苯骈呋喃衍生物及其应用的制作方法

专利名称：：苯骈呋喃衍生物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及有机化学领域，具体涉及呋喃类化合物，特别是一种苯骈呋喃衍生物。胡枝子为豆科胡枝子属Lespedezavirgata(Thurb)DC的细梗胡枝子的全草，广泛分布于全国各省区。对于胡枝子属植物的药用价值早在《救荒本草》、《分类草药性》、《滇南本草》中就有记载，其茎叶及根入药，味微苦，性平，具强筋益肾，健脾祛湿，润肺清热之功效，在民间广为应用，为湖北民间治疗肾炎的习用药材，用于治疗慢性肾小球肾炎、肾盂肾炎等病症。以其为主药的肾炎四味片对慢性肾小球肾炎疗效肯定，副作用小，己载入国家基本医疗保险甲类药品目录，鉴于肾炎四味片确切的疗效，该药广泛被研究人员用于同类课题研究中的阳性对照药。自上世纪30年代末至今，国内外许多学者对胡枝子的化学成分进行了大量的研究，已鉴定了生物碱、黄酮、甾醇等多种化学成分，对肾功能不全均有疗效，但迄今还未发现活性特另(J显著的成分。《StudiesonthecnstituentsofLespedezacyrtobotryaMIQIIThestructuresofHaginniC,HaginiD,andLespedeolC》一文公幵了一种苯骈呋喃类化合物，该化合物具有以下分子结构其中R为H或0C0CH3(Toshiomiyase,AkiraUeno，TadatakaNoro，andSeigoFukushima.ShisuokaCollegeofPharmacy2-2-1,Oshika,sjosuoka,422,Japan)。当R为H时，该化合物分子式为C,凡。04,命名为2-(2'，4'-二羟基苯基)-5-羟基苯骈呋喃，为淡棕色针晶，熔点为207-208°C,三氯化铁实验及重氮化实验阳性，该化合物是从短梗胡枝子(LespedezacyrtobotryaM1Q.)木质部甲醇提取液的乙酸乙酯部位分离得到，是一种植物防卫素(Phytoalexin);当R为0C0CH3时，该分子式为C2。Hl607,其熔点为154_156°C，可以通过将2-(2',4'-二羟基苯基)-5-羟基苯骈呋喃经醋酸酐及吡啶进行乙酰化反应获得。国知局于2008年1月9日公布了一项发明专利申请(公开号CN101100463)，该申请公开了一种如下式所示结构的苯骈呋喃衍生物，该苯骈呋喃衍生物是从细梗胡枝子中分离出来
背景技术：
：的，分子式为C17H1606，分子量为316，常温常压下为黄绿色无规则粉末，具有治疗肾炎和抗氧化作用，可用于治疗肾炎。H。Z^v^^
发明内容本发明的目的是提供一种具有药用价值的苯骈呋喃衍生物。本发明实现上述目的的技术方案是一种苯骈呋喃衍生物，其分子结构如式I所示CI)本发明所述的苯骈呋喃衍生物首次分离于细梗胡枝子[Lespedezavirgata(Thurb)DC]，分子式为C,8HnA，分子量为344，常温常压下为墨绿色无规则粉末。本发明所述的苯骈呋喃衍生物可从细梗胡枝子全草中分离得到，具体的方法为(1)将干燥的细梗胡枝子全草粉碎后，用95%乙醇渗漉提取，回收提取液中的乙醇得到浸膏，所得浸膏先用石油醚萃取，取水相，再用氯仿萃取，取水相，然后用乙酸乙酯萃取，取水相，最后用正丁醇萃取，取正丁醇部分；(2)将正丁醇部分经正向硅胶柱，依次用体积比分别为98:2、95:5和9:1的氯仿和甲醇的混合物梯度洗脱，收集氯仿和甲醇体积比为9:1的洗脱液，接着经ODS反相柱层析，依次用浓度为30%、50%、60%的甲醇梯度洗脱，收集50%甲醇的洗脱液，再经SephadexLH-20柱层析，用纯甲醇洗脱，收集洗脱液回收溶剂后经反相柱层析，用体积比为6:4的甲醇-水混合物洗脱，洗脱液经层析条件为氯仿甲醇=9:i、碘显色的薄层层析检测，取薄层层析后碘显色为蓝黑色的洗脱液，除去甲醇后得到墨绿色结晶。本发明所述的苯骈呋喃衍生物具有治疗肾炎和清除自由基作用，可用于制备治疗肾炎的药物，该药物由式I所示的化合物和药用辅料组成，可以是注射剂、口服片剂、胶囊等。为了更好地理解本发明，下面将通过体外细胞实验来证明本发明具有的技术效果。一、体外肾小管上皮细胞实验1、材料和方法正常人肾小管细胞株(HK-2)购自武汉中国典型培养物保藏中心。HK-2于37。C温水中解冻，1000r/min离心5min，弃上层冻存液，力n10%FBSDMEM-F,2培养液，37°。5%<:02条件下静置培养，常规换液，细胞融合80%以上时，0.25%胰蛋白酶消化、传代，倒置显微镜下每天观察细胞形态，取4-6代细胞用于实验。2、药物干预及实验分组空白对照组10%FBSDMEM/F12培养液；模型组(TGF-(5,)组10。/。FBSDMEM/F12培养液+TGF-(3"8ng/ml);苯那普利组Benazepril(10mg/L)+TGF-卩,(8ng/ml);DPI组(DPI，1Onmol/L)十TGF-,ng/ml);本发明高剂量组本发明苯骈呋喃衍生物(l00吗/ml)+TGF-p"8ng/ml);本发明中剂量组本发明苯骈呋喃衍生物(50吗/ml)+TGF-^(8ng/ml);本发明低剂量组本发明苯骈呋喃衍生物(25pg/ml)+TGF-PK8ng/ml)3、共聚焦显微镜半定量测定细胞内ROS细胞内ROS测定方法参照TMochizuki的方法(TMochizuki，FurutaS，MitsushitaJ，etal.InhibitionofNADPHoxidase4activatesapoptosisViatheAK7/apoptosissignal-regulatingKinase1pathwayinpancreaticcancerPANC-1cells[J].Oncogene,2006，25，3699-3707)。荧光探针二氯荧光素二乙酯H2-DCFDA在体内被酯酶水解，形成无荧光的还原型二氯荧光素DCFH，后者对活性氧敏感，可迅速被氧化成为具有高荧光的物质氧化型DCF。利用共聚焦显微镜可直接观察细胞内活性氧的产生，荧光强度反映了氧化应激的程度。取第三代HK-2细胞于六孔板中爬片培养至80%以上融合生长后，剥夺血清24小时同步化后，除空白组外其余按分组给予药物及NADPH氧化酶抑制剂DPI(lpmol/L)干预24小时后，将各组细胞用lOpmol/LH2-DCFDA于37。C避光孵育30分钟，用D-Hanks缓冲液清洗三次，激光共聚焦显微镜观察，激发波长488nm，发射波长510nm，摄像。测定各组荧光强度值，并以对照组荧光强度为基线，计算其他各实验组相对荧光强度值。4、免疫细胞化学法检测HK-2FN表达将HK-2制成悬液，按lxioVL'接种到预先放置有6x22mm盖玻片的六孔板中，置C02孵箱培养1天，待细胞接近长成单层，按第2节分组处理后按以下方法检测HK-2FN表达A.实验步骤(1)培养于六孔板中爬片的细胞用冷丙酮固定20分钟(2)每孔加50pl3%H202孵育10min,清除内源性过氧化氢酶的活性(3)PBS洗三次，各3min(4)滴加封闭用正常兔血清工作液50pl，室温孵育15min，倾去(5)各实验组滴加一抗50pl，对照组滴加PBS50pl，4。C孵育过夜(6)PBS冲洗三次，各3min(7)滴加辣根酶标记山羊抗小鼠IgG50pl，37。C孵育15min(8)PBS冲洗三次，各3min(9)滴加二抗5(^1，37。C孵育lh(10)PBS冲洗三次，各3min(11)DAB溶液显色10min，在显微镜下掌握染色程度(12)自来水冲洗(13)苏木素复染15秒，盐酸酒精分化(14)自来水冲洗15min(15)脱水、透明，封片，镜检B.结果判定以细胞浆出现棕褐色颗粒为阳性细胞，釆用光学显微镜及成像系统(dympus)分析，用40倍物镜测定细胞免疫反应FN阳性的细胞百分数，计数不少于200个细胞，计算FN阳性细胞数占总细胞数的百分比值。5、结果(1)共聚焦显微镜半定量测定细胞内ROS:共聚焦显微镜下，可以观察到正常组HK-2细胞内有较弱的ROS绿色荧光，TGF-(3t刺激HK-2细胞24小时后，与正常组比较可显著增加细胞内ROS的产生(P=0.000);DPI(10拜ol/L)和Lespedezavirgatol不同浓度给药组作用于细胞24小时后，与Control组比较，可显著逆转由TGF-P,诱导的ROS的增加，差异有显著的统计学意义(P=0.000)，如表1所示。表l本发明化合物对共聚焦显微镜半定量检测各组细胞内ROS水平(X±S)GroupROS空白对照组模型组DPI组本发明高剂量组60.667±3.512246細士8.185"46.000±4.000**55.333±2.082**本发明中剂量组3101.667±2.517**本发明低剂量组3123.000±4.583**注F=797.333，iM).00()A尸〈0.05，▲▲尸<0.01VSNormal;*尸<0.05，**尸<0.01VSControl。(2)免疫细胞化学法检测HK-2细胞FN表达正常对照组HK-2细胞中FN的表达很少，模型组加入TGF-p！8ng/ml24h后，HK-2细胞浆内FN表达呈强阳性，与正常组比较有显著性差异(/^0.000)，Lespedezavirgatol干预后，随着浓度的增加(25，50,100昭/ml)，FN表达部分被抑制，与模型组比较，有显著性差异(P-0.000)。阳性对照药Benazepril亦作出相似结果。表2实验各组免疫组化FN表达情况(文士S)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>具体实施例方式例1:从细梗胡枝子中提取分离本发明化合物。将干燥的细梗胡枝子全草40kg，粉碎后，用95%乙醇渗漉提取，回收提取液中的乙醇得到浸膏，所得浸膏先用石油醚萃取，取水相，再用氯仿萃取，取水相，然后用乙酸乙酯萃取，取水相，最后用正丁醇萃取，将正丁醇部分经正向硅胶柱，依次用体积比分别为98:2、95:5、9:1的氯仿和甲醇混合物梯度洗脱，收集氯仿和甲醇体积比为9:1的洗脱液，经ODS反向柱层析，依次用浓度为30%、50%、60%的甲醇梯度洗脱，收集50%甲醇的洗脱液，经SephadexLH-20柱层析，用纯甲醇洗脱，收集溶液回收溶剂，经反相柱层析，甲醇-水(6:4)洗脱，洗脱液经层析条件为氯仿甲醇=9:1、碘显色的薄层层析，薄层层析后碘显色为蓝黑色的洗脱液，除去溶剂得到墨绿色结晶0.78g(0.02g/kg)。鉴定分子式C,sHuA，墨绿色无规则粉末，服-ESI-MS:344.0433(M)+.'H-刚R、l3C-刚R检测的数据见表2。表2'H-NMR(400MHz)13C-NMR(100MHz)(DMSO-dfi)Spectraldate<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>例2:将例1得到的化合物，采用药用针剂的制备方法制成注射液将本化合物lOOOtng溶于lOOOml的生理盐水中，加热溶解,混合均匀后灌入瓶中，密封，消毒配成2mg/2ml—支的注射液。本品用于静脉注射(iv.)，成人6mg/天，相当于3支；小儿常用量按体重0.05mg/kg/天。例3:将例1得到的化合物，采用药用针剂的制备方法制成注射液.将本化合物2000mg溶于lOOOml的生理盐水中，加热溶解，混合均匀后灌入瓶中，密封，消毒制成4呢/2ml—支的注射液。本品用于静脉注射(iv.),成人6呢/天，相当于1.5支；小儿常用量按体重0.05mg/kg/天。例4:将例1得到的化合物，采用药用片剂的制备方法制成片剂.将本化合物1600mg,加淀粉13440mg，加乳糖8960mg混合均匀，制成片重为150mg的片剂，每片含本品10mg。用法口服。成人常用量一次20mg(2粒)，每六小时一次；小儿常用量按体重一次0.5mg/kg,每六小时一次。例5:将例1得到的化合物采用药用片剂的制备方法制成片剂，将本化合物3200mg,加淀粉17280mg，加乳糖11520mg混合均匀，制成片重为200mg的片剂，每片含本品20mg。用法口月艮。成人常用量一次20mg(l粒)，每六小时一次；小儿常用量按体重一次0.5mg/kg，每六小时一次。例6:将例1得到的化合物采用药用胶囊的制备方法制成胶囊.将本化合物3200mg，加淀粉11520mg，加乳糖17280mg混合均匀制成颗粒，灌装成每粒内容物为200mg的胶囊,每粒胶囊含本品20mg。用法口服。成人常用量一次20mg(l粒)，每六小时一次；小儿常用量按体重一次0.5mg/kg，每六小时一次。权利要求1、一种苯骈呋喃衍生物，其分子结构如式I所示2、权利要求1所述的化合物的制备方法，该方法由以下步骤组成-(1)将干燥的细梗胡枝子全草粉碎后，用95%乙醇渗漉提取，回收提取液中的乙醇得到浸膏，所得浸膏先用石油醚萃取，取水相，再用氯仿萃取，取水相，然后用乙酸乙酯萃取，取水相，最后用正丁醇萃取，取正丁醇部分；(2)将正丁醇部分经正向硅胶柱，依次用体积比分别为98:2、95:5和9:1的氯仿和甲醇的混合物梯度洗脱，收集氯仿和甲醇体积比为9:1的洗脱液，接着经ODS反向柱层析，依次用浓度为30%、50%和60%的甲醇梯度洗脱，收集50%甲醇的洗脱液，再经SephadexLH-20柱层析，用纯甲醇洗脱，收集洗脱液除去溶剂后经反相柱层析，用体积比为6:4的甲醇-水混合物洗脱，洗脱液经层析条件为氯仿甲醇=9:i、碘显色的薄层层析检测，取薄层层析后碘显色为蓝黑色的洗脱液，除去甲醇后得到墨绿色结晶。3、权利要求1所述的化合物在制备治疗肾炎的药物中的应用。4、一种治疗肾炎的药物，该药物由质量百分比含量为0.110°/。的权利要求1所述的化合物和9099.9%的药用辅料组成。5、根据权利要求4所述的药物，其特征是所述药物是注射剂、口服片剂或胶囊。全文摘要本发明提供了一种分子结构如式I所示的苯骈呋喃衍生物，该化合物首次分离于细梗胡枝子[Lespedezavirgata(Thurb)DC]，分子式为C₁₈H₁₆O₇，分子量为344，常温常压下为墨绿色无规则粉末。经实验证明，本发明化合物具有治疗肾炎和抗氧化作用，可用于制备治疗肾炎的药物。文档编号C07D307/80GK101407506SQ20081021922公开日2009年4月15日申请日期2008年11月19日优先权日2008年11月19日发明者王彩云,邓虹珠,艳陈,骥马申请人:南方医科大学