提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种添加 Fe2+提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，属于 代谢工程和微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002] 5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid, ALA)，分子式为 C5O3NH9，分子量为 131. 13,恪点为149-151°C，它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素 B12等关键前体物质。 ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物在医学领域逐渐受到重视，已成功应用 于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外，由于ALA在自然界中可 降解，在农药领域应用也非常广泛，如作为一种无公害的新型光活化农药、除草剂以及植物 生长调节剂等。
[0003] 目前，ALA主要合成方法是化学法合成，最早出现在上世纪50年代，到20世纪90 年代，相关研宄开始大量开展，并取得一定的成绩。但是由于化学合成反应步骤繁琐，副产 物多，分离提纯困难，ALA的得率也较低，并且环境污染严重等问题，近年来，微生物发酵生 产ALA已成为研宄的热点。自然界中，ALA的生物合成存在两条途径，一条是C4途径，由 5-氨基乙酰丙酸合成酶（ALAS，hemA编码）催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促 反应组成，主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是C5途径，首先谷氨酸 在谷氨酰-tRNA合成酶（GluRS，gltX编码）催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA 在谷氨酰-tRNA还原酶（GluTR，hemA编码）作用下生成谷氨酸-1-半酸（GSA)，最后GSA由 谷氨酸-1-半醛-2, 1-氨基转移酶（GSA-AT，hemL编码）催化生成ALA。该途径广泛存在 于植物、藻类以及细菌（如大肠杆菌）中。
[0004] 早期，人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides)，通 过诱变育种法对其进行诱变，筛选ALA的高产菌株，并通过发酵优化等使得ALA的产量达到 7. 2g/L。但由于光合细菌的特殊性，其成本较高，不适合大规模的工业化生产。随着基因工 程技术的成熟，Mariet和Zeikus选用大肠杆菌作为宿主细胞，采用基因工程的技术表达来 源于R.sphaeroides的ALA合酶基因（hemA)，ALA产量为3.79g/L。Xie et al.等利用过 量表达R. sphaeroides来源的hemA基因，经发酵优化，ALA产量最高达到5. 2g/L。但目前 以C4途径为基础的生物转化由于添加前体琥珀酸和甘氨酸生产ALA成本相对较高，Kang et al.等通过分析大肠杆菌中C5途径的调控机制，发现ALA合成C5途径的关键基因 hemA 和hemL，同时实现了以葡萄糖为唯一碳源发酵生产ALA。
[0005] 本发明在表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因 hemL和hemA和表达来源 于大肠杆菌血红素生物合成途径基因 hemD及hemF的基础上，通过添加 Fe2+及优化添加量， 实现了 ALA产量的进一步提高。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种提高大肠杆菌工程菌株产5-氨基乙酰丙酸 的方法，是控制初始发酵培养基中Fe 2+浓度为0. 0036-0. 036mM〇l/L，实现ALA产量的进一 步提尚。
[0007] 所述大肠杆菌工程菌株是以大肠杆菌为宿主，使用不同拷贝数的表达载体过量表 达谷氨酰-tRNA还原酶（hemA编码）、谷氨醛氨基转移酶（hemL编码）、尿卟啉原III合酶 (hemD编码）和粪卟啉原III氧化酶（hemF编码）。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌是E. coli BL21(DE3)。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述不同拷贝数表达载体分别为pRSFDuet-1和 pETDuet-Ι〇
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，以pRSFDuet-1表达hemA、hemL、hemF，以pETDuet-1 表达hemD，将两个质粒转入大肠杆菌得到大肠杆菌工程菌株。
[0015] 所述大肠杆菌工程菌株是 E. coli BL21 (DE3)/pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF+pETD uet-l-hemD〇
[0016] 所述方法是在发酵起始阶段向本身不含亚铁离子的发酵培养基中添加 I. O-IOmg/ L FeSO4 · 7H20〇
[0017] 在本发明的一种实施方式中，初始发酵培养基中含10mg/L FeSO4 · 7H20。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，将重组菌活化后以2-5%接种量转接发酵培养基 中发酵，Oh时添加0. 1-0. 5mM IPTG诱导基因表达，添加1.0-10mg/L FeSO4，氨苄青霉素 和卡那霉素，30-37°C，200r/min 培养，周期 28-36h。发酵培养基（g/L) :(NH4)2S0410-15， ΚΗ2Ρ044· 5-5. 0, Na2HPO4 · 12H20 12-15, MgSO4 · 7H20 0· 8-1. 0,酵母提取物 0· 8-1. 0,葡萄糖 15-20, pH 7. 0〇
[0019] 本发明以表达C5途径关键基因 hemL和hemA以及ALA代谢途径的下游基因 hemD 和hemF的重组菌为生产菌株，通过添加 Fe2+，提高了 ALA的产量。在此基础上，通过优化Fe2+ 的添加量及在3L发酵罐中方法培养，所得大肠杆菌工程菌株在3L发酵罐能够积累5-氨基 乙酰丙酸3850mg/L，有效地利用C5途径促进5-氨基乙酰丙酸的合成，实现了 ALA产量的进 一步提尚。
【附图说明】
[0020] 图I :Fe2+对细胞生长及产物ALA合成的影响
[0021] LADF_6:E. coli BL21(DE3)/pRSFDuet-l-hemA-hemL-hemFpETDuet-l-hemD〇
[0022] A :0D600nm，B :ALA 产量。
[0023] 实心图标为添加 Fe2+，空心图标为不添加 Fe2+。
[0024] 图2 :不同浓度的Fe2+对重组大肠杆菌积累ALA的影响
[0025] LADF_6:E. coli BL21(DE3)/pRSFDuet-l-hemA-hemL-hemFpETDuet-l-hemD〇
[0026] 图3 :重组大肠杆菌LADF-6发酵过程曲线图
[0027] LADF_6:E. coli BL21(DE3)/pRSFDuet-l-hemA-hemL-hemFpETDuet-l-hemD〇
【具体实施方式】
[0028] ALA分析方法：
[0029] 采用Mauzerall和Granick的分光光度法：将样品稀释至2mL，加入ImL的乙酸盐 缓冲液，〇. 5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷却至室温，取2mL的反应液至新管中，然后 加入2mL的Modified Ehrlich' s试剂，反应20min，利用分光光度计554nm下检测。
[0030] 培养基：
[0031] 斜面培养基（g/L):蛋白胨10,氯化钠10,酵母粉5. 0,琼脂20, pH 7. 0 ;
[0032] 种子培养基（g/L):蛋白胨10,氯化钠10,酵母粉5. 0, pH 7. 0,装液量 20mL/250mL ；
[0033] 发酵培养基（g/L) : (NH4)2S0415, ΚΗ2Ρ045· 0, Na2HPO4 · 12H20 15, MgSO4 · 7H20 1. 0， 酵母提取物I. 〇,葡萄糖20, pH 7. 0。
[0034] 培养条件：
[0035] 菌种培养：甘油管划线，然后挑取单菌落划线平板37°C培养，作为种子来源；
[0036] 种子培养：平板挑取菌体，37°C，200r/min，根据要求添加氨苄青霉素 lOOyg/mL， 卡那霉素50 μ g/mL，培养约12h，转接发酵培养基；
[0037] 发酵培养：以2%接种量转接，Oh时添加 L 0-15mg/L的FeSO4 · 7Η20,0· 1-0. 5mM IPTG诱导基因表达，根据需要添加苄青霉素（lOOyg/mL)以及卡那霉素（SOyg/mL)， 30-37°C，200r/min 培养，周期 28-36h。
[0038] 实施例1添加 Fe2+对大肠杆菌工程菌株的影响
[0039] 菌株：LADF-6 : E. co I i BL21 (DE3) / pRSFDuet-1-hemA-hemL-hemF pETDuet-1-hemD。发酵Oh时添加2. 5mg/L的FeSO4 · 7H20,分析细胞的生长情况及目的产 物ALA的积累情况，结果如图1所示，添加 Fe2+后，细胞量提高，产物ALA的合成也加快。
[0040] 实施例2优化Fe2+浓度提高ALA产量
[0041] 菌株：LADF_6:E. coli BL21 (DE3)pRSFDuet-l-hemLA-hemFpETDuet-l-hemD〇
[0042] 分析考察重组大肠杆菌在添加不同浓度的Fe2+时ALA的积累量，结果如图2所示， 添加不同浓度Fe 2+时重组大肠杆菌积累ALA的量不同，随着Fe 2+添加量的增加，ALA产量逐 渐提尚，但大于l〇mg/L时，ALA的积累量下降。
[0043] 实施例3重组菌3L发酵罐发酵验证
[0044] 菌株：LADF_6:E. coli BL21 (DE3)pRSFDuet-l-hemLA-hemFpETDuet-l-hemD〇
[0045] 重组大肠杆菌LADF-6在3L发酵罐中发酵生产，接种量2%，初始葡萄糖浓度为 33g/L，Oh添加 I. 0-15mg/L的FeSO4,0. 1-0. 5mM IPTG诱导以及相应的抗生素，IOh后ALA开 始大量积累，在30h左右产量最高，为3. 85g/L (图3)。
[0046] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种提高大肠杆菌工程菌株产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，控制发酵培养 基中Fe 2+的初始浓度为0. 0036-0. 036mMol/L。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌工程菌株是以大肠杆菌为 宿主，使用不同拷贝数的表达载体过量表达谷氨酰-tRNA还原酶、谷氨醛氨基转移酶、尿卟 啉原III合酶和粪卟啉原III氧化酶。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌是E. coli BL21 (DE3)。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述不同拷贝数表达载体分别为 pRSFDuet-1和 pETDuet-l〇
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以pRSFDuet-1表达hemA、hemL、hemF，以 pETDuet-1表达hemD，将两个质粒转入大肠杆菌得到大肠杆菌工程菌株。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵起始阶段向本身不含亚铁离子的 培养基中添加 I. 〇-l〇mg/L FeSO4 · 7H20。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将重组菌活化后以2-5 %接种量转接发酵 培养基中发酵，Oh时添加0. 1-0. 5mM IPTG诱导基因表达，添加 I. 0-10mg/L FeSO4 ·7Η20,氨 苄青霉素和卡那霉素，30-37°C，200r/min培养，周期28-36h。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基按g/L计含：(NH4)2S0410-15， ΚΗ2Ρ044· 5-5. 0, Na2HPO4 · 12H20 12-15, MgSO4 · 7H20 0· 8-1. 0,酵母提取物 0· 8-1. 0,葡萄糖 15-20, pH 7. 0〇
【专利摘要】本发明公开了一种添加Fe2+提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。本发明以已构建的合成5-氨基乙酰丙酸的大肠杆菌Escherichia？coli？BL21(DE3)LADF-6为出发菌株，考察培养基中添加Fe2+对ALA合成的影响，通过发酵验证，目的产物ALA产量有明显提高，30h时ALA产量为2.25g/L。在此基础上，经过优化Fe2+的初始添加量并在3L发酵罐中放大培养，当添加10mg/L的Fe2+时，ALA产量为3.85g/L。
【IPC分类】C12P13-00, C12R1-19
【公开号】CN104561158
【申请号】CN201510017646
【发明人】康振, 陈坚, 堵国成, 张俊丽
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月13日