专利名称：一种抗除草剂莎稗磷的特异性抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及选择一种具有-COOH的、又最大可能包含莎稗磷原有结构的化合物作为莎稗磷半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗体制备方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
除草剂是近20年来逐渐发展起来的一种农药类型，随着化学工业的发展，除草剂的品种也逐渐增多。在我国研制和投产的除草剂也已达数十种。有些除草剂具有致畸作用，除草剂的安全性已经引起人们的关注，应注意除草剂对环境的污染和人畜毒性作用问题。使用除草剂能在粮食等中残留，通过食物链而使人畜发生慢性危害作用。日本肯定列表制度《食品中农业化学品残留限量食品卷/药品卷》中莎稗磷在大米(糙米)中的检测限为0.05mg/kg ;《食品中农用化学品残留检测方法增补本I》中莎稗磷的气质测定低限为
0.025mg/kg ;《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》(2008-09-04发布2009-03-16实施)中运用气相色谱-质谱法对大米、糙米、大麦、小麦和玉米5中食品中110种农药残留进行测定其中莎稗磷的测定低限为0.0lmg/kg。然而，莎稗磷由于其分子量为367.84,小于IOOOdolton (道尔顿)，一般传统上米用气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或气相色谱质谱法联用等物化方法对其残留进行检测。虽然这些传统的理化分析方法灵敏度较高，而且较为准确，但由于它们普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以难于满足实际分析的需要，因此迫切需要发展一种简单、快速、灵敏的分析技术。而免疫分析技术正是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术。其基本原理认为:抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为莎稗磷残留研究提供了一条新的分析检测途径。
发明内容
本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。本发明为达到以上目的所设计的技术方案是合成分子结构式如下图所示的莎稗磷半抗原，然后将半抗原与载体蛋白联接合成人工抗原，免疫动物，获得抗体。
权利要求
1.除草剂莎稗磷的人工抗原和抗体其特征在于使用分子式为
2.权利要求1所述的除草剂莎稗磷人工抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得: (1)N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺(CCPA)的合成 称取5.859g N-异丙基对氯苯胺、28ml无水甲苯、3.57g三乙胺置于圆底烧瓶中，在室温搅拌下，利用恒压滴液漏斗向其中逐滴滴加3.92g氯乙酰氯，控制滴加的速度使温度保持在65°C以下，滴加完毕后，保持温度在110°C回流5-6h，冷却，过滤，用苯洗涤生成的三乙胺盐酸盐，滤液水洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤，得到一深色溶液，将深色溶液过硅胶柱纯化，收集目标组分并旋蒸掉其中的大部分有机溶剂，室温冷却，析出的白色结晶即为N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺； (2)半抗原的合成 称取2.25g氢氧化钠溶解于18ml水中，向其中加入132.65mg巯基乙酸,搅拌15min后，向其中投入354.24mg的CCPA,回流2h,冷却,用浓盐酸酸化至pH =1.过滤,水洗,得到半抗原的白色固体； (3)称取4.568mg半抗原于一棕色小瓶中，加入350 μ I 二甲基亚砜(DMSO)，超声2h，半抗原溶解后再分别称取8.711mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、6.242mg N，N_ 二环已基碳二亚胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液； (4)人工抗原的合成 将上述活化酯液逐滴缓慢地加入到由20mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于4ml pH = 7.4的PBS缓冲液中所配置的溶液中，4°C反应过夜，反应产物于4°C、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，_20°C保存；
3.权利要求1所述的莎稗磷酶标抗原的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得: 称取1.02784mg半抗原于一棕色小瓶中，加入150 μ I 二甲基亚砜(DMSO)，超声2h，半抗原溶解，再分别称取1.96mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1.4045mg N, N-二环已基碳二亚胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液；然后准确称取5mg的辣根过氧化物酶(HRP)溶解于2ml的NaHCO3溶液中，将上述的活化酯溶液于冰浴中缓慢加入到HRP溶液中，4°C条件下搅拌过夜。后用pH7.4磷酸盐缓冲液透析3天，加入硫柳萊，4 C冰箱保存；
4.权利要求1所述的除草剂莎稗磷抗体的制备方法，其特征在于是用下述步骤制得: 免疫动物选用雄性新西兰大白兔，免疫方法采用皮下和肌肉注射法，初免后进行四次加强免疫，加强免疫分别于初次免疫后2周、4周,6周和8周后免疫四次，免疫后9天由兔子的耳缘静脉取血，进行效价检测，具体做法是: 初次免疫:取Img按照权利要求2所述方法合成的人工抗原溶于0.9%的NaCl溶液和弗氏完全佐剂等体积所配制的溶液中，进行动物免疫； 加强免疫:用0.5mg上述人工抗原溶于0.9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐剂等体积所配制的溶液，进行动物免疫； 抗体纯化:定时监测动物抗体效价，当抗体对一定的包被抗原达到适宜效价时，采集血液，并离心获 得抗血清，使用G-S^harose蛋白亲和层析柱对抗血清进行纯化，获得抗莎稗磷的特异性抗体。
全文摘要
除草剂莎稗磷的半抗原、人工抗原和抗体的制备涉及具有除草剂莎稗磷基本结构的半抗原、人工抗原和抗体的制备。本发明以简便的方法制备了特异性良好的除草剂莎稗磷的抗体。该抗体是以N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺与巯基乙酸合成半抗原，然后分别与牛血清白蛋白(BSA)和辣根过氧化酶(HRP)连接合成人工抗原和酶标抗原。人工抗原再经动物免疫，取血，分出抗血清，纯化制得抗体。该抗体稳定，具有良好的特异性和灵敏度，且合成方法简单，可用于环境、农产品和食品中除草剂莎稗磷残留的快速免疫检测，具有良好的应用前景。
文档编号C07K16/44GK103073634SQ20111032628
公开日2013年5月1日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者王俊平, 王硕, 生威 申请人:天津科技大学