专利名称：一种水稻干旱诱导蛋白及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻干旱诱导表达蛋白及其编码基因，以及这种基因的调控元件在水稻抗旱中的应用。
背景技术：
水稻是最主要的三大粮食作物之一，其播种面积占粮食播种面积的1/5，全世界二分之一以上的人口以水稻为主食，同时也是我国最主要的栽培作物之一。并且，水稻被列为模式作物，有着很丰富和深入的基因组研究基础。但是水稻的种植对淡水资源的需求量很大，干旱等非生物逆境一直是限制作物生长和产量的重要因素。且随着全球环境恶化、气候 异常等变化将会造成一些水稻主要产区的水资源的短缺，对水稻的产量影响很大，日益危害着我国的粮食生产安全。所以在全国范围内对于耐旱品种的研究和推广就很有必要。由于水稻全基因测序工作的完成，针对水稻组织的如基因芯片、蛋白质组分析等全基因组表达技术的不断发展和完善，使得我们分析克隆水稻干旱胁迫下的响应基因，进而从中发现新的抗旱基因及其调控元件成为可能。本发明所提供的可应答干旱的基因，是通过对处于花期的水稻进行干旱胁迫处理，利用基因芯片技术进行转录谱分析，经筛选所得。名称为L0C_ 0s06g0498800，来源于水稻sativa L ssp. Japonica0 0s06g0498800是一个脱水素蛋白，在抗旱过程中起到重要作用能稳定细胞膜和许多大分子的结构以避免脱水对细胞造成的伤害。经分析发现，0s06g0498800基因的表达图谱具有很高的专一性，且该基因的启动子为诱导型启动子，因此能够在干旱胁迫下在水稻花穗中特异性表达，从而发挥抵御干旱逆境的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于水稻的可以准确应答干旱的蛋白及其编码基因，及这种基因的调控元件在水稻抗旱中的应用。本发明所提供的可应答干旱的蛋白，名称为L0C_ 0s06g0498800，来源于水稻Oryza sativa L ssp. Japonica。是下述氨基酸残基序列之一
(1)序列表中的SEQID No: I;
(2)将序列SEQID No: I的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。序列表中的SEQ ID No: I由176个氨基酸残基组成。编码上述蛋白的基因LOC_ 0s06g0498800,是下述核苷酸序列之一
(1)序列SEQID No:2的核苷酸序列；
(2)编码序列SEQID No: I蛋白质序列的DNA ；
(3)与序列SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；
(4)在高严谨条件下可与序列SEQID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件为用0. I X SSPE (或0. I X SSC), 0. 1%SDS的溶液，在65°C下杂交
并洗月吴。序列表中的SEQ ID No:2由 531个碱基组成，其编码框为自5’端第I位碱基到第531位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No: I的氨基酸残基序列的蛋白质。本发明所提供的可应答干旱的基因的调控元件为该基因的启动子区域，是下述核苷酸序列之一
(1)序列SEQID No:3的核苷酸序列；
(2)与序列SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列；
(3)在高严谨条件下可与序列SEQID No:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。上述高严谨条件为用0. I X SSPEO^O. I X SSC), 0. 1%SDS的溶液，在65°C下杂交
并洗月吴。本发明还涉及含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该基因中任一片段的引物对，均属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供上述水稻花期干旱胁迫应答基因或其调控元件在植物生长发育中的应用，即有效检测植物所受干旱胁迫程度的方法。具体是将所述水稻花期干旱胁迫应答基因的调控元件启动子区域与报告基因GUS融合后转化水稻，在受过干旱处理的转基因水稻植株里，其报告基因呈现诱导表达。在实际应用中，将0s06g0498800的启动子与报告基因GUS融合，将该构建L0C_ 转化水稻，当植物受到干旱逆境胁迫时，报告基因便开始表达，因而经过一种便捷有效的染色方法即可估量植物水分的缺失，以便及时补救，从而减少甚至避免损失。传统基因工程中，通常利用组成型启动子超量表达逆境应答过程中的重要基因，以提高作物的抗逆性。本发明是利用诱导型启动子，这样一方面可以避免传统方法的弊端，减轻了目标蛋白对植株可能产生的负面效应，另一方面可以驱动目标基因在且只在植株受到诱导信号刺激后才表达，节约了植株细胞内有限的资源，且更具目标性和专一性。本发明的0s06g0498800是一个抗旱基因，可以在水稻受到干旱胁迫时大量表达，以抵御干旱逆境。而该基因的启动子不仅可以通过驱动报告基因表达提供了一种检测植物遭受干旱胁迫程度的手段，同时这个启动子还可以驱动其他抗旱基因，使植物受到干旱胁迫时超量表达特定的抗旱蛋白，以抵御干旱的伤害。因而本发明涉及的这种可以有效应答水稻干旱胁迫的蛋白及其编码基因，以及这种基因的有效的专门响应干旱刺激的启动元件在水稻抗旱中应用前景广阔。
图I为野生型水稻在干旱处理和未处理条件下，L0C_ 0s06g0498800基因荧光定量PCR检测结果。图2为野生型水稻和转基因水稻在干旱和未处理条件下的⑶S染色图。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物由英骏生物技术有限公司完成，测序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。实施例I.水稻抗旱基因0s06g049彻OO饱筛选。对水稻进行正常培养，待到二级枝梗形成时，停止浇水，检测土壤水分含量直至其含量达到约20%-30%左右，并保持该湿度约一周。取水稻花穗，抽取RNA，利用基因芯片比较分析对照未受干旱胁迫植物与被胁迫植物的基因表达谱，根据水稻基因芯片的结果，筛选到一些候选基因。0s06g0498800就是其中之一。以水稻未受干旱胁迫的花期、受到干旱胁迫的花期的总RNA为模板，用AMV反转录酶(TaKaRa)合成cDNA (依据Plant RT — PCR Kit 2. 01 (TaKaRa)的用户手册进行)，用荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa)检测对照植物与被胁迫植物中0s06g0498800的表达情况(依据TaKaRa的用户手册进行)。所用5’和3’引物分别为5'-tcattgtactttgaacattgg-3' (SEQ ID No:4)和 5'-gtcgtcttaatatgaacacaa-S' (SEQ ID No:5)。反应按照下列程序进行预变性95°C 3分钟，I个循环；变性95°C 10秒，退火与延伸60°C 30秒，40个循环。对比该基因在未受干旱胁迫的花期和受到干旱胁迫的花期的表达量，我们发现在受到干旱胁迫的花序中诱导表达(图I)。实施例2.Gs伽辦视嫩^启动子的克隆。通过网站查找并分析序列，并得到其启动子部分序列。提取水稻总DNA，以水稻总DNA为模板，PCR扩增0s06g0498800的启动子部分。引物序列分别为5’-ggatcctctacaagatatccaagttga-3’ (SEQ ID No:6)和 5’- ccatggctagctagctagcttaagct -3' (SEQ ID No:7)0 50ul PCR反应体系包含水稻基因组DNAlul,高保真酶 KOD plus (T0Y0B0) lul, IOX 缓冲液 5ul，2.5uM dNTP 4ul，25mMMg2+2ul, 20uM 的5’和3，引物各lul, 50%甘油5ul,水30ul。反应条件为94°C预变性2分钟；94°C变性30秒，55 °C退火30秒钟，68 °C延伸4分钟，共35个循环。反应结束后，将PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约3500bp的扩增片段。然后将该片段连至PMD19-T(TAKARA)
，经桑尼公司测序正确再经SaMl I和AfcoI酶切，大肠杆菌表达载体pCAMBIA1301杆菌表达质粒 pCAMBIA1301_ 0s06g0498800u_-GUS。实施例3.重组质粒pCAMBIA1301-浴转化水稻植株。将重组质粒pCAMBIA1301- 0s06g0498800]2r⑶S转化到水稻中。参照Hiei等(Plant Mol Biol, 1997,35 :205 — 218)的方法转化水稻。将质粒pCAMBIA1301-tts伽辦必6 优浴通过电激法转入根瘤农杆菌EHA105中，经筛选获得阳性克隆。将携带质粒pCAMBIA1301- 0s06g0498800n~GUS的农杆菌EHA105接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中28°C摇菌培养至对数生长期晚期，再I :100扩大培养到0D600为0. I左右。收集农杆菌菌体并重悬于转染培养基中。按照常规方法浸染水稻日本晴的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗性的阳性苗。待小苗长至IOcm左右时，将小苗移至室外网室种植，收种即得Tl代种子。实施例4.质粒转基因水稻植株报告干旱胁迫效果的检测。将得到的转基因水稻Tl代种子以及正常野生型植株正常种植，两种植株都各分两组实验，一组正常种植不做干旱处理；一组正常种植，待到二级枝梗形成时，停止浇水，检测土壤水分含量直至其含量达到约20%-30%左右，并保持该湿度约一周。取下未受干旱胁迫与经过干旱胁迫的两种植物花序浸于⑶S染液中，于37°C放置24h，70%乙醇浸泡24h以洗脱杂色，观察经过干旱处理与对照组的花器染色程度。图2即为转基因水稻植株和野生型水稻花序的⑶S染色结果。可见，未经干旱处理的转基因水稻植株，其 花序里报告基因GUS的表达水平很低，而经过干旱处理的转基因水稻植株，其报告基因的表达量很高，明显高于未经的对照组。而野生型植株经处理与否都未见报告基因的表达。因而证明了的启动子为一种干旱诱导型的启动子，在植物受到干旱胁迫后在花器官中诱导表达。此外，我们的结果还提供了一种检测植株水分缺失的方法，即通过一种简单有效的染色即可估量植物水分缺失的程度，以便及时补救，有效减少甚至避免损失。
权利要求
1.水稻干旱胁迫应答蛋白，其特征在于是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质(1)SEQ ID No: I ; (2)将SEQID No: I的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。
2.编码权利要求I所述的干旱胁迫应答蛋白的基因，其特征在于为下述核苷酸序列之一 (1)SEQID No:2核苷酸序列； (2)编码SEQID No: I蛋白质序列的DNA ； (3)与SEQID No:2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列； (4)在高严谨条件下可与SEQID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的干旱胁迫应答蛋白的基因的调控元件，即该基因的启动子，其特征在于为下述核苷酸序列之一 (1)SEQ ID No:3的核苷酸序列； (2)与SEQID No:3限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列； (3)在高严谨条件下可与SEQID No:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.ー种含有权利要求2所述的水稻干旱胁迫应答基因或其调控元件的表达载体。
5.ー种含有权利要求2所述的水稻干旱胁迫应答基因或其调控元件的转基因细胞系。
6.ー种含有权利要求2所述的水稻干旱胁迫应答基因或其调控元件的工程菌。
7.ー种扩增权利要求2所述的水稻干旱胁迫应答基因或其调控元件中任一片段的引物对。
8.如权利要求2所述的水稻花期干旱胁迫应答基因或其调控元件在植物生长发育中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将所述水稻花期干旱胁迫应答基因的调控元件启动子区域与报告基因GUS融合后转化水稻，在受过干旱处理的转基因水稻植株里，其报告基因呈现诱导表达。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种水稻干旱诱导蛋白及其编码基因和应用。本发明所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No1所示；编码花序中受干旱胁迫诱导后特异表达的蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；此外，本发明还提供一个水稻抗旱基因及建立于此基因调控元件基础上的能够有效检测植物所受干旱胁迫程度的方法。经检测，该方法具有如下特点便捷、快速、能够估量水稻植株所受干旱影响程度等。本发明为干旱育种提供了一个优质基因及基因调控元件，对于植物抗旱研究具有重要意义，具有较高的实际应用价值，且应用前景广阔。
文档编号C07K14/415GK102659935SQ20121010555
公开日2012年9月12日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者俞瑜, 牟晨, 董爱武, 陈娜 申请人:复旦大学