一种¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法

专利名称：一种¹³C，¹⁵N双标记甘氨酸的合成方法
技术领域：
本发明涉及一种13c，15N双标记甘氨酸的有机合成方法，尤其涉及一种甘氨 酸-l-13c，15N、甘氨酸-2-13C，15N和甘氨酸-1，2-X, 15N的方法。
背景技术：
13C, 15N双标记甘氨酸，又名13C，15N双标记氨基乙酸，本发明所述的13C，15N双标 记甘氨酸，包括甘氨酸-1」3C，15N、甘氨酸-2-13C，15N和甘氨酸-1，2-13C2，15N三种13C，15N双 标记甘氨酸。甘氨酸为带甜味的白色结晶或结晶性粉末，易溶于水，微溶于醇和醚，熔点 2630C (233°C开始分解)。13C，15N双标记甘氨酸是一种重要的氨基酸标记物，广泛应用于 植物营养研究(葛体达，黄丹枫，宋世威等，番茄幼苗对13C，15N双标记甘氨酸(glycine) 的吸收，中国园艺学会第八届青年学术讨论会中国园艺学会第八届青年学术讨论会论文 集，2008 年)和双标记复合肥料的研究(HodgeA，Robinson D, Griffiths B S, et al. Why plants bother :root proliferation results inincreased nitrogen capture from an organic patch when two grasses compete. Plant Celland Environment,1999,22, 811-820 ；Hodge A,Stewart J,Robinson D,et al. Competition between roots and soil micro-organisms for nutrients from nitrogen-richpatches ofvarying complexity. Journal of Ecology，2000a，88，150-164)，也可以作为原料合成其它13C，15N双标记氨基酸 如丝氨酸、苯丙氨酸等。对于13C，15N双标记甘氨酸的合成，目前有Schmidt法和改进的Gabriel法。 Schmidt法是利用13C脂肪酸或脂肪酰卤与15N标记叠氮酸反应生成少于原脂肪酸一个碳原 子的胺。此方法收率偏低，并且在合成过程中损失一个标记13C原子和反应副产物N2难以 回收利用，13C和15N利用率偏低，生产成本提高。改进的Schmidt法是脂肪酰卤和氨气反应 后，形成酰胺后采用LiAlH4还原成胺。此方法是原料13C标记脂肪酰卤难以制备，并且价格 昂贵，不适合13C，15N双标记甘氨酸的合成。改进的Gabriel法是利用13C标记氰化钠和15N 标记邻苯二甲酰亚氯甲胺为原料，经过4步反应合成。但由于13C标记氰化钠是剧毒物，购 买或制备都不便利，因此此方法也不是较合适的方法。

发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种方法简单、可行 并适合批量生产的13C，15N双标记甘氨酸的合成方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种13C，15N双标记甘氨酸的合成方 法，其特征在于，该方法包括以下步骤(I)13C标记溴代乙酸的制备将13C标记乙酸和三氟醋酐混合，使13C标记乙酸的加入量为0. Imol/ (30 50)ml三氟醋酐，然后加入水和吡啶，三氟醋酐、水和吡啶的体积比为(30 50) (0.5-1) (0.5-1)，在冰水浴冷却下充分混合后，再在油浴上加热，慢慢滴加液溴，
3加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜，液溴与13C标记乙酸的摩尔比为(0.5 5) 1， 反应温度为40 80°C，反应时间为2 24小时，反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙 酸和溴化氢溶液，得到13C标记溴代乙酸；(2) 13C，15N双标记甘氨酸的制备将U-15N-六亚甲基四胺和乙醇混合，U-15N-六亚甲基四胺的加入量为(0.05 0. 5)mol/(120 150)ml乙醇，调节反应体系pH = 7 10之间，加入13C标记溴代乙酸， U-15N-六亚甲基四胺与13C标记溴代乙酸反应摩尔比为(0.5 5) 1，水浴加热，磁力搅拌 反应，反应温度为40 80°C，反应时间为1 5小时，反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼 2次，得到粗品，粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得13C，15N双标记甘氨酸； 反应路线如下 步骤(1)所述的液溴与13C标记乙酸的摩尔比为1. 5~2 1，反应温度为60°C，
反应时间为10 12小时。步骤(1)所述的13C标记乙酸为乙酸-I-13C,乙酸-2_13C或乙酸-1，2_13C2，对应的 13C标记溴代乙酸为溴代乙酸-l」3c，溴代乙酸-2_13c和溴代乙酸-1，2-13C2。步骤⑵所述的U-15N-六亚甲基四胺与13C标记溴代乙酸反应摩尔比为(2 3) 1，反应温度为60°C，反应时间为2 3小时。步骤(2)所述的反应体系pH = 8 9。步骤⑵所述的反应体系pH值用lOmol/L NaOH进行调节。步骤⑵所述的13C，15N双标记甘氨酸为甘氨酸-I-13C, 15N、甘氨酸-2_13C，15N或甘 氨酸-1，2-13C2，15N。与现有技术相比，本发明采用13C标记乙酸和U-15N标记六亚甲基四胺为原料，经 过一条有机合成的路线得到13c，15N双标记甘氨酸。收率达到85% (以13C标记乙酸计)， 13C和15N丰度都大于99% (用Thermo的液相色谱-质谱联用仪和MAT271同位素质谱仪 测试)，化学纯度大于99% (Waters液相色谱和Nicole公司的Mahna_IR550红外光谱仪测 定)。此方法标记13CZ5N同位素工艺简单，适合批量生产13C，15N双标记甘氨酸。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0. Imol乙酸-I-13C和40ml 三氟醋酐混合，小心地加入水0. 5ml和吡啶1ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶加热 至80°C，将0. 05mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜。反应 12小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙酸-1」3C。
将0. 5mol U-15N-六亚甲基四胺和120ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体 系PH = 8，加入0. Imol 13C标记溴代乙酸，水浴加热至40°C，磁力搅拌反应5小时。反应 结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨 酸-l-13c，15N 6. 63 克，收率为 86. 1%，13C 丰度 99. 1 %，15N 丰度 99. 2%，纯度 99. 5%。实施例2在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0. Imol乙酸_2_13C和30ml 三氟醋酐混合，小心地加入水Iml和吡啶0. 75ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶加热 至40°C，将0. 5mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜。反应 24小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙酸-2-13C。将0. 05mol U-15N-六亚甲基四胺和150ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应 体系PH= 10，加入0. Imol 13C标记溴代乙酸，水浴加热至60°C，磁力搅拌反应1小时。反 应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨 酸-2-13C, 15N 6. 20 克，收率为 80. 5%, 13C 丰度 99. 0%, 15N 丰度 99. 2%,纯度 99. 8%.实施例3在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0. Imol乙酸_1，2_13(2和 50ml三氟醋酐混合，小心地加入水0. 7ml和吡啶0. 5ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反 应瓶加热至60°C，将0. 2mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为 宜。反应2小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙 酸-1，2-13C2。将0. 25mol U-15N-六亚甲基四胺和140ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应 体系PH = 7，加入0. Imol 13C标记溴代乙酸，水浴加热至80°C，磁力搅拌反应3小时。反 应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨 酸-1，2-%，15N 6. 55 克，收率为 85. 1%，13C 丰度 99. 1%，15N 丰度 99. 1%，纯度 99. 7%。实施例4在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0. Imol乙酸-I-13C和35ml 三氟醋酐混合，小心地加入水0. 6ml和吡啶0. 4ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶 加热至60°C，将0. 15mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为 宜，反应10小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙 酸-i-13c。将0. 2mol U-15N-六亚甲基四胺和130ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体系 !1 = 7，加入0. Imol溴代乙酸-I-13C,水浴加热至80°C，磁力搅拌反应2小时。反应结束，趁 热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨酸-I-13C, 15N 6. 55 克，收率为 85. 1%，13C 丰度 99. 1%，15N 丰度 99. 1%，纯度 99. 7%0实施例5在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0. Imol乙酸_2_13C和30ml 三氟醋酐混合，小心地加入水Iml和吡啶0. 75ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应瓶加热 至40°C，将0. 5mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜，反应 24小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙酸-2-13C。将0. 3mol U-15N-六亚甲基四胺和150ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体系ΡΗ = 9，ΜΛ0. Imol溴代乙酸-2-13C，水浴加热至60°C，磁力搅拌反应3小时。反应结束，趁 热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨酸-2_13C， 15N 6. 20 克，收率为 80. 5%, 13C 丰度 99. 0%, 15N 丰度 99. 2%,纯度 99. 8%.实施例6在装有温度计、回流冷凝器的250ml三口烧瓶中，加入0. Imol乙酸_1，2_13(2和 30ml三氟醋酐混合，小心地加入水Iml和吡啶0. 75ml。在冰水浴冷却下充分混合后，反应 瓶加热至40°C，将0. 5mol液溴慢慢滴加入反应瓶，加溴的速度以正好保持反应液淡色为 宜。反应24小时。反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到溴代乙 酸-1，2-13C2。将0. 3mol U-15N-六亚甲基四胺和150ml乙醇混合，用10mol/L NaOH调节反应体系 pH = 9，加入0. Imol 13C标记溴代乙酸，水浴加热至60°C，磁力搅拌反应3小时。反应结束， 趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品。粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得甘氨酸-1， 2-13C2，15N 6. 55 克，收率为 85. 1%，13C 丰度 99. 1%，15N 丰度 99. 1%，纯度 99. 7%。
权利要求
一种13C，15N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)13C标记溴代乙酸的制备将13C标记乙酸和三氟醋酐混合，使13C标记乙酸的加入量为0.1mol/(30～50)ml三氟醋酐，然后加入水和吡啶，三氟醋酐、水和吡啶的体积比为(30～50)∶(0.5 1)∶(0.5 1)，在冰水浴冷却下充分混合后，再在油浴上加热，慢慢滴加液溴，加溴的速度以正好保持反应液淡色为宜，液溴与13C标记乙酸的摩尔比为(0.5～5)∶1，反应温度为40～80℃，反应时间为2～24小时，反应结束后，冷却反应液，旋蒸除去三氟乙酸和溴化氢溶液，得到13C标记溴代乙酸；(2)13C，15N双标记甘氨酸的制备将U 15N 六亚甲基四胺和乙醇混合，U 15N 六亚甲基四胺的加入量为(0.05～0.5)mol/(120～150)ml乙醇，调节反应体系pH＝7～10之间，加入13C标记溴代乙酸，U 15N 六亚甲基四胺与13C标记溴代乙酸反应摩尔比为(0.5～5)∶1，水浴加热，磁力搅拌反应，反应温度为40～80℃，反应时间为1～5小时，反应结束，趁热过滤，用乙醇洗涤滤饼2次，得到粗品，粗品用乙醇重结晶，真空干燥后得13C，15N双标记甘氨酸；反应路线如下FSA00000202862600011.tif
2.根据权利要求1所述的一种13C，15N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(1) 所述的液溴与13C标记乙酸的摩尔比为1.5 2 1，反应温度为60°C，反应时间为10 12 小时。
3.根据权利要求1所述的一种13C，15N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(1) 所述的13C标记乙酸为乙酸-I-13C,乙酸-2-13C或乙酸-1，2-13C2，对应的13C标记溴代乙酸为 溴代乙酸-I-13C,溴代乙酸-2」3C和溴代乙酸-1，2-13C2。
4.根据权利要求1所述的一种13C，15N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(2) 所述的U-15N-六亚甲基四胺与13C标记溴代乙酸反应摩尔比为(2 3) 1，反应温度为 60°C，反应时间为2 3小时。
5.根据权利要求1所述的一种13C，15N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(2) 所述的反应体系pH = 8 9。
6.根据权利要求1所述的一种13C，15N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(2) 所述的反应体系PH值用lOmol/L NaOH进行调节。
7.根据权利要求1所述的一种13C，15N双标记甘氨酸的合成方法，其特征在于，步骤(2) 所述的13C，15N双标记甘氨酸为甘氨酸_1」3C，15N、甘氨酸-2-13C，15N或甘氨酸-1，2-13C2，15N0
全文摘要
本发明涉及一种13C，15N双标记甘氨酸的合成方法，采用以13C标记乙酸为原料，经过溴代反应，制备得到13C标记溴代乙酸。该物质和U-15N标记六亚甲基四胺在乙醇溶液中反应，反应pH值为7-10。反应得到的粗产物用乙醇重结晶，即可得到13C，15N双标记甘氨酸。与现有技术相比，本发明甘氨酸得率≥85％，13C丰度≥99％，15N丰度≥99％，纯度≥99％，工艺简单，适合批量生产13C，15N双标记甘氨酸。
文档编号C07B59/00GK101914030SQ20101023497
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者宋明鸣, 徐建飞, 李良君, 杜晓宁, 王伟, 王刚 申请人:上海化工研究院