专利名称：一种检测三聚氰胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测三聚氰胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机化 工原料。纯白色单斜棱晶体，无味。溶于热水，微溶于冷水，极微溶于热乙醇，不溶于醚、苯 和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶等。在一般情况下较稳定，但在 高温下可能会分解放出氰化物。由于三聚氰胺的分子式中含氮量为66%左右，而蛋白质的平均含氮量为16%左 右，因此，常被一些不法商人用作食品添加剂，以提升食品检测中的蛋白质含量指标，因此 三聚氰胺被俗称为“蛋白精”。虽然，目前广泛认为三聚氰胺毒性比较低微，大鼠口服的半 数致死量大于3g/kg体重，但长期摄入仍不容忽视，会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾 部结石，并可进一步诱发膀胱癌。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的 《国际化学品安全手册》第三卷和国际化学品安全卡片说明长期或反复大量摄入三聚氰胺 可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。因此，需要灵敏、准确、快速的检测方法。目前检测三聚氰胺含量的化学方法有高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法， 由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种三聚氰胺单克隆抗体。本发明所提供的三聚氰胺单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No. 3394的三聚氰 胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL分泌产生的。保藏编号为CGMCC No. 3394的三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL也属于本发 明的保护范围。所述三聚氰胺单克隆抗体在制备检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒中的应用也属 于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，为下述1) ,2)、3)或4)中任一 所述酶联免疫试剂盒1)酶联免疫试剂盒中三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物、所述三聚氰胺单克隆 抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；2)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原的酶标记物、所述三聚氰胺单克隆抗体 和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；3)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原的酶标记物、所述三聚氰胺单克隆抗 体；其中，所述三聚氰胺单克隆抗体作为包被原；4)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物、所述三聚氰胺单
4克隆抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原；
所述三聚氰胺半抗原的结构式如式I所示
权利要求
1.一种三聚氰胺单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC No. 3394的三聚氰胺单克隆抗体 杂交瘤细胞株MAL分泌产生的。
2.保藏编号为CGMCCNo. 3394的三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL。
3.权利要求1所述三聚氰胺单克隆抗体在制备检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒中的 应用。
4.一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，为下述1)、2)、；3)或4)中任一所述酶联免疫 试剂盒1)酶联免疫试剂盒中三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1中所述三聚氰 胺单克隆抗体和酶标记抗抗体；其中，所述偶联物作为包被原；2)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原的酶标记物、权利要求1中所述三聚氰胺单 克隆抗体和抗抗体；其中，所述抗抗体作为包被原；3)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原的酶标记物、权利要求1中所述三聚氰胺单 克隆抗体；其中，所述三聚氰胺单克隆抗体作为包被原；4)酶联免疫试剂盒中包括三聚氰胺半抗原与载体蛋白的偶联物、权利要求1中所述三 聚氰胺单克隆抗体的酶标记物；其中，所述偶联物作为包被原；所述三聚氰胺半抗原的结构式如式I所示CH2-CH2-CH2-coohhn人人h2n n、nh2(式i)。
5.根据权利要求4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为卵清蛋白、牛 血清白蛋白、人血清白蛋白、鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、兔血清蛋白或血蓝蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述酶联免疫试剂盒中 包括三聚氰胺标准品溶液、底物显色液、洗涤液和样品稀释液；所述三聚氰胺标准品溶液为浓度分别为ο μ g/L、5 μ g/L、20 μ g/LUOO μ g/L、500 μ g/L 和2500 μ g/L的三聚氰胺标准品溶液；所述底物显色液由A液和B液组成，所述A液为浓度为1. 5% -2. 5%的过氧化脲的水 溶液，B液为浓度为0. 5% -1. 5%的四甲基联苯胺的水溶液；所述洗涤液为浓度为0. 8% 1. 2%的吐温20和浓度为0. 3% -0. 7%的叠氮化钠的 0. 005M-0. 015M磷酸盐缓冲液；所述样品稀释液为20X (0. 03mol/L-0. 05mol/L)的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求4-6中任一所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述抗抗体为羊抗 鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。
8.—种检测样品中三聚氰胺的方法，包括如下步骤1)将待测样品进行前处理，得到待测样本溶液；2)用权利要求4-7中任一所述酶联免疫试剂盒对所述待测样本溶液进行检测；所述前处理的方法为下述幻、13)、(3)、(1)、6)和f)中的任一a)所述待测样品为奶粉；每取0.8g-l. 2g所述奶粉溶于8ml-12ml权利要求6中所述 样品稀释液中，混合均勻，离心，取上清液，即为待测样本溶液；b)所述待测样品为牛奶；将所述牛奶与权利要求6中所述样品稀释液按照1 (9-11) 的体积比混勻，得到的溶液即为待测样本溶液；c)所述待测样品为蛋；将每0.8g-l. 2g蛋用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提取液 即为待测样本溶液；d)所述待测样品为宠物食品；将每1.8g-2. 2g宠物食品用8ml-12ml提取剂进行提取， 得到的提取液即为待测样本溶液；e)所述待测样品为饲料；将每0.8g-l. 2g饲料用8ml-12ml提取剂进行提取，得到的提 取液即为待测样本溶液；f)所述待测样品为小麦面筋；将每0.lg-0. 3g小麦面筋用8ml-12ml提取剂进行提取， 得到的提取液即为待测样本溶液；所述提取剂的组成为由Na2HPO4 · 12H20、NaH2PO4 WH2CKNaCl、Tween20和水组成，所述 Na2HPO4 · 12H20在所述提取剂中的浓度为2. 9g/L，所述NaH2PO4 · 2H20在所述提取剂中的浓 度为0. 2g/L，所述NaCl在所述提取剂中的浓度为0. 9g/L，所述Tween20在所述提取剂中的 浓度为0. 05g/L。
全文摘要
本发明公开了一种检测三聚氰胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该酶联免疫试剂盒，包括三聚氰胺单克隆抗体和三聚氰胺半抗原。三聚氰胺单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.3394的三聚氰胺单克隆抗体杂交瘤细胞株MAL分泌产生的。本发明的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测动物或人食用的产品(特别是牛奶、奶粉等乳品及蛋、饲料等)中三聚氰胺的含量。本发明试剂盒及检测方法对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的三聚氰胺单克隆抗体，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。
文档编号C07K16/44GK102086229SQ200910242089
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者史为民, 吴小平, 张兴祥, 徐飞, 李姮, 江海洋, 潘净茹, 王战辉, 王照鹏 申请人:北京维德维康生物技术有限公司