用于生产乙酰丙酸、乙酰丙酸酯、戊内酯、以及其衍生物的发酵路径的制作方法

专利名称：用于生产乙酰丙酸、乙酰丙酸酯、戊内酯、以及其衍生物的发酵路径的制作方法
用于生产乙酰丙酸、乙酰丙酸酯、戊内酯、以及其衍生物的发酵路径优先权本申请要求于2010年8月30日提交的美国临时申请号61/378，199的优先权，将其通过引用结合于此。背景乙酰丙酸，或称4-氧代戊酸，是一种具有化学式CH3C (O) CH2CH2CO2H的有机化合物。它是一种酮酸。乙酰丙酸典型地是例如通过将蔗糖与浓盐酸加热来化学地制备。该程序经由葡萄糖的中介而进行，该葡萄糖异构化为果糖并且然后为羟甲基糠醛。乙酰丙酸是尼龙类似聚合物、合成橡胶以及塑料的潜在前体。乙酰丙酸是通用的合成中间体，例如在药物合成中，并且它是其他化学商品(比如甲基四氢呋喃、戊内酯以及乙酰丙酸乙酯)的工业生产中的前体。发明概述在某些方面以及实施例中，本发明提供了用于将从糖或其他碳源获得的丙酮酸转变为有价值的C5材料(比如乙酰丙酸)的化学途径。示例性的C5化合物展示于

图1与2中。当以糖作为碳源而使用时，该途径的关键是将C6糖(比如但不限于，葡萄糖、果糖、半乳糖)和/或C5糖(比如但不限于，木糖、阿拉伯糖)转变为丙酮酸，并且随后通过化学或生物化学醛醇加成、氧化、还原、脱水以及环化反应将丙酮酸转变为一种或若干种有价值的C5化合物。当与另一种碳源(比如但不限于脂肪酸以及甘油)使用时，首先将该碳源转变为丙酮酸，并且随后转变为一种或若干种有价值的C5化合物，这些C5化合物包括线性C5酮酸或酯或其具有以下通式的环化衍生物=C5C4(X) C3C2 (Y) CJ=O) (Z)，其中X是羟基或酮氧，Y是氢、羟基或酮氧，C3与C2碳之间的化学键是单键或双键(例如饱和的或不饱和的)并且Z是有关产生酯、硫酯或羧酸官能团的烷氧基、硫化物或苯氧基。在一些实施例中，该C5化合物是C5C4 (O1) C3C2⑴C1 (=0) (O1)，其中标记物“0广指代相同的氧原子，如此使得形成一种环状酯或内酯，并且Y是氢或羟基或酮氧。所有其他原子价或化学键都假定为氢原子，除非以上另有指明。在一个方面，本发明提供了一种制造化合物的方法，该化合物是C5酮酸或酯、或C5羟酸或酯、或其环状衍生物。本方法包括通过醛醇加成将丙酮酸转变为一种C5中间体，并且通过化学或酶步骤或其组合将该C5中间体转变为所述化合物。在某些实施例中，该C5化合物具有如以上描述的通式C5C4⑴C3C2 (Y) CJ=O) (Z)或C5C4 (O1) C3C2 (Y) CJ=O) (O1)。在某些实施例中，从5-碳和/或6-碳糖或适合用作微生物宿主碳源的原料来制备该化合物。在这些实施例中，该方法包括从该糖或原料(例如通过该微生物宿主)形成丙酮酸，以及乙醛醛醇加成至该丙酮酸(例如，在该微生物宿主中或在一种无细胞系统中)，由此制备5-碳酮酸作为用于制备所希望的C5化合物的中间体。可以通过在该微生物宿主中的丙酮酸脱羧来制备用于醛醇加成的乙醛。可以将该醛醇加成产物进一步经受一种或多种还原、氧化、脱水、基团转移、水解和/或内酯化反 应(例如，每一种独立地在该微生物宿主或无细胞系统中)以制备该希望的C5产物。
此类产物可以用作构造单元以制备商业上有价值的化学品以及燃料。例如，内酯，比如2-氧代-戊内酯(图2中的化合物L7)，2-羟基-戊内酯(图2中的化合物L6)，当归内酯(图2中的化合物L2、L3以及L10)以及4-戊内酯U _戊内酯，图2中的化合物LI)，可以用作溶剂。当归内酯以及4-戊内酯还可以化学地转变为亚甲基甲基丁内酯(MeMBL)(参见例如W0/2006/015023，W0/2006/015024的催化这一转变的方法)。亚甲基甲基丁内酯可以用作单体或共聚物来增加在电子产品与汽车应用中广泛使用的聚甲基丙烯酸酯(PMMA)聚合物的热耐受性，或一起制造聚合物(比如聚(MeMBL)，参见例如W0/2005/028529)。另外，可以使用化学催化将4-戊内酯转变为戊酸以及另外的戊酸酯，以及同分异构丁烯、丁二烯以及其他烯烃，包括具有八个或更多碳原子的烯烃，如Bozell J., Connecting Biomassand petroleum Processingwith a chemical bridge (用ih学才乔>1#牛勿质与石油力口31 联系起来)，Science (《科学》)329:522-523 (2010)中所综述的。乙酰丙酸(图1中的化合物Pl)可以转变为1，4戊二醇以及二酚酸，这两者可以用以制造聚合物。δ-氨络乙酰丙酸(自乙酰丙酸的衍生物)是一种每年具有超过300磅的预计市场的除草剂。再者，乙酰丙酸可以转变为卩比咯烧酮(pyrrolidones) (W0/2004/085048)、卩比咯烧酮(pyrrolidinone)(TO/2010/065833、TO/2004/085390、TO/2004/085349、W0/2004/084633)、当归内酯(W0/2005/097723)、4_戊内酯以及2-甲基-THF，它们是终产物或可以进行进一步转化成为其他的具有不同功用的化合物，比如阴离子液体(W0/2010/065833)、生物燃料以及燃料添加剂。乙酰丙酸可以另外地用作用于电池(例如JP09190820)、墨水(US5，769，929)、涂料(JP06280041)、抗腐蚀涂料(EP496555)的材料。乙酰丙酯(levulinic ester)(或乙酰丙酸酯(levulinate ester),图1中的化合物P9)本身是聚合物构造单元并且转化后成为缩酮(US2008/0242721)并且还可以用作燃料添加剂(如美国专利7，153，996所描述的，通过引用以其全部结合于此)。另外，乙酰丙酯可以在个人护理产品(例如，日本专利JP05320023)、表面活性剂以及润滑剂(EP882745)、吸收剂(参见W0/1998/9843684)中使用。提及的所有引用文件通过引用而结合于此。乙酰丙酸，乙酰丙酯以及图2中列出的一些内酯还可以用在药物活性成分制造以及药物应用中，其中一些列于 Bozell T., Production of levulinic acidand use asa platform chemical for derived products (乙酉先丙酸的牛.产以及作为用于衍牛.产品的平台化学物质的用涂 ),Resources, Conservation and Recycling(《资源、转化与再循环》)28:227-239 (2000)中。例如，W0/1995/022524报道了乙酰丙酸甲酯用于作为抗癌剂的新颖吲哚衍生物的合成的用途。乙酰丙酸以及4-羟基-戊酸还可以用作手性试剂，具有广泛的潜在应用(参见例如，Meyers等人，Stereoselective alkylations inrigid systems (冈丨I件系统.中的立体选择件掠化).Effect of remote substituents onp-facial additions to lactam enolates (玩距离耳又代基对内酉先胺摇酉享化物的D_表面力口成的影口向).Stereoelectronic and steric effects (空间电子与立体效应)，T.Am.Chem.Soc (《美国化学学会杂志》).120:7429-7438 (1998)) 由本发明所产的C5的药学应用可以包括丁内酯与戍内酯衍生物通过干扰细菌中的群体感受分子机制(quorum sensingmolecular mechanism)作为抗生素以及抗生物膜剂的用途(参见例如EP1716131以及W0/2006/117113)。另外的用途可以衍生自具有生物活性的原-白头翁素(图2中的化合物L4)。最后，乙酰丙酸以及酯已经在众多消费产品中用于食品、香料、芳香剂(EP1533364)以及添加剂。例如，乙酰丙酸用作香烟中的添加剂(W0/2010/051076)。这一段落中的所有引用文件通过引用而结合于此。在本发明的某些实施例中，该方法包括将丙酮酸转变为4-戊内酯。在另一个实施例中，该方法包括将丙酮酸转变为乙酰丙酸。在另一个实施例中，该方法包括将丙酮酸转变为乙酰丙酯(乙酰丙酸酯)，比如但不限于，乙酰丙酸乙酯以及乙酰丙酸丙酯。在本发明的另一个替代性实施例中，该方法包括将丙酮酸转变为当归内酯、α -以及α ’ -当归内酯。在又其他实施例中，该方法包括将丙酮酸转变为2，4- 二羟基-戊酸或其环化形式2-羟基-4-戊内酯。在又另一个实施例中，该方法包括将丙酮酸转变为2-氧代-4-羟基-戊酸或其环化形式2-氧代-4-戍内酯。在本发明的一些实施例中，该方法包括在一种真核生物、原核生物或古细菌发酵宿主(包括但不限于酵母属物种、毕赤酵母属物种、假单胞菌属物种、芽孢杆菌属物种、金孢子菌属物种、以及大肠杆菌)中 整合进入一个单一代谢途径中的多个酶步骤。在这些或其他实施例中，该方法包括一个或多个酶步骤(在无细胞系统中进行)、或化学催化步骤、或其组合，如果必要可以将该途径中的不同中间体可任选地分开和/或从发酵液中纯化以完成该程序。本发明的某些实施例的优点在于其建立在中心代谢之上。例如，真核生物、原核生物以及古细菌中的C5与C6代谢都可以采用产生糖酵解以丙酮酸。丙酮酸是中心代谢的最为重要的中间体之一，并且除了糖酵解之外还可以获得自脂质代谢以及氨基酸代谢。本发明的方法利用丙酮酸，并且将两分子的丙酮酸转变为一个C5分子，比如乙酰丙酸以及4-戊内酯。在C6糖的情况下，碳产率可以达到80%。在C5糖的情况下，碳产率理论上可以达到100%。如果该方法采用一种能够同时发酵C5与C6的微生物菌株(比如但不限于，工程化的酿酒酵母以及树干毕赤酵母)，则允许糖直接发酵为乙酰丙酸、4-戊内酯或图1与图2中描述的任一 C5化合物。当与用于获得乙酰丙酸或Y-戊内酯的替代性方法(其典型地产生40%或更低的摩尔产率)相比时，这一可达到的高产率代表了一个决定性的工业优势。在本发明的一个实施例中，该方法将糖流转变为图1与2中列出的一种或多种C5化合物。在另一个实施例中，使用淀粉作为用于该程序的原料。在另一个实施例中，该方法将木质纤维素原料(包括但不限于，玉米秸杆、木屑、城市废弃物、纸浆以及制造厂淤渣)转变为图1与2中列出的至少一种C5化合物。在本发明的一个实施例中，该方法将C6糖转变为图1与2中列出的一种或若干种C5化合物，优选地是在高效吸收并发酵C6糖的发酵菌株中进行该转变，这些菌株比如但不限于酿酒酵母、贾吉尔氏(Cargill’s)CBl菌株(如在W0/2007/106524中所描述的)、假单胞菌属、金孢子菌属以及大肠杆菌(E.coli)。在本发明的另一个实施例中，该方法将C5糖转变为图1与2中列出的一种或若干种C5化合物，优选地是在高效吸收并发酵C5糖的发酵菌株中进行该转变，这些菌株比如但不限于工程化酿酒酵母以及树干毕赤酵母。在本发明的一个实施例中，该方法同时将C5与C6糖转变为C5化合物，优选地是在高效吸收并发酵C5与C6糖的发酵菌株(例如，酿酒酵母)中进行该转变。在本发明的另一个实施例中，这些发酵菌株显示出对生物质水解物抑制剂(比如但不限于，呋喃)以及对低PH或高有机酸滴度培养基的高水平耐受性。在某些实施例中，该原料包括一种或多种选自以下各项的C6糖:阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、半乳糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖以及塔格糖。在这些或其他实施例中，该原料包括一种或多种选自以下各项的C5糖:木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖、木酮糖以及核酮糖。当本发明的方法用于将C5以及C6糖转变为4-羟基-戊酸或4-戊内酯时，将该途径设计为还原氧化(还原作用-氧化作用)平衡的:在糖酵解中产生两还原当量(NAD(P)H的形成)以给出丙酮酸(一个葡萄糖分子至两个丙酮酸分子)并且下游的从丙酮酸至4-羟基-戊酸或4-戊内酯(Y-戊内酯)的程序消耗两还原当量(NAD⑵的形成)。该反应对于这两种分子的产生是还原氧化平衡的这一事实将在发酵程序的情况下致使优化的转化，并且减少或消除对另外地工程化该发酵宿主以对抗失衡的需要。为了将糖直接发酵为所有其他的化合物或构造单元(图1)，该发酵宿主将依赖于分开的支反应以平衡该途径或依赖于一种外部的适合于平衡该途径的还原氧化当量源。附图简述附图1展示了乙酰丙酸的分子式(图1中的化合物P1)，以及可以在于此描述的该途径的不同步骤中以及这些程序的不同实施方案中产生的有价值的衍生物(图1中的化合物 Pl 至 P16)。附图2展示了不同C5内酯的分子式，根据本方法的不同实施例它们可以在该途径的不同步骤中产生(化合物LI至L10)。附图3提供了将丙酮酸转变为图1或图2中的任何C5化合物的生物化学程序的概览，高亮了某些步骤。一些可能的化学中间体以及子路径没有在此描述。对不同途径可能性的更详尽描述参见附图5。图4提供了根据本发明的某些实施例的生物化学途径与程序的概览，其中这些氧化/还原步骤(相应于图3中的步骤3与4)的次序是反向的。如在图3中，一些可能的化学中间体与子路径没有在此 描述。对不同途径可能性的更详尽描述参见附图6。图5提供了图3中的生物化学途径/程序的概览，其中使用氧化脱水酶将步骤4与步骤5缩并成了一个步骤。图6提供了将丙酮酸转变为图1或图2中的任何C5化合物或构造单元的生物化学途径/程序的详览。除了图3、4以及5中所描述的化学步骤外，还描述了可以从该核心途径的中间体的环化反应获得的不同的环状中间体，以及这些环状内酯中间体到这些不同的C5化合物或构造单元的化学转化。此外，还展示了可以从该核心途径中的中间体获得的不同的CoA中间体。该途径可以用以生产乙酰丙基-CoA，从该乙酰丙基-CoA可以容易地获得乙酰丙酸以及4-戊内酯，或乙酰丙酸酯和/或其他戊酸酯，比如图1中的4-氧代-戊酸酯(化合物P9)。图7展示了通过硫酯酶或转移酶的作用从该乙酰丙基-Cok中间体生产乙酰丙酯(乙酰丙酸酯)以及乙酰丙酸的原理。侧链R可以是任何官能团，比如但不限于，甲基、乙基、丙基、芳基、苯基、萘基与其他芳族基团，以及具有氧与氮取代基的烷基基团，比如酮、伯醇、仲醇、叔醇、伯胺、仲胺与叔胺，等等。图8展示了当将两种烯醇化物还原酶(Genbank登录号AAA64522以及AAD16106，在图8中标记为6001以及6002)与底物4-氧代-2-戊酸(还称作乙酰基丙烯酸，参见图1中的化合物P2)与底物环已烯酮(作为对照)进行反应时所得到的动力学轨迹。标记为“6001aceto”以及“6002aceto”的曲线显示出这些蛋白在IOOuM NADPH以及该底物4-氧代-2-戊酸的存在下的活性。标记为“eOOlcyclo”以及“6002cyclo”的曲线显示出这些蛋白在IOOuM NADPH以及该底物环已烯酮的存在下的活性。监测到在340nm的吸收减少，这种减少测量了 NADPH向氧化形式NADP+的转变。这一曲线显示出该底物4-氧代-2-戊酸被两种蛋白转变为乙酰丙酸(图1中的化合物PD。对照曲线(标记为“6001buffer”与“6002buffer”以及“buffer cyclo”与“buffer aceto”)显示出这些底物单独在缓冲液中或这些蛋白单独在缓冲液中时的吸收减少。在这些条件下没有检测到显著活性。所有曲线在缓冲磷酸钾100mM、pH7.0以及室温(25° C)条件下获得。初始NADPH浓度100uM，4-氧代-2-戊酸初始浓度IOOmM,环已烯酮初始浓度50mM。蛋白浓度变化。图9展示了 II类来自恶臭假单胞菌的醒缩酶HpaI醒缩酶(Genbank登录号ADA63518)对底物乙醛以及丙酮酸的活性。测定条件如下:将该蛋白从E.Coli中表达并N1-纯化并且在Tris缓冲液(pH8.0，补充有IOOmM MnCl2)中以100mg/ml的初始浓度与乙醛以及丙酮酸的混合物进行反应。在用HCL淬灭并且利用EPIC极性柱运行HPLC之前，将该蛋白与这些底物在室温孵 育30min。图9展示了所得到的HPLC轨迹，其中相应于这些底物与产物的峰在该图中以黑色箭头指示。产物4-羟基，2-氧代戊酸的化学鉴定通过LC/MS来确定(数据未展示)。发明的详细说明在某些方面以及实施例中，本发明提供了用于将从糖或其他碳源获得的丙酮酸转变为有价值的C5材料(比如乙酰丙酸)的化学途径。概念上地，本发明的方法提供了一种途径，该途径被组织为至少两个步骤，并且在一些实施例中是从4至8个步骤，比如7至8个步骤(参见图3中描述的核心的8个步骤)，伴有沿该途径获得的中间体的多达4个另外的环化步骤。中间体在多个阶段至辅酶A(CoA)部分的附接允许途径产生CoA中间体，比如乙酰丙基_CoA(参见图6)。另外，四个可任选的步骤可以产生该途径中关键中间体的环化变体(再次参见图6)。根据不同实施例，一个第一步骤是醣酵解，其将糖(比如来自生物质)转变为丙酮酸，或者将糖转变为丙酮酸的替代性的任何化学转变。一个第二步骤将两分子的丙酮酸转变为一份子的4-羟基2-氧代-戊酸以及C02。一个可任选的环化步骤产生相应的内酯，2_氧代-4-戊内酯。一个可任选的CoA附接步骤可以产生4-羟基-2-氧代戊酰-CoA。一个第三步骤将4-羟基-2-氧代-戊酸还原为2，4- 二羟基-戊酸，或将4-羟基-2-氧代戊酰-CoA还原为2，4- 二轻基-戊酰-CoA,或将2-氧代_4_戊内酯还原为2-轻基_4_戊内酯。一个可任选的环化步骤从2，4- 二羟基-戊酸或2，4- 二羟基-戊酰-CoA产生相应的内酯，2-羟基-4-戊内酯。一个可任选的CoA附接步骤可以从2，4- 二羟基戊酸产生2，4- 二羟基戊酰-CoA。一个第四步骤将2，4- 二羟基-戊酸氧化为2-羟基-4-氧代-戊酸，或将2，4- 二羟基-戊酰-CoA氧化为2-羟基-4-氧代-戊酰-CoA。一个可任选的CoA附接步骤将2-羟基-4-氧代-戊酸转变为2-羟基-4-氧代戊酰-CoA。一个第五步骤将2-羟基-4-氧代-戊酸脱水为4-氧代-2-戊酸，将2-羟基-4-氧代-戊酰-CoA脱水为4-氧代-2-戊酰-CoA。一个可任选的CoA附接步骤将4-氧代-2-戊酸转变为4-氧代-2-戊酰-CoA。一个可任选的步骤进一步将4-氧代-2-戊酸还原为4-羟基-2-戊酸，或将4-氧代-2-戊酸还原为4-羟基-2-戊酰-CoA，这两者可以可任选地进行环化以产生当归内酯。另一个可任选的CoA附接步骤可以从4-羟基-2-戊酸产生4-羟基-2-戊酰-CoA，其再次可以可任选地进行环化以产生当归内酯。本发明的一个替代性实施例将该第四与第五步骤“缩并”为一个单一步骤。一个第六步骤通过以类似于以上的方式对4-氧代-2-戊酸进行还原而产出乙酰丙酸(4-羟基-戊酸)。一个可任选步骤将辅酶A (CoA)附接至乙酰丙酸而产生乙酰丙基-CoA。然后可以通过使用转移酶与合适的醇进行反应而使乙酰丙基-CoA转化为多种乙酰丙酯。在一些实施例中，一个第七步骤进一步将乙酰丙酸还原产生4-羟基-戊酸。一个第八步骤将4-羟基-戊酸环化产生4-戊内酯。在某些实施例中，步骤4以及5可以在一个单一转化(氧化脱水)中进行。在本发明的另一个实施例中，步骤3以及4顺序颠倒，如此使得2-羟基-4-氧代-戊酸首先被氧化为2，4- 二氧代-戊酸，并且进一步被还原为2-氧代-4-羟基-戊酸，这样则图3中的途径变成了图4中所表示的那个。在本发明的另一个实施例中，步骤3、5以及6(图3)直接以各个内酯L1、L2、L6、L7、L8、L9以及LlO进行，其中最初从丙酮酸以及乙醛而产生的线性中间体的分支化发生在图6中描述的任一环化步骤中。本发明的这一实施例可以用以直接获得内酯，或在水解作用后用以获得返回任何的Pl至P16化合物中(包括乙酰丙酸)。在本发明的又另一个方面中，步骤2、3、4、5以及6(图3)以这些CoA中间体进行，其中最初从丙酮酸以及乙醛而产生的线性中间体的分支化发生在附图6段落中描述的任一 CoA附接步骤中。本发明的这一实施例可以用以通过硫酯酶的使用而获得任何的Pl至P16化合物中(包括乙酰丙酸)。乙酰丙 酯(P9)可以通过使用转移酶而从乙酰丙基-CoA以及合适的醇获得。步骤1:糖转变为丙酮酸糖向丙酮酸的转变是得以良好研究的代谢途径糖酵解的一部分。在糖酵解中，多种酶的作用使得每一分子的C6糖(比如葡萄糖)转变为两分子的丙酮酸、两分子的ATP以及以两个NAD(P)H分子的两还原当量。在本发明的一个实施例中，丙酮酸是从一种发酵生物体中的糖酵解获得并且随后用在该发酵宿主中的下游途径中。在一个替代性实施例中，丙酮酸是从发酵液中分离并且随后根据下游途径进行加工。步骤2:丙酮酸转变为4-羟基-2-氧代-戊酸4-羟基-2-氧代-戊酸可以通过乙醛(一种醛)至丙酮酸(一种α酮酸)的醛醇加成而产生。该加成使一当量的乙醛与一当量的丙酮酸反应。乙醛可以从多种方式得到。例如，丙酮酸脱羧酶催化丙酮酸非氧化脱羧至乙醛。因此可以使用来自多种真核生物或原核生物来源(例如，酿酒酵母)的丙酮酸脱羧酶。在本发明的一个优选实施例中，利用酶丙酮酸脱羧酶从丙酮酸来产生乙醛。已经分离了多种醛缩酶，它们显示出催化丙酮酸与乙醛之间的醛醇加成。一种I类醛缩酶4-羟基-2-酮-戊酸醛缩酶(HKP醛缩酶)是一种利用希夫碱(Schiffbase)赖氨酸的醛缩酶并且催化正向与反向反应。在本发明的一个实施例中，丙酮酸与乙醛之间的醛醇加成可以由来自大肠杆菌的HKP醛缩酶(描述在Pollard，JR等人，Substrate selectivity and biochemical properties of4-hydroxy-2-keto-pentanoicacid aldolase from E.Coli (来自大肠杆菌的4_羟基_2_酮-戊酸醒缩酶的底物选择件与牛.物化学特件)，Add 1.And Environ.Microbiology (《应用以及环境微生物》)，64(10):4093-4094(1998)中)、或其同系物、或其突变体(那些突变体可任选地通过使用计算设计、定向进化技术或合理诱变、或其组合的蛋白工程化来获得)进行催化。计算设计技术披露于US2009-0191607以及W02010/077470中，将其通过引用以其全文结合于此。已知存在至少两种II类醛缩酶催化丙酮酸与乙醛之间的加成，并且在Wang W等人，Comparison of two metal-dependent pyruvate aldolases related by convergentevolution:substrate specificity.kinetic mechanism and substrate channeling(趋同进化相关的两个金属依赖性丙酮酸醛缩酶的比较:底物特异性、动力学机制以及底物通if), Biochemistry (《生物化学》)，49:3774-3782 (2010)中已经在一定水平上详细地表征了两个(BphI以及HpaI)。这些酶采用一种金属辅助因子(普遍是Zn或Mn)。BphI以及HpaI不具有可检测的序列类似性。然而BphI是立体选择性的并且产生4S加成物，HpaI由于其十分开放的活性位点而产生一种消旋混合物(4R以及4S加成物)。BphI是变构地偶合至BphJ(—种乙醛脱氢酶)并且当单独表达时是无活性且不稳定的。然而，HpaI本身在大肠杆菌中是可表达的并且显示出活性。在本发明的一个替代性实施例中，丙酮酸与乙醛之间的醒醇加成由HpaI或Bph1、或其突变体(那些突变体可任选地通过使用计算设计、定向进化技术或合理诱变、或这三种的组合的蛋白工程化来获得)来催化。作为一种延伸，可以对任何合适的丙酮酸醛缩酶或其他类似的、催化醛与酮的醛醇加成的醛缩酶(例如，KDPG醛缩酶)可想象地进行再工程化以催化乙醛与丙酮酸的醛醇加成。该再设计可以包括但不 限于:达到对于丙酮酸与乙醛两者而言所希望的底物特异性，控制所希望的立构选择性以产生消旋或对映纯加成物((R) 4-羟基-2-氧代-戊酸以及
(S)4-羟基-3-氧代-戊酸)，稳定该酶以在实施本发明的工业条件下(例如，热稳定或在较高有机滴度下稳定)获得所希望的催化活性，和/或改进该酶在实施本发明的工业背景(例如，在酿酒酵母的代谢途径中)下的可表达性与可溶性。在本发明的另一个实施例中，丙酮酸与乙醛之间的醛醇加成由丙酮酸醛缩酶、或其同系物以及突变体(那些突变体可任选地通过使用计算设计、定向进化技术或合理诱变、或这三种的组合的蛋白工程化来获得)来催化。最后，使用酶从头设计技术，例如描述于Zanghellini, A等人，Algorithmsand an in silico Benchmark for Computational Enzyme Design(计算酶设计的新算法以及计算机内樽拟某准)，Protein Science (《蛋白质科学》)15:2785-2794(2006)中的，可能来设计针对存在或不存在于自然界中的底物的新颖醛缩酶。已经从头设计了高达70中这类醛缩酶，如US2009-0191607中所描述的，将其通过引用以全文结合于此。将这一方法论应用至底物丙酮酸以及乙醛可以产生具有所希望活性的醛缩酶。在本发明的另一个实施例中，丙酮酸与乙醛之间的醛醇加成由一种从头设计的醛缩酶来催化。步骤2’:4-羟基-2-氧代-戊酸环化为2-氧代_4_戊内酯4-羟基-2-氧代-戊酸环化为2-羟基-4-戊内酯(图1中的化合物L7)。在酸性至中性溶液中，热力学平衡关系到至内酯的环化。至内酯的环化可以通过使用化学或生物化学催化剂在动力学上进行强化。用于内酯化的均相或非均相催化剂包括强酸(例如，硫酸)条件、金属催化剂(例如，钯、铷)。生物化学催化可以通过在有利于正向内酯化反应的条件下(低至中性PH/高有机溶剂滴度)的脂肪酶、酯酶、蛋白酶以及内酯酶的作用来获得，如例如Martin CH,等人，Integrated bioprocessing for pH~dependent of4-valerolactonefrom levulinate in Pseudomonas Putida KT2440 (从恶臭假单胞菌KT2440 中的乙酉先丙酸整合地加工pH依赖件的4-戍内酷),Appl.and Environ, Microbiology (《应用与环境微生物学》)76 (2): 417-424中所展示的。在本发明的一个实施例中，在一种催化剂存在下，在将4-羟基-2-氧代-戊酸从发酵液或无细胞溶液分离之后，从4-羟基-2-氧代-戊酸生产2-氧代-4-戊内酯。在本发明的另一个实施例中，4-羟基-2-氧代-戊酸至2-氧代-4-戊内酯的内酯化直接由脂肪酶或酯酶或蛋白酶或内酯酶、或其突变体(那些突变体可任选地通过使用计算设计、定向进化技术、合理诱变、或这三者的组合的蛋白工程化来获得)来催化。步骤3:4-羟基-2-氧代-戊酸还原为2，4_ 二羟基-戊酸在广泛种类的天然脱氢酶中，计算机模拟(in silico)和/或实验筛选可以选择具有耐受4-羟基-2-氧代-戊酸以及2，4- 二羟基-戊酸的底物专一性的脱氢酶。另外，计算设计、定向进化技术、或合理诱变、或这三者的组合可以用以改变或增加现有脱氢酶针对4-羟基-2-氧代-戊酸以及2，4- 二羟基-戊酸的底物专一性。合适的脱氢酶起点的实例包括L-以及D-乳酸脱氢酶(NAD(P)H-或亚铁原卟啉-依赖性，来自真核生物或细菌来源)、苹果酸脱氢酶、天冬氨酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶(NAD(P)H依赖性，来自真核生物或细菌来源)、以及醇脱氢酶(比如NAD (P) H依赖性的烷基或苯基醇脱氢酶)。此类脱氢酶的实例列于实例部分中。

在本发明的一个实施例中，使用均相或非均相化学催化将4-羟基-2-氧代-戊酸选择性地还原为2，4- 二羟基-戊酸。2，4- 二羟基-戊酸可以从或不从发酵或无细胞溶液中进行分离/纯化以完成这一步骤。优选地，在随后经受所述还原之前，将2，4- 二羟基-戊酸从该溶液或发酵液中分尚。在本发明的一个实施例中，使用一种NAD (P) H依赖性脱氢酶来催化4_轻基_2_氧代-戊酸的2位上的酮的还原。在另一个实施例中，所述脱氢酶以针对4-羟基-2-氧代-戊酸的高度底物专一性以及针对2位上的酮的高度区位选择性而还原该酮。在本发明的一个实施例中，所述脱氢酶不是立体选择性的并且可以接受4R与4S对映异构体。在本发明的另一个实施例中，所述脱氢酶选择性地还原4-羟基-2-氧代-戊酸的4R或4S对映异构体。在本发明的另一个实施例中，使用一种FAD依赖性脱氢酶替代NAD (P) H依赖性脱氢酶，优选地是该FAD依赖性脱氢酶具有高度的底物与区位选择性。在本发明的一个实施例中，所述脱氢酶不是立体选择性的并且可以接受4R与4S对映异构体。在本发明的另一个实施例中，所述脱氢酶选择性地还原4-羟基-2-氧代-戊酸的4R或4S对映异构体。在本发明的另一个实施例中，使用一种FMN依赖性脱氢酶替代NAD(P)H依赖性脱氢酶，优选地是该FMN依赖性脱氢酶具有高度的底物与区位选择性。在本发明的一个实施例中，所述脱氢酶不是立体选择性的并且可以接受4R与4S对映异构体。在本发明的另一个实施例中，所述脱氢酶选择性地还原4-羟基-2-氧代-戊酸的4R或4S对映异构体。在本发明的另一个实施例中，使用一种高铁细胞色素依赖性脱氢酶替代NAD(P)H依赖性脱氢酶，优选地是该高铁细胞色素依赖性脱氢酶具有高度的底物与区位选择性。在本发明的一个实施例中，所述脱氢酶不是立体选择性的并且可以接受4R与4S对映异构体。在本发明的另一个实施例中，所述脱氢酶选择性地还原4-羟基-2-氧代-戊酸的4R或4S对映异构体。在本发明的另一个实施例中，使用一种醌依赖性脱氢酶替代NAD(P)H依赖性脱氢酶，优选地是该醌依赖性脱氢酶具有高度的底物与区位选择性。在本发明的一个实施例中，所述脱氢酶不是立体选择性的并且可以接受4R与4S对映异构体。在本发明的另一个实施例中，所述脱氢酶选择性地还原4-羟基-2-氧代-戊酸的4R或4S对映异构体。步骤3’:2，4- 二羟基-戊酸环化为2-羟基_4_戊内酯2，4- 二羟基-戊酸环化为2-羟基-4-戊内酯(图1中的化合物L6)。在酸性至中性溶液中，热力学平衡关系到至4-戊内酯的环化。有关热力学平衡以及化学与生物化学催化的相同说明如以上所述而适用。在本发明的一个实施例中，在一种催化剂存在下，在将2，4- 二羟基-戊酸从发酵液或无细胞溶液分离之后，从2，4- 二羟基-戊酸生产2-羟基-4-戊内酯。在本发明的另一个实施例中，2，4- 二羟基-戊酸至2-羟基-4-戊内酯的内酯化直接由一种脂肪酶或酯酶或蛋白酶或内酯酶、或其突变体(那些突变体通过使用计算设计、定向进化技术、或合理诱变、或这三者的组合的蛋白工程化来获得)来催化。步骤4:2，4-二羟基-戊酸氧化为4-氧代-2-轻基-戍酸在本发明的一个实施例中，使用均相或非均相化学催化将2，4-二羟基-戊酸选择性地氧化为4-氧代-2-羟基-戊酸。2，4- 二羟基-戊酸可以从或不从发酵或无细胞溶液中进行分离/纯化以完成这一步骤。优选地，在随后经受所述氧化之前，将4-氧代-2-羟基-戊酸从该溶液或发酵液中分离。在本发明的一个优选实施例中，使用一种NAD (P) H依赖性脱氢酶来催化2，4_ 二羟基-戊酸的4位上的羟基的氧化。在一个优选的实施例中，所述脱氢酶以针对2，4- 二羟基戊酸的高度底物专一性以及针对4位上的羟基的高度区位选择性而氧化该羟基。优选地，所述脱氢酶接受2， 4-二羟基-戊酸的四种不同的对映异构体(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一个替代性实施例中，所述脱氢酶选择性地氧化2，4- 二羟基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)对映异构体，任何一个都是从前面4-羟基-2-氧代-戊酸还原而得到的最丰富的对映异构体。此类脱氢酶的实例列于实例部分中。在本发明的另一个实施例中，使用一种FAD依赖性脱氢酶来催化2，4_ 二羟基-戊酸的4位上的羟基的氧化。在一个优选的实施例中，所述脱氢酶以针对2，4- 二羟基-戊酸的高度底物专一性以及针对4位上的羟基的高度区位选择性而氧化该羟基。优选地，所述脱氢酶接受2，4-二羟基-戊酸的四种不同的对映异构体(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一个替代性实施例中，所述脱氢酶选择性地氧化2，4- 二羟基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)对映异构体，任何一个都是从4-羟基-2-氧代-戊酸还原而得到的最丰富的对映异构体。在本发明的另一个实施例中，使用一种FMN依赖性脱氢酶来催化2，4- 二羟基-戊酸的4位上的羟基的氧化。在一个优选的实施例中，所述脱氢酶以针对2，4- 二羟基-戊酸的高度底物专一性以及针对4位上的羟基的高度区位选择性而氧化该羟基。优选地，所述脱氢酶接受2，4-二羟基-戊酸的四种不同的对映异构体(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一个替代性实施例中，所述脱氢酶选择性地氧化2，4- 二羟基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)对映异构体，任何一个都是从4-羟基-2-氧代-戊酸还原而得到的最丰富的对映异构体。在本发明的又另一个实施例中，使用一种高铁细胞色素依赖性脱氢酶来催化2，4- 二羟基-戊酸的4位上的羟基的氧化。在一个优选的实施例中，所述脱氢酶以针对2，4- 二羟基-戊酸的高度底物专一性以及针对4位上的羟基的高度区位选择性而氧化该羟基。优选地，所述脱氢酶接受2，4-二羟基-戊酸的四种不同的对映异构体(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一个替代性实施例中，所述脱氢酶选择性地氧化2，4- 二羟基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)对映异构体，任何一个都是从4-羟基-2-氧代-戊酸还原而得到的最丰富的对映异构体。在本发明的又另一个实施例中，使用一种醌依赖性脱氢酶来催化2，4- 二羟基-戊酸的4位上的羟基的氧化。在一个优选的实施例中，所述脱氢酶以针对2，4- 二羟基-戊酸的高度底物专一性以及针对4位上的羟基的高度区位选择性而氧化该羟基。优选地，所述脱氢酶接受2，4-二羟基-戊酸的四种不同的对映异构体(2R4R、2R4S、2S4R、2S4S)。在一个替代性实施例中，所述脱氢酶选择性地氧化2，4- 二羟基-戊酸的2R(2R4R、2R4S)或2S (2S4R、2S4S)对映异构体，任何一个都是从4-羟基-2-氧代-戊酸还原而得到的最丰富的对映异构体。步骤5:4-氧代-2-羟基-戊酸脱水为4-氧代_2_戊酸经典地，使用均相或非均相催化(比如温度>100°C，浓酸(4.0M硫酸)和/或金属氧化物催化剂(氧化锌或氧化铝))来达到化学脱水。在本发明的一个实施例中，将这些还原与氧化步骤之后得到的4-氧代-2-羟基-戊酸通过均相或非均相催化而化学地脱水至4-氧代-2-戊酸。4-氧代-2-羟基-戊酸可以从或可以不从发酵或无细胞溶液中进行分离/纯化以完成这一步骤。优选地，在经受所述脱水之前，将4-氧代-2-羟基-戊酸从该溶液或发酵液中分离。有机化合物的脱水可以可替代地通过脱水酶进行催化。一些类别的脱水酶已经得以表征并且依赖于不同的机制:基于自由基的机制，比如在维生素B12依赖性或SAM依赖性的脱水酶(例如二醇脱水酶、甘油脱水酶)中，路易斯酸机理，比如含有铁-硫的脱水酶(例如，二羟酸脱水酶、乌头酸酶)，以及烯醇化物离子中间体机理，比如二酸脱水酶(比如，酒石酸脱水酶)。虽然所有机理都适用于4-氧代-2-羟基-戊酸的脱水，但依赖于烯醇化物中间体的机理是优选的，因为羰基上的烯醇阴离子形成要消除的羟基降低了 α-质子的pKa，由此允许其容易地被一种广义酸/碱基团吸引。利用另外的广义酸/碱基团使离去的水分子质子化。这一机理被广泛多种的天然脱水酶利用:来自烯醇酶超家族的镁依赖性脱水酶，比如酒石酸脱水酶、葡萄糖酸脱水酶，使用这一机制用于以高底物专一性进行结构多样的二酸的脱水，如例如在Gerlt等人，Divergent evolution in the enolasesuperfamily:the interplay of mechanism and specificity(摇酉享酶超家族的趋异讲化:坑制与专一,牛的相互作用)，Biochemistry (《生物化学》)，433:59-70 (2005)中所描述的。延胡索酸酶(还称作延胡索酸水合酶)催化苹果酸基于烯醇化物地可逆脱水至延胡索酸。烯酰脱水酶(还称作巴豆酸酶)使用CoA硫酯的烯醇阴离子来催化不同CoA底物的可逆脱/K (参见例如 Holden 等人，The Crotonase Superfamily: divergently related enzymesthat catalyze different reactions involving acyl Coenzyme A thioesters ( P,曰酸酶超家族:催化不同反应的包括酰基辅酶A硫酯的趋异相关的酶)，Acc.Chem.Res (《化学研究报道》).34:145-157.(2001))。在本发明的一个实施例中，由一种脱水酶来催化4-氧代-2-羟基-戊酸脱水为4-氧代-2-戊酸。在本发明的一个优选实施例中，所述脱水酶使用一种烯醇化物中间体来催化该脱水。优选地，所述脱水酶是烯醇酶超家族、延胡索酸脱水酶超家族或烯酰-CoA脱水酶超家族、或其通过蛋白工程化而得到的突变体中的一个成员。在本发明的一个优选实施例中，所述脱水酶显示出针对4-氧代-2-羟基-戊酸的高水平的底物专一性。在本发明的另一个优选实施例中，所述脱水酶相等地使4-氧代-2-羟基-戊酸的2R与2S对映异构体脱水。在本发明的一个替代性实施例中，所述脱水酶选择性地使4-氧代-2-羟基-戊酸的2R或2S对映异构体脱水。步骤4以及5的替代方案:对于将2，4-二羟基-戊酸2步转变至4-氧代-2-戊酸而言，可替代地，可以使用一种氧化脱水来达到I步转化。氧化脱水在糖代谢中是常见的。所谓的4，6脱水酶，比如UDP-GlcNAc-转化用4，6-脱水酶，其结构细节描述于Ishiyama等人，Structural studies of FlaAlfrom helicobacter pylori reveal the mechanism forinverting4, 6-dehydratase activity ()(寸I傘I 门电累旋本干Iif FlaAl 的结构石开究揭示了
4.6-脱水酶活件的机制),J.Bi0.Chem.(《生物化学杂志》)別1 CM): 24489_244昍(2OO6)中。在本发明的一个实施例中，使用这样一种4，6-脱水酶来催化2，4- 二羟基-戊酸氧化脱水至4-氧代-2-戊酸。在本发明的一个方面中，所述4，6-脱水酶是对映选择性的并且优选地使2，4-二羟基-戊酸的其中一种对映异构体(2R4R、2R4S、2S4R或2S4S)脱水。在本发明的另一个方面中，所述4，6-脱水酶不是对映选择性的并且以类似催化效率地使2，4- 二羟基-戊酸的两种或更多种对映异构体脱水。在本发明的一个优选实施例中，对2，4- 二羟基-戊酸具有高活性的4，6-脱水酶是从天然4，6-脱水酶通过使用计算设计、定向进化技术或合理诱变、或其组合 的蛋白工程化而获得。步骤6:4-氧代-2-戊酸还原为4-氧代-戊酸(乙酰丙酸)经取代的烯烃上的双键可以被还原(氢化)以获得相应的饱和烷烃。可以使用化学催化或通常不对称地使用生物催化剂来还原经取代的烯烃，这些生物催化剂比如烯醇化物还原酶，如综述于 Stuermer 等人，Asvmmetri c bioreduction of activated C=C bondsusing enoate reductases from the old yellow enzyme family(使用来自老黄酶家族的烯醇化物还原酶对活化的C=C化学键进行不对称生物还原I, Curr.0pin.1n Chem.Bio (《化学生物学现行观点》).11:203-213(2007)中。烯醇化物还原酶已经从真核生物(比如酿酒酵母以及地钱属)以及原核生物(例如梭菌属)中得以表征。烯醇化物还原酶家族依赖于黄素辅助因子(FMN)，该FMN在该酶的每次周转都被氧化。除了一个已知的情况(其是烟酰胺独立性的)外，该黄素辅助因子反过来也被结合在该活性位点的烟酰胺辅助因子(NADH或NADPH)进行还原。一次周转完成后，底物已经被还原，而辅助因子NAD(P)H已经被氧化为NAD(P)+。各烯醇化物还原酶在它们的底物专一性方面不同。然而，一些烯醇化物还原酶(比如酵母以及梭菌属的烯醇化物还原酶)具有广谱的底物专一性并且可以容纳线性的经取代的烯烃(具有酸或酮官能团)以及经取代的内酯(比如4-戊内酯)。 在本发明的一个实施例中，将4-羟基-2-氧代-戊酸从分离培养液或无细胞溶液中分离并且使用均相或非均相催化将双键选择性地还原。
在本发明的另一个实施例中，使用一种烯醇化物还原酶来将4-羟基-2-氧代-戊酸还原为乙酰丙酸。在一个优选实施例中，所述烯醇化物还原酶依赖于FMNH2与NAD (P) H辅助因子，所述NAD (P) H辅助因子在该活性位点使用以在催化前将FMNH2再生为其氧化还原状态。在本发明的一个优选实施例中，所述烯醇化物还原酶在该发酵宿主中克隆并表达。在一个替代性实施例中，所述烯醇化物还原酶在细胞外使用，或在具有足够的辅助因子再生系统的无细胞系统中使用。在另一个替代性实施例中，所述还原由一个表达一种或多种烯醇化物还原酶的全细胞催化剂进行催化，如此使得所述细胞不同于其中该途径的部分或全部被使用的该(这些)发酵宿主细胞。步骤7:4-氧代-戊酸(乙酰丙酸)还原为4-羟基-戊酸类似于步骤3(段落
至
)，可以通过化学催化手段或通过使用一种脱氢酶生物催化剂来达到对乙酰丙酸的4位处的酮的还原。在代谢途径的背景中，这一最后的还原(以及相应的一还原当量的氧化)确保了 C5和/或C6糖的整个途径的还原氧化平衡。在本发明的一个实施例中，将乙酰丙酸从培养液或无细胞溶液中分离并且使用均相或非均相催化将4位处的酮进行选择性地还原以产生4-羟基-戊酸。在本发明的一个替代性实施例中，使用一种NAD(P)依赖性脱氢酶来催化乙酰丙酸的4位上的酮还原为相应的羟基以产生4-羟基-戊酸。在一个优选的实施例中，所述脱氢酶以针对乙酰丙酸的高度底物专一性以及针对4位上的酮的高度区位选择性而还原该铜。优选地，所述脱氢酶是如对于4-氧代-2-羟基-戊酸或其突变体(该突变体通过计算设计或实验诱变或两者的组合而得到)的4 位处的羟基的氧化而言相同的酶。在本发明的一个优选实施例中，所述脱氢酶选择性地产生4-羟基-戊酸的对映异构体(4R或4S)之一。在一个替代性实施例中，所述脱氢酶产生4-羟基-戊酸的4R与4S对映异构体的消旋混合物。步骤8:4-羟基-戊酸环化为4-戊内酯4-羟基-戊酸环化为4-戊内酯(也称作Y-戊内酯，图1中的化合物LI)。在酸性溶液中，热力学平衡关系到至4-戊内酯的环化。有关热力学平衡以及化学与生物化学催化的相同说明如在段落
中而适用。在本发明的一个实施例中，在一种催化剂存在下，在将4-羟基-戊酸从发酵液或无细胞溶液分离之后，从4-羟基-戊酸生产4-戊内酯。在本发明的一个优选实施例中，通过所述催化剂将对映纯4-羟基-戊酸(4R或4S对映异构体)转变为对映纯4-戊内酯。在一个替代性实施例中，通过所述催化剂将4-羟基-戊酸的两种对映异构体(4R以及4S)的消旋混合物转变为4-戊内酯的消旋混合物。在本发明的另一个实施例中，4-羟基-戊酸至4-戊内酯的内酯化直接由一种脂肪酶或酯酶或蛋白酶或内酯酶、或其突变体(那些突变体通过使用计算设计、定向进化技术、或合理诱变、或这三者的组合的蛋白工程化来获得)在细胞之内或细胞之外进行催化。在本发明的一个优选实施例中，所述脂肪酶或酯酶或蛋白酶或内酯酶作用于对映纯4-羟基-戊酸底物以产生对映纯4-戊内酯。在一个替代性实施例中，所述脂肪酶或酯酶或蛋白酶或内酯酶作用于4-羟基-戊酸的4R以及4S对映异构体的消旋混合物以产生4-戊内酯的4R以及4S对映异构体的消旋混合物。
实例丙酮酸脱羧酶的实例:可以使用丙酮酸脱羧酶家族的一种酶(EC编号EC4.1.1.1)比如丙酮酸脱羧酶来催化该途径的第一步骤，即丙酮酸转变为乙醛。下表I列出了这类酶的实例(连同它们的来源生物体)，它们在文献中已经得以研究与表征，列出了它们的公共数据库GenBank(NCBI)登录号。还可以使用同源酶，例如使用比对软件(比如但不限于Blast、PS1-Blast或HMMER3)并以〈0.1的比对e_值从表I中的序列(或它们的逆翻译)获得的蛋白以及DNA序列。表I
GenBank(蛋白质)登录号生物体
CAA39398酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)
AAM21208巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)
NP—195033拟南芥(Arabidopsis thaliana)
AAA20440寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)` EEQ44875白色念珠菌(Candida albicans)
AAN77243光滑念珠菌(Candida glabrata)
XP 002549529热带念珠菌(Candida tropicalis)
XP—001703530莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)
AAZ05069甜授(Citrus Sinensis)
ADZ22807Clostridium acetobytulicun
YP—003531827梨火疫病菌(Erwinia amylovora)
AAG13131草毒(Fragaria x ananassa)
AAA85103葡萄汁有抱汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)
CAA59953产乳糖酶酵母(Kluyveromyces Iactis)
AAA35267马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)
AAP75899Lachancea kluyveri
AAS49166乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)
权利要求
1.一种用于生产化合物的方法，该化合物是C5酮酸或酯、或C5羟酸或酯、或其环状衍生物，该方法包括:通过醛醇加成将丙酮酸转变为一种C5中间体，并且通过化学或酶步骤或其结合将该C5中间体转变为所述化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中该丙酮酸是产自包含一个或多个C6糖的碳源。
3.如权利要求2所述的方法，其中该或这些C6糖是阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、塔罗糖、半乳糖、果糖、阿洛酮糖、山梨糖以及塔格糖中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的方法，其中该丙酮酸是产自包含一种或多种C5糖的碳源。
5.如权利要求4所述的方法，其中该C5糖是木糖、阿拉伯糖、核糖、来苏糖、木酮糖以及核酮糖中的一种或多种。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其中该碳源包含甘油、脂肪酸、以及氨基酸中的一种或多种。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该丙酮酸是产自一种原料的发酵，该原料包含生物质、淀粉、纤维素和/或木质纤维素原料中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的方法，其中该木质纤维素原料包含谷类、木材、城市废弃物、以及纸浆与制造厂淤渣中的一种或多种。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中该丙酮酸是至少部分地通过微生物系统中的糖酵解来生产。
10.如权利要求9所述的方法，其中对丙酮酸的醛醇加成发生在真核、原核或古生菌发酵宿主中。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中该发酵宿主是酵母属物种、毕赤酵母属物种、假单胞菌属物种、芽孢杆菌属物种、金孢子菌属物种、或大肠杆菌。
12.如权利要求11所述的方法，其中该丙酮酸或醛醇加成产物是从该发酵宿主中回收并且在一种无细胞系统中被转变为以下化合物，即一种C5酮酸或酯、或C5羟酸或酯、或其环状衍生物。
13.如权利要求12所述的方法，其中该醛醇加成产物是通过选自还原、氧化、脱水、基团转移、水解与内酯化的一个或多个酶步骤在一种无细胞系统中被转变为所述化合物。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中该C5中间体是4-羟基2-氧代-戊酸。
15.如权利要求14所述的方法，其中该C5中间体是从丙酮酸通过乙醛的醛醇加成来生产。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中该4-羟基2-氧代-戊酸被还原为2，4-二羟基-戊酸。
17.如权利要求14或15所述的方法，其中该4-羟基2-氧代-戊酸被氧化为2，4-二氧代-戊酸。
18.如权利要求16所述的方法，其中该2，4-二羟基-戊酸被氧化为2-羟基4-氧代戊酸。
19.如权利要求17所述的方法，其中该2，4-二氧代-戊酸被还原为2-羟基4-氧代戊酸。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中该2-羟基4-氧代戊酸通过脱水酶反应被转变为4-氧代-2-戊酸。
21.如权利要求20所述的方法，其中该4-氧代-2-戊酸被还原为乙酰丙酸。
22.如权利要求21所述的方法，其中该乙酰丙酸被还原为4-羟基戊酸。
23.如权利要求22所述的方法，其中该4-羟基戊酸被环化为4-戊内酯。
24.如权利要求16所述的方法，其中该2，4-二羟基-戊酸通过氧化脱水被转变为4-氧代-2-戊酸。
25.如权利要求24所述的方法，其中该4-氧代-2-戊酸被还原为乙酰丙酸。
26.如权利要求25所述的方法，其中该乙酰丙酸被还原为4-羟基戊酸。
27.如权利要求26所述的方法，其中该4-羟基戊酸被环化为4-戊内酯。
28.如权利要求14所述的方法，其中该4-羟基2-氧代-戊酸被环化为2-氧代4-戊内酯，并且可任选地转变为4-戊内酯。
29.根据权利要求14至28中任一项所述的方法，其中至少一个中间体的酸基团被转变为一种辅酶A硫酯。
30.如权利要求29所述的方法，另外包含:该辅酶A硫酯转变为一种酯。
31.如权利要求15所述的方法，其中该乙醛是通过在一种微生物宿主中的丙酮酸脱羧来制备。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中该醛醇加成是通过I类醛缩酶。
33.如权利要求32所述的方法，其中该醛缩酶是大肠杆菌HKP醛缩酶，或其同系物或突变体。
34.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中该醛醇加成是通过II类醛缩酶。
35.如权利要求34所述的方法，其中该醛缩酶是恶臭假单胞菌HpaI醛缩酶，或其同系物或突变体。
36.如权利要求34所述的方法,其中该醒缩酶是BurkholderiaXenovorans BphI醒缩酶，或其同系物或突变体。
37.如权利要求32至36中任一项所述的方法，其中该醛缩酶是表达在该宿主发酵生物体中。
38.如权利要求1所述的方法，其中该化合物是乙酰丙酸或其酯。
39.如权利要求38所述的方法，其中该乙酰丙酸被转变为1，4戊二醇或二酚酸，其可以可任选地与其他聚合物构造单元聚合或共聚。
40.如权利要求38所述的方法，其中该乙酰丙酸或其酯被转变为甲基四氢呋喃或δ -氨基乙酰丙酸，其可以可任选地结合进入一种除草剂组合物中。
41.如权利要求38所述的方法，其中该乙酰丙酸或其酯被进一步聚合，可任选地与其他聚合构造单元聚合为一种共聚物。
42.如权利要求38所述的方法，其中该乙酰丙酸或其酯被转变为一种缩酮，该缩酮被用作燃料添加剂或者用于塑料和其他聚合物生产的单体/共聚物。
43.如权利要求1所述的方法，其中该化合物是一种内酯。
44.如权利要求43所述的方法，其中该内酯是4-戊内酯。
45.如权利要求44所述的方法，其中该4-戊内酯被转变为缬草酸或缬草酸酯、同分异构丁烯、丁二烯、或具有至少5个碳的烯烃中的一种或多种。
46.如权利要求45所述的方法，其中该戊酸、戊酸酯或烯烃被进一步化学地或生物学地还原为烷烃。
47.如权利要求43所述的方法，其中该内酯是当归-内酯。
48.如权利要求43所述的方法，其中该内酯是2-氧代-戊内酯。
49.如权利要求43所述的方法，其中该内酯是2-羟基-戊内酯。
50.如权利要求43所述的方法，其中该内酯是5-羟基-5-甲基二氢呋喃_2(3H)-酮。
51.如权利要求43所述的方法，其中该内酯是5-羟基-5-甲基呋喃-2(5H)_酮。
52.如权利要求43所述的方法，其中该内酯被氧化为α’-当归内酯或α-当归内酯。
53.如权利要求47所述的方法，其中该内酯被氧化为原-白头翁素。
54.如权利要求44所述的方法，其中4-戊内酯与甲醛反应以产生亚甲基甲基丁内酯。
55.如权利要求5至54中任一项所述的方法，其中该丁内酯被进一步聚合化，可任选地与其他聚合构造单元聚合为一种共聚物。
56.一种用于生产聚合材料或含有聚合物的产品的方法，包含如权利要求41或权利要求55所述的方法。
57.如权利要求56所述的方法，其中该聚合材料是尼龙、橡胶、聚丙烯酸酯或塑料。
58.一种用于制 造除草剂或燃料添加剂的方法，包含如权利要求40或42所述的方法。
全文摘要
本发明提供了用于将从糖或其他碳源获得的丙酮酸转变为有价值的C5材料，比如乙酰丙酸、乙酰丙酸酯、戊内酯、以及其衍生物的程序。
文档编号C07C53/00GK103180279SQ201180051824
公开日2013年6月26日 申请日期2011年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者A.L.赞格赫里尼 申请人:阿泽达公司