专利名称：一种二萜生物碱的制备方法及其药物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及从中草药中提取、分离C20二萜生物碱的方法及其药物用途，尤其是从毛茛科黄花乌头Aconitum coreanum(Levl)Rapaics中提取、分离赫替新型(hetisine)化合物的方法及其对心血管系统的影响。
心血管系统疾病在我国和世界上许多发达国家均列为多发病。常见的心血管疾病是心律失常。现有的抗心律失常药如奎尼丁、利多卡因、胺碘酮、盐酸维拉帕米等虽有一定的疗效，但还存在各种不同的缺点，例如奎尼丁属Ia类抗心律失常药，主要中度抑制O相上升速度并延长复极时间。奎尼丁虽然口服后吸收快而完全，但对心脏有不良反应，一为心脏停搏及传导阻滞，另一为心肌异常激动，并常伴有肠胃道不良反应，治疗指数低，约1/3患者发生不良反应。盐酸维拉帕米预防心绞痛或阵发性室上性心动过速，但毒副作用大，有4/5患者发生窦性静止，用药不安全。胺碘酮属于延长动作电位的药物，疗效较好，但长期服用毒副作用大，易引起肺纤维化、甲状腺功能改变，故不宜长期服用，对于防治心脏猝死(诱发室颤)受限制。利多卡因抗心律失常有效，但不能口服，且抗室颤效应不强(《中华人民共和国药典、二部、临床用药须知》中国医药科技出版社，1990第1次版129～158页)。
本发明的目的是提供一种从黄花乌头中提取分离赫替新型化合物的方法，并将得到的毒性低的新型天然结构化合物用于治疗或预防心血管系统疾病。
本发明是一种从中草药毛茛科黄花乌头中提取、分离活性成分赫替新型化合物关附甲素(Guan-FuBaseA)的方法，关附甲素的化学名为2α，13β-二乙酰基，11α，14α-二羟基赫替新(2α，13β-diacetyl，11α，14α-dihydrohetisine)。具体操作过程是，用溶剂提取黄花乌头，回收提取液，得到浸膏，将浸膏转溶于酸水中，调pH2-4，静置酸水液析胶，滤除酸水中沉淀，滤除沉淀后的酸水液用亲脂性有机溶剂脱脂，除去亲脂性有机溶剂层，碱化酸水液至pH5～10，再用亲脂性有机溶剂萃取碱化的水液，收集萃取液，常压和/或减压回收有机溶剂，得到关附甲素粗品，用有机溶剂反复重结晶和/或用硅胶、氧化铝或大孔树脂柱层析精制，在50～100℃干燥，得到关附甲素精制品。
脱脂或萃取用的有机溶剂可以是卤代烃例如氯仿、二氯甲烷，以及醋酸乙酯、醋酸甲酯、石油醚或苯。
碱化酸水液的碱可以是1～5%NaOH水液、1-5%KOH水液、浓氨水或Na2CO3。
重结晶所用的有机溶剂可以是甲醇、乙醇、苯、乙醚或丙酮，最好采用甲醇或无水乙醇。
用有机溶剂重结晶时，可以加入酸调pH3-5，制成生理上可接受的关附甲素的盐。可用的酸有盐酸、氯化氢气体、氢溴酸、硝酸、磷酸，最好使用1～5%盐酸。
关附甲素或其盐可以与一般辅助剂和/或赋形剂混合，制成各种剂型，用于治疗或预防心血管系统疾病，通常是用于治疗或预防心律失常，最好用于治疗或预防室上性心动过速和/或房颤。
药用赋形剂是指固体、半固体、填料或液体稀释剂和每种类型的配方辅助剂。
片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、贴敷剂或溶液都是可供选择的药物配方剂。
片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可含有一种或多种常用赋形剂，例如填料和增容剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和二氧化硅;粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮;致湿剂，如甘油;崩解剂，如琼脂，碳酸钙和碳酸氢钠;溶解延缓剂如石蜡;再吸收加速剂，如季铵化合物;润湿剂，如十六醇、硬脂酸单甘油酯;吸附剂，如高岭土和膨润土;润滑剂，如滑石粉，硬脂酸钙、硬脂酸镁和固态聚乙二醇。片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂常可制成带有避光剂的包衣和外壳，这些剂型也可以配制成只在或优先在肠道的某一部分释放出活性成分或选择性地延迟释放活性成分。
溶液可以含有一般的增溶剂、溶剂、防腐剂、乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、甘油、聚乙二醇或山梨醇脂肪酸脂。
对于非肠道给药，溶液和乳剂都是无菌的并与血液等渗的。
上述药物制剂是用已知的常用方法制备，例如可将活性成分与一种或多种赋形剂混合。
关附甲素及其盐的药效性试验包括离体试验、在体试验、电生理试验和毒性比较试验。
一、离体试验材料盐酸关附甲素注射液(InjectionGuan-fubaseAHydrochloride)。维拉帕米(Verapamil)由天津药物研究院赠送，利多卡因是江苏泰兴县制药厂产品，哇巴因为上海药品检验所药检用标准品，常洛啉由上海十六制药厂赠送。
所有大鼠、小鼠、家兔、杂种狗由中国药科大学动物室和中科院实验动物中心提供。
方法参见(1)AllenJ.D.etalBr.J.Pharmacol45∶561，1972。
(2)药理学实验方法学徐叔云，卡如濂陈修主编人民卫生出版社1982∶400(3)心血管药药效学技术要求(试用稿)，中国药理学会心血管药理分会，国家医药管理局新药研究管理中心编1991.4.
(一)对离体大鼠心脏结扎冠脉诱发心律失常的保护作用大鼠15只，体重191±21g，♂♀兼用，随机分为三组，为对照组，盐酸关附甲素组和利多卡因组，langendorff方法进行离体大鼠心脏灌流，通过张力换能器将心舒缩张力曲线描记在JL-3型三道记录仪上，通O2洛氏液灌流5min，分别换以利多卡因(5μg/ml)和盐酸关附甲素(50μg/ml)的洛氏液灌流5min，然后用无损伤缝合针(连线4×2 4/0)结扎冠状动脉前降支起始部(相当于左心耳尖处)，观察结扎后10-30min内出现室性心律失常的发生率。
结果表明盐酸关附甲素(50μg/ml)对离体大鼠心脏结扎冠脉诱发的室速，室颤均有明显的保护作用与利多卡因无明显差异(见表1)。表明盐酸关附甲素对心肌缺血性心律失常有保护作用。
表1对离体大鼠心脏结扎冠脉诱发心律失常的保护作用浓度室性心律失常发生率(%)组别动物数(μg/ml)室早室速室颤对照组5010010060利多卡因组 5 50 60 0**0*盐酸关附甲素组 5 50 50 0**0*＊p＜0.05，＊＊p＜0.01(按直接简化法与对照组比较)(二)对高钙诱发离体大鼠灌流心脏颤动的保护作用雄性大鼠47只，体重240-380g，击昏后迅速取出心脏，按Langendorff法灌流，通以95%O2+5%CO2的Krebs液恒流灌流(5ml/min)。对照组灌流25min后更换无K+高Ca++液(KCl为0，CaCl2·6H2O4.92)。灌流前后描记心表面电图，观察室速(VT)和室颤(VF)发生率及VT和VF的发生时间。给药组Krebs液灌流10min后换成药液，15min后更换无K+高Ca++液。对照组用致颤液灌流心脏后，VT发生率为55%，发生时间为5.3±4.1min，VF发生率为91%，发生时间为7±5min，维拉帕米组当浓度为2μg/ml时VT发生率为66.7%，发生时间为5.6±1.3min，与对照组无明显差别，而VF发生率和发生时间较对照组稍有减轻。浓度为3μg/ml时，VT和VF均不发生，常咯啉组浓度为5μg/ml时，VT和VF发生率无改变，当浓度为10μgml时，VT发生率无变化，而VF的发生率明显减少，盐酸关附甲素组20μg/ml时，VT和VF发生率明显减少，浓度为30μg/ml时，不发生VF，VT的发生时间明显推迟。结果表明盐酸关附甲素(20-30μg/ml)可抑制高钙诱发离体大鼠灌流心脏室速和室颤，与维拉帕米(2-3μg/ml)作用相似。
二、在体试验(一)电刺激家兔心脏诱发的心律失常对兔心电致室颤阈的影响兔12只体重2.2±0.2kg分为两组，每组6只，♂♀各半。一组为盐酸关附甲素组，另一组为利多卡因组。乌拉坦1.2g/kg耳缘iv麻醉。在人工呼吸下开胸暴露心脏，并用顾氏心动杠杆连于压力换能器，从JL-3型三道生理仪描记心脏舒缩曲线。将刺激电极置于心尖部(正极)与房室交界处左侧(负极)并连于DGQ-2型刺激器，以波宽1ms、频率20Hz的方波刺激10s，每隔2min刺激一次，逐次增加刺激强度(mV)。测得兔心致室颤值作为对照值。然后，由兔耳静脉分别注入盐酸关附甲素或利多卡因，不同剂量给药相隔10min，于每次给药后5min测定致颤阈，与给药前进行比较(见表2)。结果表明iv盐酸关附甲素和利多卡因各3，6，12mg/kg均能明显提高兔心致室颤值(P＜0.01)，且随剂量增大而作用加强。说明盐酸关附甲素对电刺激兔心引起的室颤有明显提高致颤阈作用，与利多卡因无显著差异(P＜0.05)。二组均在iv12mg/kg后30-40min内致颤阈又回复至给药前水平。
表2对兔心电致颤阈值的影响(N＝6)电致颤阈(X±SDmv)组别给药前给药剂量(mg/kg)3612盐酸关附甲素组 9.8±0.1 15.5±1.1**18.3±1.4**21.2±1.6**利多卡因组 9.7±0.4 14.7±2.4**17.4±2.2**20.6±2.3**＊＊P＜0.01(与给药前比较)(二)结扎冠脉前降支形成的心律失常(狗冠脉二期结扎)杂种犬13条，体重6-12kg，♂♀不限，分为盐酸关附甲素组(n＝7)和奎尼丁组(n＝6)。动物用戊巴比妥钠30mg/kg静脉注射麻醉，手术区去毛，常规消毒，在无菌条件下采用Harris二期结扎犬冠状动脉左前降支造成室性心律失常。术毕局部注入庆大霉素8万单位预防感染。术后20小时左右，动物在清醒状态下给药。采用累加法静脉推注盐酸关附甲素10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg或阳性对照药奎尼丁2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg。每次给药时间约2分钟。用心电图机记录给药前和给药后30分钟内不同时间的Ⅱ导联心电图，每隔5分钟记录一次，每次连续记录1分钟。给药前注射等体积的生理盐水作对照，30分钟内对心率、心律失常发生率无明显影响。
结果见表3-表5。由于各犬冠脉侧支循环等的影响，各犬心律失常的严重程度各不相同，室性心律与心率之比约15%-100%。盐酸关附甲素10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg都能显著减少室性心律，增加窦性心律。对室性心律在80%以下者，盐酸关附甲素具有较强的抑制室性心律作用，20-40mg/kg可完全抑制室性心律，使转成窦性心律。对室性心律近100%者，抑制作用较弱。40mg/kg对室性心律的平均抑制率约50%。奎尼丁5mg/kg、10mg/kg显著抑制室性心律，并增加窦性心律。与盐酸关附甲素相似，奎尼丁也是对室性心律百分率低者效果好。采用室性心律百分率较接近的几例动物中，各剂量对室性心律平均抑制率进行回归，盐酸关附甲素抑制室性心律失常的ED50为19.5mg/kg奎尼丁的ED50为6.2mg/kg。盐酸关附甲素还有显著减慢心率作用，40mg/kg时平均心率减慢不到20%。奎尼丁在所用的剂量对心率无显著影响。
以上所述表明，盐酸关附甲素具有显著的抑制Harris二期结扎犬冠状动脉引起的室性心律失常，增加窦性心律，并具有一定的减慢心率作用。盐酸关附甲素抑制该室性心律的ED50约为奎尼丁的三倍，由于盐酸关附甲素组用药前的心律失常较奎尼丁组严重，所以前者与后者在该模型上的抗心律失常作用强度之比可能大于1/3。
(三)药物诱发的心律失常1.乌头碱诱发心律失常(1)iv盐酸关附甲素注射液对乌头碱诱发大鼠室性心律失常的保护作用大鼠50只，体重238±31g，♂♀兼用，随机均分为5组，用1.2g/kg乌拉坦ip麻醉后，分别从股静脉iv奎尼丁15mg/kg，对照组股静脉iv等量生理盐水。2分钟后用WSQ-A型微量输液器由颈外静脉恒速注入硝酸乌头碱溶液(1μg/0.2ml/min)，并由心电示波器监视心电变化，并记录出现室早、室速、室颤时乌头碱的用量。
结果表明高、中低剂量的盐酸关附甲素注射液能明显增加硝酸乌头碱诱发室早、室速、室颤的剂量，其作用随盐酸关附甲素注射液剂量的加大而增加。说明iv盐酸关附甲素注射液对乌头碱诱发的室性心律失常有明显的保护作用。(表3)
表3Ⅳ盐酸关附甲素注射液对乌头碱诱发大鼠室性心律失常的保护作用X±SD N＝10 ＊＊P＜0.01(与对照组比较)引起室早乌头引起室速乌头引起室颤乌头组别碱用量碱用量碱用量(μg/kg)(μg/kg)(μg/kg)对照组23.5±3.328.4±4.242.3±5.4盐酸关附甲素注射液 32.7±3.2**38.7±2.6**51.3±5.4**(10mg/kg)盐酸关附甲素注射液 43.8±3.2**49.5±3.0**65.0±4.3**(25mg/kg)盐酸关附甲素注射液 56.1±5.4**63.5±4.8**82.6±8.3**(40mg/kg)盐酸奎尼丁 33.2±3.2**38.5±2.3**52.4±6.8**(15mg/kg)(2)iv盐酸关附甲素对乌头碱诱发大鼠室性心律失常的保护作用。
大鼠38只，体重259±38g，♂♀各半，随机分为5组，用1.2g/kg乌拉坦ip麻醉后，分别由颈外静脉给以盐酸关附甲素10，25，40mg/kg及利多卡因15mg/kg。对照组iv等量生理盐水。2分钟后用WSQ-A型微量输液器由颈外静脉恒速注入硝酸乌头碱溶液(1μg/0.2ml/min)，并由心电示波器监视出现室早，室速，室颤时记录乌头碱的用量，结果表明高，中，低剂量的盐酸关附甲素能明显增加乌头碱诱发室早，室速，室颤的剂量，其作用随盐酸关附甲素剂量的加大而增加，说明iv盐酸关附甲素对乌头碱诱发的室性心律失常有明显的保护作用。(表4)。
表4Ⅳ盐酸关附甲素注射液对乌头碱诱发大鼠室性心律失常的保护作用X±SD ＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01(与对照组比较)动物引起室早乌头引起室速乌头引起室颤乌头组别数碱用量碱用量碱用量(只)(μg/kg)(μg/kg)(μg/kg)对照组1023.4±5.227.9±4.935.7±4.8盐酸关附甲素注射液 10 37.7±3.5**45.4±4.7**52.0±3.5**(10mg/kg)盐酸关附甲素注射液 6 43.6±4.4**49.6±6.0**59.8±14.7**(25mg/kg)盐酸关附甲素注射液 6 80.5±10.2**84.1±10.7**106.0±13.6**(40mg/kg)利多卡因 6 27.6±3.1 34.1±7.6*48.1±11.5**(15mg/kg)(3)腹腔注射乌头碱诱发大鼠心律失常ip盐酸关附甲素对乌头碱诱发大鼠室性心律失常的保护作用。手术同前。大鼠23只，体重268±31g，♂♀各半，随机分为5组，乌拉坦1.2g/kgip麻醉后，分别ip盐酸关附甲素10，25，40mg/kg和利多卡因15mg/kg，对照组ip等量生理盐水，20min后按上法记录出现室早，室速，室颤时注入硝酸乌头碱的用量。结果表明高、中、低剂量盐酸关附甲素能明显增加乌头碱诱发室早、室速、室颤的剂量，其作用随剂量加大而增强，说明ip盐酸关附甲素对乌头碱诱发的室性心律失常也有明显的保护作用(见表5)。
表5ip盐酸关附甲素注射液对乌头碱诱发大鼠室性心律失常的保护作用X±SD ＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01(与对照组比较)动物引起室早乌头引起室速乌头引起室颤乌头组别数碱用量碱用量碱用量(只)(μg/kg)(μg/kg)(μg/kg)对照组528.3±7.332.1±4.152.8±8.2盐酸关附甲素注射液 5 34.7±4.2**52.2±15.2**72.3±11.6*(10mg/kg)盐酸关附甲素注射液 5 38.6±6.0*57.0±6.9**82.7±14.1**(25mg/kg)盐酸关附甲素注射液 4 57.2±11.2**68.2±8.4**103.1±25.6**(40mg/kg)利多卡因 4 42.8±0.9**50.8±5.7**64.6±15.6(15mg/kg)2.氯化钙诱发的心律失常对CaCl2诱发大鼠心律失常保护作用SD大鼠44只，体重172±13g，戊巴比妥钠ip麻醉，大鼠分为iv维拉帕米或盐酸关附甲素组和生理盐水对照组。给药后5min快速(5s)iv CaCl2130mg/kg，观察Ⅱ导程ECG变化。
结果见表6。对照组12只大鼠，iv CaCl2后迅速发生室颤，11/12鼠于1-2min内死亡。维拉帕米的剂量为2和3.8mg/kg，给药后5min，大鼠心率分别降低16和32%，2mg/kg组2/8鼠发生死亡。而3.8mg/kg组无一死亡。iv盐酸关附甲素20和30mg/kg后亦出现心率减慢，分别降低25和28%，同样可减低CaCl2引起室颤和死亡的发生率。
表6 Ⅳ维拉帕米或盐酸关附甲素对CaCl2引起心律失常的保护作用剂量5min时组别大鼠数异位节律室颤死亡数(mg/kg)变化心律对照组12010/1212/1211维拉帕米组2.08-16%2/82/823.88-32%1/81/80盐酸关附甲素组208-25%6/84/84308-28%2/81/80以上结果表明，盐酸关附甲素有与维拉帕米相似的对抗氯化钙诱发室颤和减少死亡率。
3.哇巴因诱发的心律失常对哇巴因诱发狗室性心律失常的作用(1)对麻醉狗的作用成年狗5只，体重为9.5±0.5kg，戊巴比妥钠(30mg/kg)iv麻醉。记录Ⅱ导程心电图，用Allen等方法分次由股静脉缓慢注入哇巴因溶液，首剂为40μg/kg，30min后再iv20μg/kg，以后每隔15min，iv5μg/kg，直至出现持续室性心动过速，然后，iv盐酸关附甲素，由室速转为窦性，计算其有效剂量。结果表明5只狗iv哇巴因诱发室性心动过速的平均剂量为58.1±3.3μg/kg。iv盐酸关附甲素后1-3min内可使室速恢复为窦性节律，其平均有效剂量为11.3±1.3mg/kg。表明盐酸关附甲素对哇巴因致心脏中毒诱发心律失常有治疗作用。
(2)对清醒狗的作用取5只清醒驯服狗，体重为10±0.5kg，记录Ⅱ心电图，前肢iv哇巴因60μg/kg诱发持续的室性心动过速后，缓慢iv盐酸关附甲素9mg/kg，1-2min后由室速转为窦性节律。继续观察30-60min不出现心律失常。结果表明盐酸关附甲素对哇巴因致心脏中毒诱发的心律失常有治疗作用。
4.乙酰胆碱诱发麻醉狗心律失常对乙酰胆碱诱发狗房颤的保护作用参照Klevans方法致犬房颤。犬5只，体重12±1kg。戊巴比妥钠iv麻醉，在人工呼吸下，从右侧第4肋间开胸，将一双极电极固定于右心房，记录右心房电图。用10%氯化乙酰胆碱0.05ml滴于右心房，然后用手术刀柄轻压一下，诱发房颤可持续4-16min。每隔15min用乙酰胆碱攻击一次，记录房颤时间。给药前测定二次作为对照值。于第二次乙酰胆碱攻击后10min，iv盐酸关附甲素10-20mg/kg，3min内注完。
结果在5只犬10次对照实验中，第一次诱发房颤持续时间为7.6±1.7min，第二次房颤持续时间为8.7±4.3min。
2只犬，iv盐酸关附甲素10mg/kg，15min内不发生房颤，至20min才发生。第二次重复iv10mg/kg，仍可出现相同的效果。另3只犬，iv20mg/kg，抑制房颤发生的效果可达35min左右。结果表明，iv盐酸关附甲素具有明显抑制乙酰胆碱诱发房颤，且剂量增大，效果更为显著。
5.对抗CaCl2-Ach液诱发小鼠房扑(房颤)作用小鼠60只，体重25±2g，戊巴比妥钠60mg/kgip麻醉，随机分为生理盐水组和五个不同剂量组(相邻两组剂量比为0.85)，每组10只，♂♀各半，iv盐酸关附甲素或等量生理盐水后1.5min，ivCaCl2-Ach液容量为10ml/kg(CaCl26mg/kg，Ach 30μg/ml临用前配制)，于10s内注完，用6501型心电图记录Ⅱ导程ECG，观察f或F作为房扑或房颤阳性指标。用药后完全不出现为有效，按直接简化法与对照组比较，用简化机率单位通式计算ED50〔叶定忠，朱思明应用生理学杂志 1986;264〕。结果表明盐酸关附甲素在13.4mg/kg即能明显对抗CaCl2-Ach液诱发小鼠房扑(颤)。抑制40%，21mg/kg完全对抗(见表7)，其ED50为12.4±1.5mg/kg。治疗指数为13.8。
表7 对抗CaCl2-Ach液诱发小鼠房扑(颤)作用 N＝10组别剂量(mg/kg) 有效率(%) ED50(mg/kg)生理盐水组0盐酸关附甲素组1 21.0 100**盐酸关附甲素组2 16.8 70**盐酸关附甲素组3 13.4 40*12.4±1.5盐酸关附甲素组410.830盐酸关附甲素组58.620＊P＜0.05;＊＊P＜0.01(与生理盐水组比较)离体试验表明1.盐酸关附甲素(50μg/ml)对离体大鼠心脏冠状动脉结扎诱发的心律失常有保护作用，与利多卡因(50μg/ml)作用相似。
2.盐酸关附甲素(20-30μg/ml)可抑制低钾高钙诱发离体大鼠心脏室速及室颤，与维拉帕米(2-3μg/ml)作用相似。
在体试验表明1.iv盐酸关附甲素(3，6，12mg/kg)对电刺激兔心引起室颤有明显提高致颤阈作用与利多卡因(3，6，12mg/kg)作用相似。
2.iv或ip盐酸关附甲素(10，25，40mg/kg)均对乌头碱诱发的大鼠室性心律失常有明显的保护作用。iv盐酸关附甲素注射液(10、25、40mg/kg)均对乌头碱诱发的大鼠室性心律失常有明显的保护作用，其效优于盐酸奎尼丁。
3.麻醉狗iv盐酸甲附甲素(平均有效剂量为11.3±1.3mg/kg)后1-3min内可使哇巴因引起室性心动过程转为正常窦性节律。
4.iv盐酸关附甲素(20、30mg/kg)能对抗氯化钙诱发大鼠室颤和减少死亡率。作用与维拉帕米(2、3、8mg/kg)相似。
5.iv盐酸关附甲素(10，20mg/kg)具有明显抑制乙酰胆碱诱发狗房颤的效果，可维持10-35min。
6.iv盐酸关附甲素可对抗CaCl2-Ach液诱发小鼠房扑(颤)，其ED50为12.4±1.5mg/kg治疗指数为13.8。
7.盐酸关附甲素10、20、40mg/kg具有显著的抑制Harris二期结扎犬冠状动脉引起的室性心律失常，增加窦性心律，并具有一定的减慢心率作用。盐酸关附甲素抑制该室性心律的ED50约为奎尼丁的三倍。
三、电生理作用机制用心血管药效学技术手册规定标准玻璃微电极法观察盐酸关附甲素对豚鼠乳头肌动作电位的影响。
豚鼠乳头标本的制作豚鼠，体重300-400g，♀♂不拘，击昏后取出心脏，在通95%O2+5%CO2的Tyrode′s液中制备右心室乳头肌，将标本以水平方向固定于1ml的水浴槽内，以37±0.5℃的Tyrode′s液循环灌流，流速为4ml/min，pH7.2-7.4。Tyrode′s液成分如下(mmol/L)NaCl 136.7，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.05，NaH2PO41.1，NaHCO311.9，Glucose5.5。
刺激电极为铂金丝双电极，刺激频率1Hz，刺激波宽1ms，刺激强度为舒张阈的150%。标本稳定1hr后开始实验。
有效不应期测定在基础刺激频率为1Hz的基础上，每8次刺激插入1次期前刺激。期前刺激波的波宽和强度均为基本节律刺激的两倍。改变期前刺激和基本节律刺激之间的时间间隔，以期前刺激能引起AP产生的最短时间间隔为ERP。
频率依赖性抑制的动力学过程以不同频率的串刺激来躯动标本(ISI＝4800、2400、1200、600、300、200ms)，用第一个
值与新的稳态
之间的差值占第一个
的百分比来衡量这种频率依赖性阻滞(RDB)作用的大小。研究RDB的恢复动力学过程，是用在串刺激终了后以不同的间隔提供早搏的方法进行。
窦房结标本的制作家兔，体重2.0-3.0Kg，♀♂不拘，击昏后迅速取出心脏，放入经95%O2+5%CO2饱和的Tyrode′s液中，剪开右心房，沿界嵴剪下窦房结部分(DE Carvalhe AP，DE Mello WC，Hoffman BF.Am J Physiol 1959;196483)，标本心内膜面朝上，固定于温度为36±0.5℃的恒温浴槽中，平衡1hr后开始实验。
所有实验均在同一细胞或同一标本中完成对照和药物作用的观察，结果采用配对t检验统计处理。盐酸维拉帕米(广东省利民制药厂)，奎尼丁，氯卡胺(湖北医工所提供)，慢心律(广州市药检所提供)。
1.盐酸关附甲素与奎尼丁、慢心律、氯卡胺对豚鼠乳头状肌快反应AP的影响用累积给药法，药物浓度以0.5log mol/L递增，给药间隔时间30min。盐酸关附甲素0.86μmol/L，奎尼丁0.84μmol/L，慢心律0.84μmol/L，氯卡胺0.81μmol/L能显著降低
，它们对
和APA的降低作用均呈现明显浓度依赖性。除氯卡胺在高浓度时能抬高RP以外，其它三药对RP无明显影响。盐酸关附甲素(0.26-8.6μmol/L)、奎尼丁(0.28-28μmol/L)使APD50、APD90、ERP均延长，慢心律(2.8-28μmol/L)使APD50、APD90缩短，而ERP相对延长。氯卡胺(0.27-8.6μmol/L)对APD50、APD90、ERP无显著影响。VmT为快速去极化起点至
所需时间与0相去极化持续时间的比值，该值可以作为衡量Na+通道开放时加速过程的指标。实验结果表明，盐酸关附甲素、奎尼丁、慢心律、氯卡胺均能使Vmt依浓度显著增加，而
所对应的膜电位Vmv恒定在-25mV左右电位水平上。
盐酸关附甲素对有效不应期的影响对ERP，盐酸关附甲素也呈现不同作用，在上述低浓度范围内，ERP呈绝对延长高浓度时，ERP无明显改变。但由于APD90缩短，ERP/APD90的比值却显著增大，说明ERP相对延长。
盐酸关附甲素、奎尼丁、氯卡胺、慢心律对
频率依赖性抑制的动力学过程的影响在相同ISI(300ms)，产生大致相同RDB的情况下比较四个药的开始动力学过程。当它们的浓度依次为32μmol、16μmol，1μmol，25μmol时，它们产生的RDB分别为40%、48%、42%和48%，但它们产生RDB的速度明显不同。除慢心律之外，其它三个药的RDB的速度明显不同，而且RDB的开始过程符合单指数曲线的规律。以达到稳态前的每一个
减去稳态
为△′，将△′标准化为△＝△′/第一个
，此△值符合如下方程△＝Ae( n / τo )。此处n为串刺激脉冲的序号，以1/τo来衡量RDB开始动力学的快慢，即RDB开昙动力学的速率常数。将△值与n数的关系用△＝Ae( n / τo )进行拟合处理，1/τo值为盐酸关附甲素0.1333AP-1、奎尼丁0.1689AP-1、氯卡胺0.0598AP-1。慢心律的RDB开始动力学过程产生太快，不能用上述方法进行衡量。
在ISI＝600ms时，比较四个药物产生RDB的恢复过程。设串刺激的第一个
为峰值
，令θ＝(峰值
-早搏
)/峰值
，则θ符合以下方程
，t代表串刺激终止到早搏刺激开始的时间，τre为
从RDB恢复的时间常数，将θ值与t时间的关系用
进行拟合处理，得τre值为盐酸关附甲素45(s)、氯卡胺26(s)、奎尼丁18(s)、慢心律为2.6(s)。
2.盐酸关附甲素，维拉帕米(Ver)对家兔窦房结(SAN)优势起搏细胞AP的影响按文献方法根据优舒起搏细胞的特点和区域(BleekerWK，MackaayAJC，MireilleMP，BoumanLN，BeckerAE.CircRes1980;4611.BrownHF.PhysiolRev1982;62505)，首先探查优势起搏细胞引出自发性AP，稳定15min后，记录AP作为对照，然后加入药物。
(1)加入盐酸关附甲素(50μmol/L)30min后，SAN细胞动作电位的APA无明显变化，0相除极速率(MRD)、舒张期去极化速率(RDD)和平均复极化速率(MRR)分别降低到用药前的82.6%、87.7%和86.11%(N＝10，p＜0.01)，自发活动频率(SFF)减少到92%(N＝10，p＜0.001)，舒张期间隔(DI)、舒张期持续时间(DDT)、0相除极时间(DT)以及APD(从动作电位峰到最大舒张电位所需要的时间)均延长。
(2)加入Ver0.5μmol/L也有类似作用。15min后，与给药前相比，APA下降到用药前的74%(N＝10，p＜0.001)，MRD和RDD分别为用药前的36.4%、87%(N＝10，p＜0.05)，MRR降低到58.1%(N＝10，p＜0.001)，SFF减少到84%(N＝10，p＜0.001)，而DDT延长到用药前的123%(N＝10，p＜0.05)，DI、DT和APD均延长。
电生理研究结果表明盐酸关附甲素能浓度依赖性地降低
和APA，低浓度(0.26-8.6μmol/L)范围内，APD50，APD90和ERP延长，高浓度(26μmol/L)时APD50，APD90缩短，而ERP无明显改变，但ERP/APD90的比值显著增加。且对
的抑制有明显的频率依赖性和电位依赖性。在对快Na+通道有特异性阻滞的同时并不影响心肌兴奋性，这有利于临床应用。在缺O2、高K+和低pH的心肌细胞中，盐酸关附甲素抑制
，APA和相对延长ERP的作用更加明显。这对治疗快速型和缺血性心律失常是有益的。从而抑制逆向传导，延长不应期，消除单向传导阻滞或使其变为双向传导阻滞，这将有利于阻断缺血病变区的折返激动，益于阻止心律失常的产生。
盐酸关附甲素是通过抑制窦房结细胞慢反应电活动而减慢窦房结自发频率的，而不是通过β肾上腺素受体和M胆碱受体并且也不同于钙通道阻滞剂，是直接作用于窦房结。其负性肌力作用也与β受体无关。盐酸关附甲素的优点在于它的负性频率作用较负性肌力作用强约9倍;而盐酸维拉帕米只有1.7倍，又盐酸关附甲素不发生窦性静止，而盐酸维拉帕米有4/5发生窦性静止。所以较盐酸维拉帕米来得安全。目前看来，同时具有Na+，Ca++拮抗作用的药物有显著的治疗优点。而且，盐酸关附甲素与奎尼丁、慢心律和氯卡胺相比，其对INa抑制作用的起效浓度相近。根据它们产生RDB的开始动力学特征，盐酸关附甲素与奎尼丁相近。
盐酸关附甲素与其它抗心律失常药的毒性比较试验盐酸关附甲素与盐酸利多卡因、盐酸维拉帕米、心得安对心血管作用的比较对麻醉大鼠血压、心率、心电的影响取大鼠35只，体重为220±15g，♂♀兼用。分为生理盐水对照组，盐酸利多卡因组，心得安组，盐酸维拉帕米组和盐酸关附甲素组。乌拉坦1.2g/kgip麻醉。用WSQ型微量输液器股静脉恒速滴注(0.18-0.19ml/min)给药。颈动脉插管测定血压，用ECG-6501型心电图机测定Ⅱ导程心电图。每种药物取六个剂量观察该六个剂量的血压、心率、心电，并记录每种药物的致死量。
大鼠(N＝7)的平均致死量盐酸维拉帕米为20.2±3.1mg/kg，心得安为46.0±15.2mg/kg，盐酸利多卡因为67.2±14.8mg/kg，盐酸关附甲素为343.8±52.1mg/kg。表明盐酸维拉帕米的毒性最大，盐酸关附甲素毒性最小。盐酸维拉帕米减慢心率作用最强，但降压作用和毒性太大。随盐酸维拉帕米剂量增加，逐渐出现房室阻滞(QRS波脱落)，P波消失，而盐酸关附甲素在减慢心率的同时，它的毒性和降压作用相对较小。
实例1盐酸关附甲素的制备用工业乙醇渗漉提取黄花乌头1000克，药材按常规进行一般性的粉碎，收集渗漉的乙醇液，回收乙醇，得到浸膏，加入1%盐酸溶解，酸水液调pH3，静置酸水液析胶，滤除酸水液中沉淀，用石油醚脱脂，分去石油醚层，用浓氨氘碱化酸水液至pH5，再用氯仿萃取，收集氯仿液，减压回收氯仿，得到关附甲素粗品，用乙醇溶解，过滤，醇液加盐酸调至pH4，放置析晶，抽滤，得白色结晶3克，再用无水乙醇重结晶，在100℃干燥得白色晶体2.1克。收率2.1‰，MP.301℃。
元素分析C24H31NO6·HCl。
计算值(%)C61.86;H6.92;N3.01;O20.6;Cl7.61。
实验值(%)C61.86;H6.98;N3，12;O22.2。
高分辨质谱m/z 465.97(M+)分子量465.97实例2氢溴酸关附甲素的制备按常规浸泡、渗漉黄花乌头25公斤，药材常规粉碎，用工业乙醇先浸泡5天，后进行渗滤，收集醇液，回收乙醇，得到浸膏，加入2%盐酸溶解浸膏，调至pH3，倾出酸水液，静置析胶，滤除沉淀，用氯仿脱脂，分去氯仿层，酸水液再用2%NaOH水液调至pH10，用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷液，减压回收二氯甲烷，得到关附甲素粗品，加95%乙醇溶解，醇液加入氢溴酸，调至pH4.5，放置析晶，抽滤，得白色结晶300克，用无水乙醇重结晶，在90℃干燥得白色晶体37.5克，收率1.5‰，MP285℃。
游离碱元素分析C24H31NO6。
计算值(%)C67.1;H7.28;N3.26;O22.4。
实验值(%)C67.29;H7.33;N3.36;O21.98。
高分辨质谱m/z 429.2072(M+)分子量429.2072(计算值429.2142)实例3关附甲素的制备将2000克黄花乌头常规粉碎，用80%乙醇浸泡4天，收集浸泡液，回收乙醇，得浸膏，加稀盐酸溶解，调pH为4，滤出酸水液，用氯仿萃取三次，除去氯仿液，酸水液用浓氨水调pH至9，用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷萃取液，回收滤液至干，得关附甲素粗品，用95%乙醇溶解粗品，重结晶，再用丙酮重结晶，在70℃干燥得关附甲素4克，得率2‰，MP.198-199℃。
元素分析C24H31NO6。
计算值(%)C67.11;H7.28;N3.26;O22.37。
实验值(%)C67.15;H7.33;N3.36;O22.16。
高分辨质谱m/z 429.2074(M+)分子量429.2074(计算值429.2142)实例4关附甲素的制备前面操作同上例将关附甲素粗品，经氧化铝柱层析，常规操作，(中性氧化铝，Ⅲ-Ⅳ级)，然后依次用不同比例的环已烷，环已烷/乙酸乙酯、甲醇梯度洗脱，经薄层层析检查流份，流份30～54为一个层析斑点，合并洗脱液，回收至干，用丙酮重结晶，在60℃干燥得关附甲素，MP.199℃。
元素分析C24H31NO6。
计算值(%)C67.1;H7.28;N3.26;O22.4。
实验值(%)C66.90;H7.30;N3.40;O22.40。
高分辨质谱m/z 429.2080(M+)分子量429.2080(计算值429.2142)实例5注射液将盐酸关附甲素100.0克和注射用氯化钠77.2克，加全量的70%的注射用水，搅拌使溶解，加注射用水至全量2000毫升。加1.5%的针用活性碳，在50℃搅拌10分钟，粗滤去活性碳。用微孔滤膜(0.8μm)过滤至澄明。测pH值(应该为3.0-4.5)。充N2，灌封。100℃流通蒸气灭菌30分钟，即得盐酸关附甲素注射液。每2毫升含100.0毫克的盐酸关附甲素。
实例6注射用灭菌粉末将盐酸关附甲素100.0克和注射用氯化钠77.2克，于100℃真空干燥6小时，放冷，送入无菌分装室分装成1000支无菌粉针，每支含盐酸关附甲素100.0毫克。
权利要求
1.一种从中草药中用溶剂提取，回收提取液，得到浸膏，将浸膏转溶于酸水中，调pH2-4，静置酸水液析胶，滤除酸水液中沉淀制备关附甲素的方法，其特征在于所用中草药是毛茛科黄花乌头Aconitumcoreanum(Levl)Rapaics，滤除沉淀后的酸水液用亲脂性有机溶剂脱脂，除去亲脂性有机溶剂层，碱化酸水液至pH5-10，再用亲脂性有机溶剂萃取碱化的水液，收集萃取液，常压和/或减压回收有机溶剂，得到关附甲素粗品，用有机溶剂反复重结晶和/或用硅胶、氧化铝或大孔树脂柱层析精制，在50～100℃干燥，得到关附甲素精制品。
2.根据权利要求1所述制备关附甲素的方法，其特征在于脱脂或萃取用的有机溶剂可以是卤代烃、醋酸乙酯、醋酸甲酯、石油醚、环已烷或苯。
3.根据权利要求1所述制备关附甲素的方法，其特征在于碱化酸水液的碱可以是1-5%氢氧化钠水液、1-5%的氢氧化钾水液，浓氨水或Na2CO3。
4.根据权利要求1所述制备关附甲素的方法，其特征在于重结晶的有机溶剂可以是甲醇、乙醇、苯、乙醚或丙酮，最好是甲醇或无水乙醇。
5.根据权利要求1所述制备关附甲素的方法，其特征在于在用有机溶剂按常规操作重结晶时，可以加入生理上可接受的酸，调至pH3-5，制成关附甲素的盐。
6.含有活性成分关附甲素的药物，其特征在于关附甲素可以是以游离碱或生理上可接受的盐的形式存在。
7.根据权利要求6所述含关附甲素或其盐的药物，其特征在于关附甲素或其盐是与一般辅助剂和/或赋形剂混合。
8.根据权利要求6所述含关附甲素或其盐的药物，其特征在于可以治疗或预防心血管系统疾病。
9.根据权利要求8所述关附甲素或其盐用于治疗或预防心血管系统疾病，其特征在于治疗或预防心律失常。
10.根据权利要求9所述关附甲素或其盐用于治疗或预防心律失常，其特征在于治疗或预防室上性心动过速和/或房颤。
全文摘要
本发明是一种二萜生物碱的制备方法及其药物用途。从中草药黄花乌头中，用溶剂提取，回收提取液，得到浸膏，将浸膏转溶于酸水中，静置酸水析胶，滤除沉淀，用有机溶剂脱脂，除去有机溶剂后，碱化酸水液至pH5～10，再用有机溶剂萃取碱化的水液，收集萃取液，回收有机溶剂后得到关附甲素粗品，用有机溶剂反复重结晶或用柱层析法精制，在50～100℃干燥，得到关附甲素精制品。毒性低的天然结构的关附甲素及其生理上可接受的盐，可以制成各种剂型，用于治疗或预防心血管系统疾病。
文档编号C07G5/00GK1088827SQ93110509
公开日1994年7月6日 申请日期1993年1月1日 优先权日1993年1月1日
发明者刘静涵, 后德辉, 王秋娟, 张陆勇, 赵守训, 范炳尧 申请人:中国药科大学