥的圓底烧并瓦，并减压干燥。然后添加20ml的无水THF并在氮气交换下混合。IO分钟后，添加溶液1.0MBH3/THF溶液(0.8ml，0.8mmo1),然后使混合物在室温下反应3小时。反应后，减压去除溶剂，并将残留在烧瓶中的产物溶解在CH2C12中。再以0.1MHC1溶液洗涤两次后，以蒸馏水洗涤两次。将有机层分离并干燥，减压过滤并减压去除滤过溶液。然后以CH2Cl2/己烷重结晶以获得72mg的浅黄色固体产物5，11,17,23-四(2，4-二曱基)千氨基杯[4]芳烃(2,4-TDMBACA)(产率75%)。[269〗NMR(300MHz,CDC13);9.86(s，4H，ArOH)，7.33-7.18(m，12H,ArH),6.21(s，8H,ArH),4.21-4.09(m，16H,ArCH2Ar,ArNHCH2),3.58(s,4H,NH)，3.22(d,4H,ArCH2Ar),2.43(s,12H,ArCH3),2.28(s，12H,ArCH3)[270][271]实施例16[272]5,11,17,23-四(2,4-二曱基四千基)苄氨基杯[4]芳烃的合成[273][反应式10][274]2,4-TDMBACATB(2,4-DMTB)ACA[275;H夸f兹才奉和2,4-TDMBACA(500mg,0.5mmol)以及》與4匕钠(8Omg，0.5mmol)^:入干燥的圓底烧并瓦中，并减压干燥。干燥后力口入50ml的无水乙腈，然后将其在加热器中氮气交换下混合。5分钟后，向反应容器添加千基溴(l.lml,10mmol)并交换混合。向反应容器加入吡啶(0.8ml，lOmmol)，并反应6小时。反应后，使反应容器冷却至室温，然后减压去除溶剂。然后将其溶解于60ml的CH2Cl2中并以水洗、涤，然后干燥有才几层并减压过滤。然后减压去除滤过卩容液，并以CH2Cl2/MeOH重结晶以获4寻521mg的浅灰色固体产物5，11，17，23-四(2，4-二甲基四芳基)爷氨基-杯[4]芳烃(TB(2,4誦DMTB)ACA)(产率79%)。[276]!HNMR(300MHz,CDC13)10.01(s,4H,ArOH),7.35-7.10(m,34H,ArH)，6.20-6.06(br,8H，ArH),4.31-4.01(m,16H,ArCH2Ar,ArNHCH2),3.14(d,4H,ArCH2Ar)，2.45(s,12H,ArCH3),2.27(s,12H,ArCH3)[277][278]实施例17[279]5，11，17，23-四(2,4-二甲基)二千氨基杯[4]-芳烃-1,3-己醛的合成[280][反应式11][281][282]依次将》兹才奉和2,4-DMTDBACA(500mg,0.35mmol)，K2C03(487mg,3.5mmol)，石與化钠(473mg,3.15mmol)方欠入干燥的圓底烧瓶中，然后在氮气交换下向反应容器添加130ml的无水乙腈，并在加热器中混合。添加6-溴己醛(376mg，2.1mmol)后，交换混合16小时。反应后，将反应物冷却至室温，并减压去除溶剂。将反应物溶解于130ml的CH2Cl2后，将其减压过滤并减压去除滤过溶液。然后用MeOH/CH2Cl2重结晶以荻得432mg的浅黄色固体产物5,11,17,23-四(2，4-二曱基)二苄氨基杯[4]-芳烃-1,3-己醛(2,4-DMTDBACAHA)(产率76%)。[283]'HNMR(300MHz,CDC13);9.78(s,2H,CHO),7.317.04(m12H,ArH),6.11-6.02(br，8H,ArH)，4.41-4.13(m,20H,ArNCH2,ArCH2Ar),3.89(t,4H,OCH2)，3.05(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.57-2.49(t,4H,CHOCH2)，2.45-2.39(m,12H，ArCH3),2.31-2.25(m,12H,ArCH3),2.12-1.98(t，OCH2CH2)，1.78-1.62(m,8H,CH2CH2)[284][285]实施例18[286]5,11,17,23-四(2,4-二曱基四苄基)苄氨基溴-丁氧基杯[4]芳烃的合成[287][反应式12][288]2,4-TDMBACATB(2,4-DMTB)ABCA[289]将2，4-TDMBACA(500mg,0.5mmol)和无水K2C03(619mg，5.Ommol)以及石與4匕钠(674mg,4.5mmo1)》欠入干燥圓底烧弁瓦。向反应容器加入160ml的无水乙腈并在室温下混合15分钟。向反应容器加入1，4-二溴丁烷(1.03g，0.6ml，5.0mmol)并交换混合20小时。反应容器冷却至室温后，将溶剂减压去除。然后将其溶于CH2Cl2中并减压过滤。减压去除滤过溶液，在EA/己;t克中重结晶。然后减压过滤以获得610mg的淡棕色固体产物，5,11,17，23-四(2，4-二甲基四千基)苄氨基溴丁氧基杯[4]芳烃(TB(2,4-DMTB)ABCA)(产率77%)。[290]'HNMR(300MHz,CDC13);7.81(s,2H,ArOH),7.297.04(m，34H，ArH)，6.06-6.02(d,8H,ArH)，4.38-4.11(m，20H,ArNCH2，ArCH2Ar),3.89(t，4H,OCH2)，3.04(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.46-2.43(m,12H，ArCH3),2.41-2.40(m,12H，ArCH3)2.31-2.27(t，4HBrCH2)，2.16-2.06(m，8H，CH2CH2)[291][292]实施例19[293]5，11，l入23-四(2，4-二甲基四节基)爷氨基巯基-丁氧基杯[4]芳烃的合成[294][反应式13][295]TB(2,4-DMTB)ABCATB(2,4-DMTB)AMBCA[296]将TB(2，4画DMTB)ABCA(500mg，0.31mmol)和石危代乙酸钟(212mg,1.86mmol)放入干燥圆底烧瓶中。然后在其中溶解60ml的无水丙酮并在室温和氮气交4奂下声波反应90分4中。反应后，减压去除溶剂，并以30ml的CH2Cl2溶解。减压过滤后，将滤过溶液以水洗涤两次并分离和干燥有4几层。将有才几层减压过滤并将滤过〉容液减压干燥后得到的固体用乙酸乙酯/正己烷重结晶，并减压过滤获得浅黄色固体晶体。将所得的固体晶体放入圓底烧瓶并溶解于CH2C12:曱醇=5:1的混合溶液中，在室温和氮气交换下声波反应。1分钟后，加入1.0MKOH(1.5ml,1.5mmo1),声波反应30分钟。反应后，减压去除溶剂，溶解于CH2Cl2并以0.1MHC1溶液洗涤.有机层分离后，卩夸其干纟喿并减压过滤。减压去除滤过溶液的〉容剂。以CH2C12/MeOH重结晶后，可获得320mg的浅黄色5,11，17，23-四(2,4-曱氧基)苄氨基巯基丁氧基杯[4]芳烃(TB(2,4-DMTB)AMBCA)(产率73%)。[297]'HNMR(300MHz,CDC13);7.84(s，2H,ArOH),7.297.01(m,34H,ArH)，6.25-6.19(br,8H，ArH),4.36-4.1l(m,20H，ArNCH2,ArCH2Ar),3.90(t,4H,OCH2),3.05(d,4H,ArCH2Ar,13Hz),2.30(t,4H，SHCH2),2.45-2.39(m,12H,ArCH3),2.31-2.25(m,12H,ArCH3)2.05-2.02(m,CH2CH2)[298][299]实施例20[300]图8所示的氨基杯芳烃衍生物单层的制备[301]将实施例17中合成得到的2，4-DMTDBACAHA溶解于如CHCl3等有机溶剂中制备浓度为0.1-5mM:的溶液。如图8所示，将连接了胺功能基团的玻片(胺芯片)放入制备得到的溶液1-24小时并取出，分别以氯仿，丙酮和水洗涤并干燥。然后制备得到图8的氨基杯芳烃衍生物单层(A型BMT^氐聚DNA芯片)。在将上述A型放入含BH3-THF或NaBH4的MeOH还原剂中1-10分钟后，用水(去离子水)洗涤三次，在氮气氛围中千燥以制备实施例8的氨基杯芳烃衍生物单层(B型BMT低聚DNA芯片)。[302][303]实施例21[304]图9所示的金基底上氨基杯芳烃衍生物单层的制备[305]将实施例19中合成得到的TB(2,4-DMTB)AMBCA溶解于如CHCl3等有机溶剂中制备浓度为0.1-5mM的〉容液。如图9所示，将金基底》史入制备得到的溶液中l-24小时并耳又出，分别以氯仿，丙酮和水洗涤并干燥。然后制备得到图9所示的氨基杯芳烃衍生物单层。其它的氨基杯芳烃衍生物单层参照相同的方法制备。所述金基底可以各种形式使用，但一般而言，优选在玻璃，熔融硅，石圭晶片，塑^+基底等在真空4度以2-10nm的4各(Cr)或4太(Ti)等物质后以50-200nm的厚度真空镀金的基底。将所制备的金基底在即将使用前置于食人鱼溶液(强硫酸:30%过氧化氩=3:1的混合溶液)中约10秒钟-l分钟，然后以水洗涤并在氮气交换下干燥，并立即使用。所述单层的形成可通过红外线外部反射光谱(FTIR-ERS)分析。[306][307]实施例22-25所用的溶液，低聚DNA,带荧光的低聚DNA,以及c-DNA石威基序歹'J[308]表3实施例22-25所用的〉容-液BMT点样溶液14XSSC，15%丙三醇，1XPBSBMT点样溶液2600mMNH4Cl,15%丙三醇，1XPBSBMT点样溶液3500mMKCl，15%丙三醇，1XPBSBMTWa-A-l2XSSC,0.1%SDSBMTWa-A-20.1XsscBMT封闭溶液5%牛奶酪蛋白溶液BMThyb-mixA4XSSC，0.002%SDS,15%丙三醇，1XPBSBMTWa-B-14XSSC，0.1%SDSBMTWa-B-24XSSC[309][310]表4最佳碱基数序列备注5-GAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.13)探针4G5-GGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEqIDNO.14)7G5-GGGGGGGAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.15)9G5-GGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQ[DNO.16)12G5-GGGGGGGGGGOGAAATCAACCCACAGCTGCA-3'(SEQIDNO.17)5-GGGGGGGGGGGGGGGAAATCAACCCACAGCTGCA邻EQIDNO.18)Cy3-DMA5'-ey3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.19)标的67即][312沐5用于试-验的SNP序列备注SNP-A5'-GGGGGGGGGTTTACATAGCAT^TCGAGGTGGG-3'(SEQIDNO.24)探针SNP-T5-GGGGGGGGGTTTACATAGCAT工TCGAGGTGGG-3'(SEQIDNO.25)SNP-G5-GGGGGGGGGTTTACATAGCAT￡TCGAGGTGGG-3'(SEQIDNO.26)SNP-C5-GGGGGGGGGTTTACATAGCAT￡TCGAGGTGGG-3'(SEQIDNO.27)CN-A5-AATCAACCCACAGCTGAAAAAACCCACCTCGAAATGCTATGTGGAC-3'(SEQIDNO.28)检查荧光的标的CN-T5-AATCAACCCACAGCTGAAAAAACCCACCTCGAIATGCTATGTGGAC-3'(SEQIDNO.29)CN-G5'-AATCAACCCACAGCTGAAAAAACCCACCTCGAGATGCTATGTGGAC-3'(卿IDNO.30)C:N-C5'-AATCAACCCACAGCTGAAAAAACCCACCTCGA￡ATGCTATGTGGAC-3'(SEQIDNO.31)Cy3掘A5'-cy3-GTGCAGCTGTGGGTTGATT-3'(SEQIDNO.19)标的[313][314]表6用于竟争性反应<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>[35][316]表7用于最大密度试验<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>用于竟争性反应的溶液的组成(ul)<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>[319][320]实施例22[321]测定通过多分子识别不可逆固定在图12的氨基杯芳烃衍生物单层的最佳鸟。票呤碱基数量[322]-低聚DNA通过多分子识别在氨基杯芳烃衍生物单层上的固定[323]用于测定通过多分子识别在氨基杯芳烃衍生物单层上固定的鸟噤p令数量的样品溶液及浓度组成等如表3所示。首先，将10ul分别具有下文表4的1G,4G,7G,9G，12G,15G等连续鸟嘌p令石威基的各低聚DNA(100pmol/ul)和148ulBMT点样溶液3的混合溶液使用樣l阵列(GenetixQarray2)以l-5nL的量将溶液涂覆在用以固定低聚DNA的氨基杯芳烃衍生物单层上从而以150-180um的直径于室温下将其在固定室中分别固定1小时，2小时，4小时。固定后，为取出残留低聚DNA,以BMTWa-A-l(2xSSC，0.1%SDS)在室温下洗涤氨基杯芳烃书f生物单层1分钟，然后以BMTWa-A-2(O.lxSSC)洗涤，并以BMT封闭溶液(5%牛奶酪蛋白溶液)在室温下封闭30分钟。以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在室温下洗涤处理后的氨基杯芳烃衍生物单层3分钟，然后以BMTWa-A-2(O.IXSSC)的洗并瓦洗涤并干燥。-与带有焚光的DNA(Cy3-DNA)进行杂交为了与带有荧光的Cy3-DNA进4亍杂交，将杂交室连4妻至固定了低聚DNA并干燥后的氨基杯芳烃衍生物单层。然后，将2ul表4指定的Cy3-DNA(5nmol/ml)与58ul的BMThyb-mixA(4xSSC,0.002%SDS，50%丙三醇，lxPBS)混合并在100。C的水中力口热3分钟。将其在冰上放置3分钟，以微量移液管涂覆60ul，然后在50。C的恒温恒湿培养器中杂交30分钟。杂交后，为清洁氨基杯芳烃衍生物单层，以BMTWa-B匿l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗涤2分钟。然后，在室溫下两次以BMTWa-B-2(4xSSC)洗涤2分钟并使用荧光扫描仪(GSILumonics,美国)分析焚光灵敏度。实际结果显示于图12。所述结果显示当4氐聚DNA通过多分子识别被固定在氨基杯芳烃衍生物单层上时至少要求7个鸟噪。令石成基，且在使用9个鸟嘌呤石咸基时以最大密度固定。实施例23通过图14和图15的最佳空间布局确定单核苷多态性(SNP;SingleNucleotidePolymorphism)鉴另'J的i式马全-在氨基杯芳烃书f生物单层上确定SNP[331]在用于固定低聚DNA的氨基杯芳烃衍生物单层上确定SNP的试验可通过先使用孩i阵歹'J(GenetixQarray2)将9.lul的<又相同位点的一个碱基;f皮此不同的表6的低聚DNAs(100pmol/ul)与35.9ul的:BMT点样溶液1的混合溶液以150-180um的厚度和l-5nl的量进^亍:余布，然后在室温下于固定室中固定3小时。固定后，为耳又出残留寸氐聚DNA,以BMTWa-A-l(2xSSC,0.1%SDS)在室温下洗涤氨基杯芳烃书f生物单层1分钟，然后以BMTWa-A-2(O.lxSSC)洗涤，并以:BMT封闭;容液(5%牛奶酪蛋白溶液)在室温下封闭30分钟。以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在室温下洗涤处理后的氨基杯芳烃衍生物单层3分钟，然后以BMTWa-A-2(O.IXSSC)的洗瓶洗涤并干燥。-与C-DNA杂交以一企测带有荧光的DNA(Cy3-DNA)为进行杂交，在杂交室连接至单层后，将2ul表6中指定的各C-DNA(5nmol/ul)与28ul的BMThyb-mixA(4xSSC,0.002%SDS,50%丙三酉孚，lx:PBS)-混合并在100。C7K中力口热。在,水上》丈置3分钟并冷却，然后使用孩i量移液管涂^隻30ul，在55。C恒温培养器中杂交30分钟。杂交后，为清洁氨基杯芳烃衍生物单层，以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗涤2分钟，然后两次以BMTWa-B-2(4xSSC)在室温下洗涤2分钟。然后干燥并制备得到能够与带荧光DNA(Cy3-DNA)杂交的低聚DNA单层。-C-DNA与带有荧光的Cy3-DNA的杂交[337]为进行带荧光的Cy3-DNA与以C-DNA完成杂交的单层的杂交，首先，连4妄杂交室，然后将2ul表6的Cy3-DNA(5nmol/ml)与28ul的BMThyb國mixA(4xSSC，0.002%SDS，50%丙三醇，lxPBS)混合并在IO(TC水中加热3分钟。在冰上》t置3分钟并干燥后，4吏用孩t量移液管涂覆30ul，然后在45。C下于恒湿培养器中杂交30分钟。杂交后，为清洁氨基杯芳烃书f生物单层，以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗涤2分钟，然后两次以BMTWa-B-2(4xSSC)在室温下洗涤2分钟并干燥。然后使用焚光扫描仪(GSILumonics,美国)通过焚光灵4丈度确i人SNP鉴别。该结果显示于图14和15。该结果显示在具有不同石咸基的4氐聚dna#:固定的4立点上其^也DNAs未在杂交中结合。因此，该结果显示如本发明所述的^支术可通过在被固定的低聚DNA之间设置适当的空间，从而通过该低聚DNAs之间的最佳空间布局来实现快速精确的SNP鉴别。实施例24图10和11的高密度固定试^睑[341]-低聚DNA固定在氨基杯芳烃书f生物单层上固定^f氐聚DNA的方法可通过使用微阵列(GenetixQarray2)在用于固定低聚DNA的氨基杯芳烃衍生物单层上以l-5nl的量涂覆9.1ul表7的低聚DNA(100pmol/ul)和35.9ul的MBT点样溶液1的混合溶液，然后在室温下将其固定在固定室3小时。固定后，为取出残留低聚DNA,以BMTWa-A-l(2xSSC,0.1%SDS)在室温下洗涤氨基杯芳烃4汙生物单层1分钟，然后以BMTWa-A-2(O.lxSSC)洗涤，并以BMT去于闭溶'液(5%牛奶酪蛋白溶液)在室温下封闭30分钟。以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在室温下洗涤处理后的氨基杯芳烃衍生物单层3分钟，然后以BMTWa-A-2(O.IXSSC)的洗瓶洗涤并干燥。-与带有荧光的Cy3-DNA进行杂交为与带荧光的Cy3-DNA进行杂交，首先，连接杂交室，然后将2ul表7的Cy3-DNA(5nmol/ml)与28ul的BMThyb-mixA(4xSSC，0.002%SDS，50%丙三醇，lxPBS)〉、昆合后在100。C7jc中加热并放置于冰上冷却。然后，使用孩i量移液管涂覆30ul，并在50。C培养器中杂交30分钟。杂交后，为清洁氨基杯芳烃衍生物单层，以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗涤2分钟，然后两次以BMTWa-B-2(4xSSC)在室温下洗涤2分钟并干燥。然后使用荧光扫描仪将荧光灵敏度与理论荧光灵敏度进行比较和分析。-在芯片基底上干燥一定量的带荧光c-DNA,并将其与理论最大值进行比较和分析通过孩爻阵歹'J(GenetixQarray2)将表7的带荧光c-DNA以l-5nl，1/2的理论最大值(0.675fmol/nl)涂覆至氨基杯芳烃亚生物并干燥后，使用荧光扫描仪进行分析。理论荧光灵敏度和试验荧光灵壽文度比较的结果显示于图10和11中，使用理论最大值一半水平的带荧光Cy3-DNA的结果看来与通过杂交固定的^f氐聚DNA所示的结果相同。因此，该结果显示接近理论最大值的低聚DNA得到固定。实施例25[351]通过与图16的9A,9T，9G,9C-DNA的竟争性反应对^又9个鸟噤呤碱基的不可逆固定的确认试验用于竟争性反应的低聚DNA可采用表7所示的成分进行制备。jt匕时，用于竟争'性反应的不同DNAs净皮列入表8且以0#，1倍，2倍和4倍的浓度进行制备。可通过使用微量移液管将lu〗的分别通过表7所示方法制备的各低聚DNA混合溶液分别点在厚度2mm的氨基杯芳烃书t生物单层上并在室温下于固定室中固定1小时使低聚DNA得到固定。固定后，为取出残留低聚DNA,以BMTWa-A-l(2xSSC,0.1%SDS)在室温下洗涤氨基杯芳烃衍生物单层1分钟，然后以BMTWa-A-2(O.lxSSC)洗涤，并以BMT封闭溶液(5%牛奶酪蛋白溶液)在室温下封闭30分钟。以BMTWa-B画1(4xSSC,0.1%SDS)在室温下洗涤处理后的氨基杯芳烃々t生物单层3分钟，然后以BMTWa-A-2(O.IXSSC)的洗并瓦洗涤并干燥。-与带有荧光的Cy3-DNA进4亍杂交[355]为与带荧光的Cy3-DNA进行杂交，首先，连接杂交室，(4xSSC,0.002%SDS,50%丙三醇，lxPBS)混合后使用微量移液管涂覆600ul，然后在50。C培养器中杂交30分钟。杂交后，为清洁氨基杯芳烃衍生物单层，以BMTWa-B-l(4xSSC,0.1%SDS)在30。C下洗涤2分钟，然后两次以BMTWa-B-2(4xSSC)在室温下洗涤2分钟并千燥。然后使用荧光扫描仪(GSI)确认荧光灵敏度。所述结果显示于图16中。该结果显示4又9个鸟嘌p令通过多分子识别一皮不可逆固定而其它碱基不论是否连续均不会对固定产生较大影响。该结果作为实际试验结果显示了能获得可复制杂交结果的低聚DNA芯片的制备才支术，其中用于杂交的;烕基不参与固定且仅连续特定石成基序列参与固定，从而始终维持杂交必需的碱基数量。工业适用性本发明解决了通过高i"介^f氐聚DNA与连接了传统化学结合法中常用的胺功能基团的醛玻片(醛芯片基底)之间的化学反应而在醛芯片基底上固定低聚DNA以制备低聚DNA芯片时产生的许多问题，从而使任何人均能轻易地制备低聚DNA芯片。使用连接了高价功能基团的低聚DNA制备低聚DNA芯片时在固定步骤中很难荻得再现性，因此研发的周期很长，且这一点阻止了"i午多生物产品乂人研发4争向商业^:。it匕夕卜，通过测i式成百上千种低聚DNA碱基序列选择可带来最佳杂交结果的低聚DNA时，由于研发经费的负担曾放弃了许多开发中的产品。如图3所示，由于本发明中的连续鸟嘌呤石成基通过多分子识别固定在亚胺杯芳烃衍生物单层(BMT亚胺芯片)上，在相同条件下固定的低聚DNA的密度始终一致，从而显示了极高的再现性。此外，在图3中，通过将连续鸟。票呤石咸基固定在基底表面所形成的空间，应当与基底表面结合的c-DNA可通过自由进入而与被固定的低聚DNA之间进行杂交。相应的，它对于密集固定了低聚DNA的传统j氐聚DNA芯片的优势在干可G行杂交，从而支持快速诊断。通过分子识别固定的低聚DNA通过多分子识别在::容'液中^皮固定至BMT亚胺芯片，因此可^f吏用^氐聚DNA制备高密度固定低聚DNA芯片，即使该低聚DNA的密度为常规^K平的1/3-1/10。此外，在本发明中约需要2-4小时固定低聚DNA,然后进行洗涤和干燥。因此，它可使低聚DNA芯片的制备变得简便和快速。特别地，在图4和6中，低聚:DNA被通过9个连续鸟噪p令石咸基的多分子识别不可逆固定在亚胺杯芳烃书f生物自组装单层上，且杂交的荧光分析结果显示固定低聚DNA的固定密度为传统方法的5至304咅。因此，本发明可比通过传统低聚DNA固定制备低聚DNA芯片的技术以更快的速度制备低聚DNA芯片，且可以通过高再现水平降j氐;开发成本。此外，它是一种可以传统制备方法1/3-1/5的成本制备产品的划时^C的新型4支术。相应地，随后它可应用于各种基于本发明的DNA芯片制备中。此外，作为本发明的另一方面，本发明是一种能够解决现有的DNA芯片制备技术中所呈现的各种问题(例如，根据传统技术无法进ff高速杂交；无法确Y呆-〖t断单冲亥苷多态性(SNP)的4支术；由于难以维」持如A,C，G等三个石咸基中的胺功能基团与醛芯片基底的醛功能基团之间进行的化学键合所显示的杂交结果，难以获得DNA芯片的再现性；难以形成^氐聚DNA均一固定在制备芯片上的均匀密度固定)的新型技术。[365]本发明提供了一种能够不可逆分子识别连续鸟噪呤基团的氨基杯芳烃衍生物，以其自组装单层形式制备的低聚DNA芯片基底的技术，通过在芯片基底表面的自发分子识别不可逆固定低聚DNA制备的低聚DNA芯片及其制备技术。如所述实施例和附图所示，该固定4支术可自动地适当地在石咸基间维持与连续石威基4皮不可逆固定在底部时该碱基被排列所占据的空间相当的空间。该空间为足以使c-DNA在杂交过程中自由进入芯片基底底部的空间，因此可高速进行杂交。与此同时，杂交时该用于结合石威基的碱基数量可始终维持在最大值；因此，这是一种可通过高度特异性的杂交在开-关水平上确认单独》威基区别的新型技术。此外，本发明提供了一种具有最大密度水平同时维持适当空间水平的固定低聚DNA单层，其中各类低聚DNA不经任何处理被连接至固体基底(例如具有胺功能基团的玻璃基底(胺玻片)或是金基底(金薄膜或金))得到固定，也即是，亚胺衍生物提供了用于固定低聚DNA的作为单层生产的芯片基底(即，生产低聚DNA可再现的产品的〗氐聚DNA芯片所必需的基础才支术。此外，才艮据本发明，低聚DNA可通过一种新型#支术(即，多分子识别)在水溶液中无空余空间的状态下固定。最大量的4氐聚DNAs因此得到固定，即，本发明是一种可使低聚DNAs自发组装从而在可进行高速杂交同时以最大密度固定低聚DNAs的新型技术。因此，本发明提供了一种具有最高灵敏度水平从而可通过在低浓度下识别c-DNA进行诊断的低聚DNA芯片的生产技术。同时，由于低聚DNA始终以最大密度固定，它提供了将低聚DNA芯片制备为产品所必需的具有再现性的低聚DNA芯片的生产技术。常规使用的芯片基底可通过带有高价反应器的低聚DNA生产，且难以在固定低聚DNA的阶段获得生产率。因此，该研发的周期4艮长，此外，这成为该研发无法进行至生产阶l爻的原因。通过采用能4吏生产更便捷的本发明的识别分子技术，并通过验证成百上千的低聚DNA碱基序列，可选4奪能带来最大杂交结果的低聚DNA以降低低聚DNA芯片开发中的研发负担。此外，本发明4是供了一种通过获取生产率可以快速即时推出最佳低聚DNA芯片的新型技术。如果采用本发明提供的生产芯片的基础技术，可进行各种基因芯片的快速生产和商品4匕。此夕卜，本发明可以通过使用仅为表面固定低聚DNAs量的3至5倍的^氐聚DNAs，通过分子识别固定4氐聚DNAs乂人而生产高密度低聚DNA芯片。因此，本发明使仅用传统低聚DNA芯片生产1/10-1/100的成本生产低聚DNAs成为可能，从而节省了大量的生产成本。理吸附的传统低聚DNA固定方法，它是一种通过分子识别定义(即，多分子识別)使用连续鸟嘌呤石成基在固体基底上不可逆固定低聚DNA的新型方法。权利要求1.一种具有以下式1的亚胺杯芳烃衍生物[式1](其中R1，R2，R3和R4独立选自组合-H，-CH3，-C2H5，-C3H7，-OCH3，-Cl，-C6H5和-COOR，并且在所述-COOR中，R代表-CH3或-C2H5)。3.一种具有以下式2的亚胺杯、芳烃书f生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>[式2](其中R,,R2,R3和R4独立选自组合-H,-CH3,-C2H5，-C3H7,-OCH3，-Cl，-0515和-€:0011,其中R代表-CH3或-C2H5，并且所述的Y,,Y2，Y3和Y4独立选自组合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m—CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH，-(092)111画(36114國(0^2)(;-2和隱0:0-((^只2)01.1-061^4-(CH2)C-Z(其中n=2-15,m=1-10,c=0-10,Z=-SH，-CHO，-COOH或-NH2))。一种由下列式3的5,11,17,23-四氨基杯[4]芳烃和下列式4的芳香醛反应制备如权利要求1所述的亚胺杯芳烃衍生物的方法<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>(其中R选自組合-H,-CH3,-C2H5，-C3H7,-OCH3，-Cl，-C6H5和画COOR',其中R'代表一CH3或—C2H5)。4.一种通过如权利要求1所述的亚胺杯芳烃衍生物与双功能化合物反应制备如权利要求2所述的亚胺杯芳烃衍生物的方法，其中所述的双功能化合物选自组合X-(CH2)n-CH二O,X-(CH2)n-SH,X-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,X-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH,X-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z以及X画CO-(CH2)^-C6H4-(CH2)C-Z,其中n=2-15，m=l-10,c=0-10，X=-C1，-Br,-I或-OS02C6H4CH3,Z=-SH,-CHO,-COOH或-腿2。5.—种通过连接亚胺杯芳烃衍生物制备的自组装单层固体基底，其中一种碌』事基团^皮连接至金基底。6.—种通过亚胺键连接亚胺杯芳烃衍生物与选自玻璃、硅晶片和晶体的固体基底而制备得到的自组装单层固体基底。7.—种通过选自酯，醚和酰胺《定的化学4建连接亚胺杯芳烃衍生物与选自玻璃，硅晶片和晶体的固体基底而制备得到的自组装单层固体基底。8.—种通过固定低聚DNA制备得到的低聚DNA芯片，其中至少7个连续鸟。票呤碱基通过多分子识别被连接至如权利要求5-7任意一项所述的自组装单层固体基底。9.一种通过固定低聚DNA制备低聚DNA芯片的方法，其中至少7个连续鸟嘌呤碱基通过多分子识别被连接至如权利要求5-74壬意一项所述的自组装单层固体基底。10.如权利要求5-7任意一项所述的通过下列式3的5,11,17,23-四氨基杯[4]芳烃的亚胺衍生物制备的自组装单层固体基底，其中氮^皮连4妻在杯、芳烃的5,11,17,234立上[式3]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>11.一种通过固定低聚DNA制备得到的低聚DNA芯片，其中至少7个连续鸟嘌呤-咸基通过多分子识别^皮连4妻至如—又利要求10所述的自组装单层固体基底。12.—种通过固定低聚DNA制备低聚DNA芯片的方法，其中至少7个连续鸟噤呤碱基通过多分子识别—皮连接至如权利要求10所述的自组装单层固体基底。13.—种具有以下式5的氨基杯芳烃布于生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(中Ri,R2，R3,1^4,R5,R^，R7,Rs,R，i,R'2，R'3，R'4，R，5,R，6，R'7，R'8独立选自组合画H,-CH3,-C2H5,-C3H7,-OCH3,-Cl，-C6H5，-OH，-OCH2CH3,-Br,-CF3，-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3,-OC6H4C(CH3)3,-OC6H4CF3，-OC6H4Cl,-OCOCH3，-NHCOCH3,-CONHCH3,-CN,COOH和-COOR，其中Rft表一CH3或-C2H5)。14.一种具有以下式6的氨基杯芳烃书f生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>[式6]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>(其中R1,R2,R3,R4,R5,R6，R7，R8,R'1，R'2，R'3,R'4，R's,R'6，R'7,R'8独立选自组合画H，-CH3，-C2H5,-C3H7,-OCH3,-CI,-C6H5，-OH,-OCH2CH3,-Br,-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3,-OG6H4C(GH;03,-OG6H4GF3,-OG6H4Gl,-OCOCH3,-NHCOCH3,-CONHCH3,-CN,COOH，和-COOR,其中R^f义表一CH3或-C2H5，且所述Yt,Y2，Y3和丫4独立选自组合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,-(CH2CH2。)m-CH2CH2-SH，-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z，和-CO-(CH2)m-l-C6H4-(CH2)C-Z(其中n=2-15，m=1,10，c=0-10，Z=-SH,画CHO,-COOH,-NH2,且-C6l"Lr和C6H5被定义为苯基基团))。15.—种具有以下式7的氨基杯芳烃纟汙生物:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>[式7](其中R,,R2,R3,R4，R5,R6,R7,R8,R、R'2,R'3，R'4，R's,R'6,R'7，R'8独立选自组合-H,-CH3,-C2H5，-C3H7，-OCH3，-Cl，-C6H5,-OH,-OCH2CH3,-Br,-CF3，-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3，-OG6H4C(GH3)3,-OG6H4CF3,-OG6H4Gl,-OCOCH3，-NHCOCH3,-CONHCH3，-CN，COOH和-COOR，其中R代表-CH3或—C2H5)。16.—种具有以下式8的氨基杯芳烃右f生物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>[式8]、+2Y3Y4(其中R,，R2,R3，R4,R5,R6,R7，R8，R'i,R'2,R'3，R'4，R's,RV"R'7,R'8独立选自组合-H，-CH3,-C2H5,-C3H7，-OCH3,-Cl，-C6H5,-OH,-OCH2CH3,-Br,-CF3,-OCH2C6H5,-OC6H5,-OC6H4CH3,-OC6H4C(CH3)3,-OC6H4CF3，-OC6H4Cl,-OCOCH3，-NHCOCH3，-CONHCH3，-CN,COOH,和-COOR,其中R4戈表—CH3或—C2H5,寸旦R!,R2,R3，R4,R5,R6,R7,R8,R'i,R'2,R'3,R'4,R's,R'6，R'7,R'8不同时为-H,且所述Y，，Y2,Y3和Y4独立选自组合-H,-(CH2)n-CH=0,-(CH2)n-SH,-(CH2CH20)m-CH2CH2-CH=0,-(CH2CH20)m-CH2CH2-SH,-(CH2)m-C6H4-(CH2)c-Z,和-CO-(CH2)m--C6H4-(CH2)C-Z(其中n=2-15，m=1-10,c=0-10，Z=-SH,-CHO，-COOH,-NH2，且—06]^4-和C6H5^皮定义为苯基基团))。17.—种通过连接氨基杯芳烃衍生物而制^^的自组装单层固体基底，其中如权利要求14或16所述的氨基杯芳烃衍生物中的石克醇基团被连接至金基底。18.—种通过将如权利要求14或16所述的氨基杯芳烃书f生物中的末端基团连接一种醛功能基团的氨基杯芳烃衍生物与选自玻璃，硅晶片和晶体的通过亚胺键和胺键连接了胺功能基团的固体基底相连接而制备得到的自组装单层固体基底。19.一种通过将如权利要求14或16所述的氨基杯芳烃衍生物中的末端基团连4妄一种醛功能基团的氨基杯芳烃衍生物与选自玻璃，硅晶片和晶体的通过选自酯，醚和酰胺4定的化学键连接了胺功能基团的固体基底相连接而制备得到的自组装单层固体基底。20.—种通过固定低聚DNA制备得到的低聚DNA芯片，其中至少7个连续鸟嘌呤碱基通过多分子识别被连接至如权利要求17-19任意一项所述的自组装单层固体基底。21.—种通过固定低聚DNA制备低聚DNA芯片的方法，其中至少7个连续鸟嘌p令^成基通过多分子识别^皮连4妻至如—又利要求17-19任意一项所述的自组装单层固体基底。22.如权利要求17-19任意一项所述的通过下列式9的5,11,17,23-23.—种通过固定低聚DNA制备得到的低聚DNA芯片，其中至少7个连续鸟嘌p令;成基通过多分子识别一皮连4妾至如纟又利要求22所述的自组装单层固体基底。24.—种通过固定低聚DNA制备低聚DNA芯片的方法，其中至少7个连续鸟嘌呤石咸基通过多分子识别纟皮连接至如权利要求22所述的自组装单层固体基底。四氨基杯[4]芳烃的胺衍生物制备的自组中氮被连接在杯芳烃的5,11,17,23-位上:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>[式9]全文摘要本发明涉及新型亚胺杯芳烃衍生物，其制备方法，以及由该方法制备的自组装单层，使用该自组装单层固定低聚DNA的方法，以及由该方法制备的低聚DNA芯片。此外，本发明涉及新型氨基杯芳烃衍生物，其制备方法，以及由该方法制备的自组装单层，通过液相中所述自组装单层上的分子识别自动固定低聚DNA的低聚DNA固定方法，以及由该方法制备的低聚DNA芯片。文档编号C07C251/24GK101309896SQ200680038071公开日2008年11月19日申请日期2006年5月11日优先权日2005年10月13日发明者宋锦秀,金亨燮,金正勋,金泰善申请人:博美利克斯技术公司