环脂肽物的脱酰化方法

专利名称：环脂肽物的脱酰化方法
技术领域：
本发明涉及到酶技术。
具体地讲，本发明涉及使环状脂肽物的酰基侧链脱酰化的新型酰基酶以及用它进行脱酰化的方法。
进一步讲，本发明涉及由微生物Co1eophoma sp.F-11899株(FERM BP-2635)所产生的、使FR901379物质(特开平3-184921号公报记录)及其类似物的酰基侧链脱酰化的新型酰基酶，以及用该酶进行脱酰化的方法。
背景技术：
需要能够使环脂肽物，具体而言，需要能够使上述FR901379物质及其类似体的酰基侧链有效脱酰化的酰基酶。
发明公开本发明的发明者们为了得到能够使FR901379物及棘白菌素B，棘孢曲菌素A等FR901379物的类似体为代表的环脂肽物的酰基侧链脱酰化的新型酰基酶进行了大量研究。结果他们新发现一种微生物环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)产生的酰基酶；使有效地进行目的脱酰化成为可能。
以下说明该新型环状脂肽酰基酶及用该酶进行脱酰化方法的特征。
首先，对本发明环状脂肽酰基酶的生产菌进行说明。
具体而言新型环状脂肽酰基酶的生产菌为链霉菌属的环圈链霉菌No.4811株、环圈链霉菌No.8703株或链霉菌属类6907株。
以下为这些菌株的特征。
命名为环圈链霉菌No.4811的新型环状脂肽酰基酶的生产菌菌株(以后略称为No.4811)是从福岛县采集的土壤样品中新分离出的。以下为No.4811的菌学性状。各种培养基上的特征No.4811株在酵母浸膏-麦芽浸膏琼脂、燕麦粉琼脂、无机盐-淀粉琼脂、甘油-天冬酰胺琼脂、蛋白胨-酵母浸膏-铁琼脂及酪氨酸琼脂培养基上30℃培养14天后在光学和扫描电镜下观察到的发育特征列在表1。参照1978年的Methuen Handbook of Colour,Methuen,London的命名法对颜色进行命名。
表1 No.4811株在各种培养基上培养的特征培养基培养性状酵母浸膏-麦芽浸膏琼脂 G良好(ISP-2) A丰富、黄灰色(2B2)R茶色(7F4)S少量、茶色燕麦粉琼脂G良好普通(ISP-3) A丰富、黄灰色(2C3)R茶色(7F4)S微量、茶色无机盐-淀粉琼脂 G良好(ISP-4) A丰富、黄灰色(2C3)R黄茶色(5E4)S无甘油-天冬酰胺琼脂 G良好(ISP-5) A丰富、黄灰色(2C3)R茶色(6E4)S无蛋白胨-酵母浸膏-铁琼脂G普通(ISP-6) A贫乏、白色R亮茶色(6D5)S无酪氨酸琼脂G普通(ISP-7) A普通、黄灰色(2B2)R茶色(7F4)S无省略代号；G生长A气菌丝R生长里面的色S可溶性色素气菌丝的颜色从黄灰色到绿色，生长里面的色从黄茶色到茶色，可溶性色素为浅茶色，菌体内色素及可溶性色素均非pH敏感性。未见到类黑素的产生。生理学特征No.4811株的生理学特征总结在表2中。表2 No.4811株的生理学特征条件 性质生长温度范围 4.0-35.0℃明胶液化 +乳凝固 ±乳蛋白胨化 +淀粉分解 +类黑素产生 -碳源利用性D-葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-木糖 +肌醇 -甘露醇 +D-果糖 +L-鼠李糖 ±蔗糖 -棉子糖 -+阳性±弱阳性-阴性No.4811株的营养菌丝发育良好，有不规则分枝但无断裂。从营养菌丝延伸长出的气菌丝呈单纯分枝，形成长的孢子链。气菌丝的形状为直状、曲状，按Pridham等(Pridham,T.G等实用微生物学(Appl.Microbiol).6:54,1958)属于RF型。一个孢子链由20个以上的孢子构成。孢子的表面光滑，0.5～0.7×0.7～1.1μm大小，呈圆柱型。
未观察到菌核、孢子囊、游走孢子。细胞壁类型依照Becker等(Becker,BM.P.Lechevalier,R.E.Gordon and H.A.lechevalier通过整个细胞水解物的纸层析来快速区分诺卡菌属和链霉菌属实用微生物学，12:421-423,1964)、山口(Yamaguchi,T.形态独特放线菌的细胞壁组分的比较细菌学杂志，89:444-453,1965)等的方法，对全菌体的分解物进行分析，结果表明细胞壁的氨基酸中存在LL-二氨基庚二酸，因此认为该菌株的细胞壁类型为I型。
从以上的形态观察及化学分析的结果来看，若按Pridham等(Pridham,T.G.等实用微生物学，6:54,1958)的分类，No.4811株属于链霉菌属。在这里将该菌株与文献Shirling等(Shirling,E.B.和D.Gottlieb链霉菌类的典型培养物的合作描述。2．研究1的种类描述。国际系统细菌学杂志。18:69-189,1968；Shirling,E.B.和D.GottIieb链霉菌类的典型培养物的合作描述。3．研究1和2其它种类的描述。国际系统细菌学杂志。18:279-392,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb链霉菌类的典型培养物的合作描述。4．研究2、3和4的种类描述。国际系统细菌学杂志。19:391-512,1969)Skerman等(Skerman,V.BV.McGowan andP.H.A.Sneath统一细菌名单。修改版。美国微生物学联合会。华盛顿特区。1989及Moore等(Moore,W.EE.P.Cato andL.V.H.Moore细菌和酵母分类变化索引。美国微生物学联合会。华盛顿特区；1992)中记载的链霉菌属进行了比较。结果所记载的环圈链霉菌的性质与本株的性质基本一致。鉴于此，确定No.4811株为环圈链霉菌，命名为环圈链霉菌No.4811。
该环圈链霉菌No.4811株于平成7年12月27日以FERM P-15377保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮区305茨城县筑波市东1-1-3)，后又根据布达佩斯条约于平成9年2月3日以FERM BP-5808转移保藏。
命名为环圈链霉菌No.4811株的新型环脂肽酰基酶的生产菌菌株(以下略称作No.8703)是从福岛县采集的土壤样品中新分离出的。以下为No.8703株的菌学性状。各种培养基上的特征No.8703株在酵母浸膏-麦芽浸膏琼脂、燕麦粉琼脂、无机盐-淀粉琼脂、甘油-天冬酰胺琼脂、蛋白胨-酵母浸膏-铁琼脂及酪氨酸琼脂培养基上30℃培养14天后在光学和扫描电镜下观察到的发育特征总结在表3中。参照1978年的Methuen Handbook of Colour,Methuen,London的命名法对颜色进行命名。
表3 No.8703株在各种培养基上培养的特征培养基培养性状酵母浸膏-麦芽浸膏琼脂 G良好(ISP-2) A丰富、黄灰色(2B2)R灰茶色(5F4)S无燕麦粉琼脂G普通(ISP-3) A丰富、黄灰色(2C3)R灰茶色(4C4)S无无机盐-淀粉琼脂 G良好(ISP-4) A丰富、黄灰色(2C3)R暗灰色(1F6)S无甘油-天冬酰胺琼脂 G良好(ISP-5) A丰富、黄灰色(2C3)R茶青色 (4E5)S无蛋白胨-酵母浸膏-铁琼脂G普通(ISP-6) A贫乏、白色R黄茶色(5D5)S无酪氨酸琼脂G普通(ISP-7) A普通、黄灰色(2B2)R茶色(7F4)S无省略代号；G生长A气菌丝R生长里面的色S可溶性色素气菌丝的颜色从黄灰色到绿色，生长在里面的色从黄茶色到茶色，可溶性色素为浅茶色，菌体内色素及可溶性色素均无pH敏感性。在胰蛋白胨-酵母浸膏肉汤、蛋白胨-酵母浸膏-铁琼脂及酪氨酸琼脂上可看到类黑素。生理学特征No.8703株的生理学特征总结在表4中。表4 No.8703株的生理学特征条件 性质生长温度范围 4.0-35.0℃明胶液化 +乳凝固 ±乳蛋白胨化 +淀粉分解 +类黑素产生 -碳源利用性D-葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-木糖 +肌醇 -甘露醇 +D-果糖 +L-鼠李糖 +蔗糖 -棉子糖 -+阳性±弱阳性-阴性该菌株未利用肌醇、蔗糖和棉子糖。乳蛋白胨化。生长发育的温度范围为4.0-35℃。
No.8703株的营养菌丝发育良好，有不规则的分枝但无断裂。从营养菌丝延伸长出的气菌丝呈单纯分枝，形成长的孢子链。气菌丝的形状为直状、曲状，按Pridham等(Pridham,T.G等实用微生物学(Microbiol.6:54,1958)的分类属于RF型。一个孢子链由20个以上的孢子组成。孢子表面光滑，呈圆柱型。孢子的大小为0.5～0.8×0.6～1.1μm。未观察到菌核、孢子囊及游走孢子。细胞壁类型依照Becker等(Becker,BM.P.Lechevalier,R.E.Gordon and H.A.lechevalier通过整个细胞水解物的纸层析来快速区分诺卡菌属和链霉菌属实用微生物学，12:421-423,1964)、山口(Yamaguchi,T.形态独特放线菌的细胞壁组分的比较细菌学杂志，89:444-453,1965)等的方法，对全菌体的分解物进行分析，结果表明细胞壁的氨基酸中存在LL-二氨基庚二酸，因此认为该菌株的细胞壁类型为I型。
从以上的形态观察及化学分析的结果来看，若按Pridham等(Pridham,T.G.等实用微生物学，6:54,1958)的分类，No.8703株属于链霉菌属。在这里将该菌株与文献Shirling等(Shirling,E.B.和D.Gottlieb链霉菌类的典型培养物的合作描述。2．研究1的种类描述。国际系统细菌学杂志。18:69-189,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb链霉菌类的典型培养物的合作描述。3．研究1和2其它种类的描述。国际系统细菌学杂志。18:279-392,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb链霉菌类的典型培养物的合作描述。4．研究2、3和4的种类描述。国际系统细菌学杂志。19:391-512,1969)Skerman等(Skerman,V.BV.McGowan andP.H.A.Sneath统一细菌名称表。修改版。美国微生物学联合会。华盛顿特区。1989及Moore等(Moore,W.EE.P.Cato andL.V.H.Moore细菌和酵母命名变化索引。美国微生物学联合会。华盛顿特区；1992)中记载的链霉菌属进行了比较。结果所记载的环圈链霉菌的性质与本株的性质基本一致。鉴于此，确定No.8703株为环圈链霉菌，命名为环圈链霉菌No.8703。
该环圈链霉菌No.8703株于平成8年3月8日以FERM P-15507保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮区305茨城县筑波市东1-1-3)，后又根据布达佩斯条约于平成9年2月3日以FERM BP-5810转移保藏。
命名为环圈链霉菌No.6907株的新型环状脂肽酰基酶的生产菌菌株(以下略称作No.6907)是从福岛县采集的土壤样品中新分离出的。以下为No.6907株的菌学性状。各种培养基上的特征No.6907株在酵母浸膏-麦芽浸膏琼脂、燕麦粉琼脂、无机盐-淀粉琼脂、甘油-天冬酰胺琼脂、蛋白胨-酵母浸膏-铁琼脂及酪氨酸琼脂培养基上30℃培养14天后在光学和扫描电镜下观察到的发育特征总结在表5中。参照1978年的Methuen Handbook of Colour,Methuen,London的命名法对颜色进行命名。
表5 No.4811株在各种培养基上培养的特征培养基 培养性状酵母浸膏-麦芽浸膏琼脂 G良好(ISP-2)A丰富、黄灰色(白4A2)R灰橙色(5B6)S无燕麦粉琼脂 G普通(ISP-3)A丰富、青灰色(22C2)R亮茶色(4D4)S无无机盐-淀粉琼脂G良好(ISP-4)A丰富、青灰色(19C2)R茶色(6F4)S无甘油-天冬酰胺琼脂 G良好(ISP-5)A丰富、青灰色(22B2)R赤味茶色(8E4)S无蛋白胨-酵母浸膏-铁琼脂 G普通(ISP-6)A无R灰茶色(9F3)S褐色酪氨酸琼脂 G良好(ISP-7)A普通、黄白色(4A2)R暗品红色(13F3)S褐色省略代号；G生长A气菌丝R生长里面的色S可溶性色素气菌丝的颜色从黄灰色到青灰色，生长在里面的色从亮茶色到茶色，菌体内色素无pH敏感性。在胰白胨-酵母浸膏肉汤、蛋白胨-酵母浸膏-铁琼脂及酪氨酸琼脂上可看到类黑素。生理学特征No.6907株的生理学特征总结在表6中。表6 No.6907株的生理学特征条件性质生长温度范围9.0-40.0℃明胶液化 +乳凝固 +乳蛋白胨化 -淀粉分解 +类黑素产生 +碳源利用性D-葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-木糖 +肌醇 +甘露醇 +D-果糖 +L-鼠李糖 +蔗糖 +棉子糖 ++阳性±弱阳性-阴性该菌株利用了试验中所有的碳源肌醇、蔗糖和棉子糖。未进行乳蛋白胨化。生长发育的温度范围为9.0-40.0℃。
No.6907株的营养菌丝发育良好，有不规则分枝但无断裂。从营养菌丝延伸长出的气菌丝呈单纯分枝，形成长的孢子链。气菌丝的形状为直状、曲状或不完整的环状，按Pridham等(Pridham,T.G等实用微生物学(Appl.Microbiol).6:54,1958)属于RF或RA型。一个孢子链由20个以上的孢子构成。孢子的表面光滑，0.5～0.7×0.7～1.3μm大小，呈圆柱型。未观察到菌核、孢子囊、游走孢子。细胞壁类型依照Becker等(Becker,BM.P.Lechevalier,R.E.Gordon and H.A.lechevalier通过整个细胞水解物的纸层析来快速区分诺卡菌属和链霉菌属实用微生物学，12:421-423,1964)、山口(Yamaguchi,T.形态独特放线菌的细胞壁组分的比较细菌学杂志，89:444-453,1965)等的方法，对全菌体的分解物进行分析，结果表明细胞壁的氨基酸中存在LL-二氨基庚二酸，因此认为该菌株的细胞壁类型为I型。
从以上的形态观察及化学分析的结果来看，若按Pridham等(Pridham,T.G.等实用微生物学，6:54,1958)的分类，No.6907株属于链霉菌属。在这里将该菌株与文献Shirling等(Shirling,E.B.和D.Gottlieb链霉菌类的典型培养物的合作描述。2．研究1的种类描述。国际系统细菌学杂志。18:69-189,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb链霉菌类的典型培养物的合作描述。3．研究1和2其它种类的描述。国际系统细菌学杂志。18:279-392,1968；Shirling,E.B.和D.Gottlieb链霉菌类的典型培养物的合作描述。4．研究2、3和4的种类描述。国际系统细菌学杂志。19:391-512,1969)Skerman等(Skerman,V.BV.McGowan andP.H.A.Sneath统一细菌名称表。修改版。美国微生物学联合会。华盛顿特区。1989及Moore等(Moore,W.EE.P.Cato andL.V.H.Moore细菌和酵母命名变化索引。美国微生物学联合会。华盛顿特区；1992)中记载的链霉菌属进行了比较。结果未能鉴定到种。鉴于此，将该菌命名为链霉菌类No.6907。
该链霉菌类No.6907株于平成8年3月8日以FERM P-15506保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(邮区305茨城县筑波市东1-1-3)，后又根据布达佩斯条约于平成9年2月3日以FERM BP-5809转移保藏。
该发明中所讲“环状脂肽物”指含有多肽环，该环上侧链含有“酰基氨基”，该物质也可有其它的侧链。
该“环状脂肽物”的代表例为FR901379物质，该物质是微生物Coleophoma sp.F-11899株(FERM BP-2635)产生的。具有抗真菌活性的已知物(特开平3-184921号公报记载)，具有下面的结构式〔Ⅰa〕。

此外，FR901379的类似体是下面普通式〔Ⅰ〕中所示的化合物或其盐类。

〔式中，R1为酰基，R2为羟基或酰基氧基，R3为氢或羟基，R4为氢或羟基，R5为氢或羟基磺酰基氧基，R6为氢或氨基甲酰基〕该发明的新型环状脂肽酰基酶是链霉菌菌属的细菌产生的酰基酶，它能使环状脂肽物侧链的“酰氨基”脱酰化而形成“氨基”，具体地讲它能使物质FR901379或其盐的棕榈酰侧链或者使含有物质FR901379、上述普通式〔Ⅰ〕中所示的FR901379类似体或其盐的酰基侧链脱酰化，从而形状环状肽物质，具体地讲形成下面结构式〔Ⅱa〕中所示的化合物(FR179642物质)或其盐或

表含有物质FR179642如下面普通式〔Ⅱ〕所示的FR179642类似体或其盐。

〔式中R2、R3、R4、R5及R6代表与前面相同的基团〕。
化合物〔Ⅰ〕和〔Ⅱ〕的优选盐为常规应用的单盐或二盐，金属盐如碱金属盐(例如钠盐、钾盐等)，碱土类金属盐(例如钙盐、镁盐等)，铵盐，具有有机碱的盐(例如三甲胺盐，三乙胺盐，吡啶盐，甲基吡啶盐，二环己胺盐，N,N′-二苄基乙烯二胺盐等)，有机酸加成盐(如甲酸盐、乙酸盐、三氟醋酸盐，马来酸盐，酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐等)，无机酸加成盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)，氨基酸(如精氨酸，天冬氨酸、谷氨酸)等的盐。
优选的“低级烷基”是含有1～6个碳原子的直链或分枝状烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基。其它优选含1～4个碳原子的烷基，最优选甲基。
优选的“高级烷基”包括碳原子数为7～20的直链或分枝状烷基，如庚基、辛基、3,5-二甲基辛基、3,7-二甲基辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基，十三烷基，十四烷基，十五烷基，十六烷基，十七烷基，十八烷基，十九烷基和二十烷基。
优选的“低级烷氧基”包括直链或分枝状的烷氧基，如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，叔戊氧基，新戊氧基，己氧基和异己氧基。
优选的“高级烷氧基”包括直链或分枝状的烷氧基，如庚氧基，辛氧基，3,5-二甲基辛氧基，3,7-二甲基辛氧基，壬氧基，癸氧基，十一烷氧基，十二烷氧基，十三烷氧基，十四烷氧基，十六烷氧基，十七烷氧基，十八烷氧基，十九烷氧基，二十烷氧基等。
优选的“芳香基”包括任选含有低级烷基的苯基(如苯，苯基，甲苯基等)、萘基和蒽基等。
优选的“酰胺基”或“酰基”的酰基部分包括由羧酸，碳酸，氨基甲酸或硫酸衍生的脂肪酰基，芳香酰基、杂环酰基、芳香基置换的脂肪酰基，杂环置换的脂肪酰基。
优选的“酰基”包括低级链烷酰基(如甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，己酰基，新戊酰基等)，它可有1个或多个(优选1～3个)合适的替代物，如芳香基(例如苯基，萘基，蒽基等)，而该基团可有一个或多个(优选1～3)适合的替代物如卤素(例如氟、氯、溴、碘等)、羟基、所讲高级烷氧基、所讲芳香基等；所讲低级烷氧基；氨基酸；保护氨基酸〔优选的酰胺如低级烷氧基羰基氨基(例甲氧羰基氨基、乙氧羰基氨基、丙氧羰基氨基、丁氧羰基氨基、叔丁氧羰基氨基、戊氧羰基氨基、己氧羰基氨基等)等〕；二(低级)烷基氨基(例如二甲基氨基、N-甲基乙氨基、二乙氨基、N-丙基丁氨基、二戊氨基、二己氨基等)；低级烷氧亚氨基(例如甲氧亚氨基、乙氧亚氨基、丙氧亚氨基、丁氧亚氨基、叔丁氧亚氨基、戊氧亚氨基、己氧亚氨基等)；芳香(低级)烷氧亚氨基(例如苄氧亚氨基、苯基乙氧亚氨基，二苯甲基氧亚氨基等)如苯基(低级)烷氧亚氨基。该基团有一个或多个(优选1-3)适合的替代物如所讲高级烷氧基；杂环硫基(优选吡啶硫基)，具有一个或多个(优选1-3个)优选的取代基，知高级烷基(例庚基、辛基、2-乙基己烷、壬基、癸基、3,7-二甲基辛基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、3-甲基-10-乙基十二烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等)；杂环基团(例如噻吩基、咪唑基、吡唑基、呋喃基、四唑基、噻唑基、噻二唑基等)、它具有一个或多个(优选1-3个)合适的取代基，如胺、上述保护胺、上述高级烷基等等；高级链烷酰基(例如庚酰基、辛酰基、壬酰基、癸酰基、十一烷酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十四烷酰基、十五烷酰基、棕榈酰基、10,12-二甲基十四烷酰基、十七烷酰基、十八烷酰基、十九烷酰基、二十烷酰基等)；低级链烯酰基(例如丙烯酰基、甲基丙烯酰基、丁烯酰基、3-戊烯酰基、5-己烯酰基等)，可含有一个或多个(优选1-3)优选的取代基，如所讲芳香基，它可任选地含有一个或多个(优选1-3)优选的取代基如所讲高级烷氧基等；高级链烯酰基(例如4-庚烯酰基，3-辛烯酰基，3,6-癸烯酰基，3,7,11-三甲基-2,6,10-十二烷烯酰基，4,10-十七烷烯酰基，等)；低级烷氧碳酰基(例甲氧碳酰基，乙氧碳酰基，丙氧碳酰基，丁氧碳酰基，叔丁氧碳酰基，戊氧碳酰基，己氧碳酰基等)；高级烷氧羰基(例庚氧羰基，辛氧羰基，2-乙基己氧羰基，壬氧羰基，癸氧羰基，3,7-二甲基辛氧羰基，癸氧羰基，十二烷氧羰基，十三烷氧羰基，十四烷氧羰基，十五烷氧羰基，3-甲基-10-乙基十二烷氧羰基，十六烷氧羰基，十七烷氧羰基，十八烷氧羰基，十九烷氧羰基，二十烷氧羰基等)；芳香基氧羰基(例苯氧羰基，萘氧羰基等)；芳香基乙醛酰基(例苯基乙醛酰基、萘基乙醛酰基等)；可以含一个或多个取代基的芳香(低级)烷氧羰基，例如有硝基或低级烷氧基取代基的苯基烷氧羰基(例苄氧羰基，苯基乙氧羰基，对一硝基苄氧羰基，对-甲氧基苄氧羰基等)；低级烷基磺酰基(例甲基磺酰基，乙基磺酰基、丙基磺酰基，异丙基磺酰基、戊基磺酰基、丁基磺酰基等)；芳基磺酰基(例如苯基磺酰基、萘基磺酰基等)，它可含有一个或多个(优选1-3)优选的取代基，如所讲低级烷基、所讲高级烷氧基等等；芳香基(低级)烷基磺酰基(例如苄基磺酰基、苯乙基磺酰基、二苯甲基磺酰基等)，例如苯(低级)烷基磺酰基；及芳酰基(例如苄酰基、萘酰基、蒽羰基等)，它可有一个或多个(优选1-5)优选的取代基，如所讲卤素；低级烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基等)；所讲高级烷基；低级烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等)，它可有一个或多个(优选1-10)合适的取代基，如所讲的低级烷氧基、所讲的卤素、芳香基等等；高级烷氧基(例如庚氧基、辛氧基、2-乙基己氧基、壬氧基、癸氧基、3,7-二甲基辛氧基、十一烷氧基、十二烷氧基、十三烷氧基、十四烷氧基、十五烷氧基、3-甲基-10-乙基十二烷氧基、十六烷氧基、十七烷氧基、十八烷氧基、十九烷氧基、二十烷氧基等等)，它们含有一个或多个(优选1-17)优选的取代基，如上述卤素等等；高级链烯氧基(如3-庚烯氧基，7-辛烯氧基、2,6-辛二烯氧基、5-壬烯氧基、1-癸烯氧基、3,7-二甲基-6-辛烯氧基、3,7-二甲基-2,6-辛二烯氧基、8-十一烯氧基、3,6,8-十二三烯氧基、5-十三烯氧基、7-十四烯氧基、1,8-十五-戊-十二烯氧基、15-十六烯氧基、11-十七烯氧基、7-十八烯氧基、10-十九烯氧基、18-二十烯氧基等)；羧基；上述芳香基可含有一个或多个(优选1-3)合适的取代基，如上述高级烷氧基等；芳氧基(例如苯氧基、萘氧基、蒽氧基等等)，它可含有一个或多个(优选1-3)合适的取代基，如上述低级烷氧基和上述高级烷氧基。
上述“酰基”的实例中，优选高级链烷酰基，最优选的是棕榈酰基。
“酰氧基”中合适的“酰基”可为前面所提到的“酰基”基团。
优选的“酰氧基”包括低级链烷酰氧基(例甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基、异丁酰氧基、戊酰氧基、己酰氧基、新戊酰氧基等)或磷酰氧基。
本发明的新型环状脂肽酰基酶可通过在培养基中培养象环圈链霉菌No.4811株(FERM BP-5808)、环圈链霉菌No.8703株(FERM BP-5810)、或链霉菌类No.6907株(FERM BP-5809)等属于链霉菌属的酰基酶生产菌株而获得。
通常情况下是在含有可同化的碳源和氮源的水性培养基中，优选在通气良好的条件下如振荡培养、深部培养等条件下培养该新型的酰基酶生产菌株而产生该酰基酶。
培养基中优选的碳源为葡萄糖、木糖、甘油、淀粉、糊精等碳水化合物。其它的碳源可有麦芽糖、鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、甘露糖、水杨苷、琥珀酸钠盐等等。
优选的氮源有酵母浸膏、蛋白胨、麸质粉、棉子粉、大豆粉、谷物浸液、干酵母、小麦胚芽、羽毛粉、花生粉等以及硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵等的铵盐、尿素、氨基酸等无机或有机氮化合物等。
若碳源和氮源优选联合应用的时候，通常使用含有适量生长因子和一定量的无机营养物的低纯度物质，没有必要使用纯化物。根据需要可向培养基中添加碳酸钠或碳酸钙、磷酸钠或磷酸钾、氯化钠或氯化钾、碘化钠或碘化钾、镁盐、铜盐、钴盐等无机盐。特别是当培养基中产生明显气泡时，有必要加入液体石蜡、脂肪油、植物油、矿物油或者硅等消泡剂。
大量生产该新型酰基酶时，优选深部通气培养的条件，小量生产时可在烧瓶或瓶中进行振荡培养或表面培养。此外，当在大型罐内培养时为了避免新型酰基酶的生产线中的生长延迟，优选应用微生物前培养将细菌接种到生产罐中。即，在较少量的培养基上接种微生物的孢子或菌丝，培养该接种培养物，首先生产前培养接种物，然后将所培养的前培养接种物无菌转移到大容量发酵罐中。生产该前培养接种物的培养基可与生产新型酰基酶所使用的培养基基本上一致也可不同。
可用多种方法进行培养混合物的搅拌及通气。可用推进器或类似的搅拌装置进行搅拌，或转动或振荡发酵器、选用各种泵装置，或者向培养基中通入灭菌空气。可将灭菌空气通过发酵混合物进行通气。
发酵通常在大约20℃～32℃的温度范围，优选25～30℃、pH6～8、进行50-150小时，但可依据发酵条件及发酵规模进行优选的调整。
可用回收其它已知生物活性物质时通常使用的方法从培养基中回收这样所生产的新型酰基酶。在培养菌丝中及滤液中可找到所生产的新型酰基酶，因此，培养肉汤经过滤或离心所得的菌丝及滤液经传统的方法进行分离、纯化、如减压浓缩，冷冻干燥，常用溶剂的抽提，pH调整，阴离子交换树脂或阳离子交换树脂、非离子吸附树脂等常用树脂的处理，活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、铝等常用吸附剂的处理、结晶、再结晶等可得到该新型酰基酶。
以下列举实施例来具体说明由环圈链霉菌No.4811株、环圈链霉菌No.8703株、链霉菌类No.6907株生产酰基酶的情况，但该发明并不局限于此。实施例1-1
环圈链霉菌No.4811株产生的酰基酶的制备将30ml由玉米淀粉1％、葡萄糖1％、花生粉0.5％、大豆粉0.5％、干酵母0.5％、碳酸钙0.2％组成的种子培养基分别注入到100ml三角烧瓶中，120℃灭菌20分钟，接种1-2铂环量的环圈链霉菌No.4811株的斜面琼脂培养物，30℃振荡培养3天作为种子培养。
接着将蔗糖4％、花生粉1％、干酵母1％、磷酸二氢钠0.05％、磷酸二氢钾0.12％、硫酸镁·7H2O 0.025％组成的生产培养基的pH调整到6.5，将100ml该生产培养基注入到500ml三角烧瓶中120℃灭菌20分钟，将前述种培养物2ml接种其上，30℃振荡培养3天作为酵母培养液。实施例1-2环圈链霉菌No.8703株产生的酰基酶的制备将30ml玉米淀粉1％、葡萄糖1％、花生粉0.5％、大豆粉0.5％、干酵母0.5％、碳酸钙0.2％组成的种子培养基注入到100ml三角烧瓶中，120℃灭菌20分钟，接种1-2铂环量的环圈链霉菌No.8703株斜面琼脂培养物，30℃振荡培养3天作为种培养。
然后将蔗糖4％、花生粉1％、干酵母1％、磷酸二氢钠0.05％、磷酸氢二钾0.12％、硫酸镁·7H2O 0.025％组成的生产培养基的pH调整为6.5，将该生产培养基100ml注入到500ml三角烧瓶中，120℃灭菌20分钟，接种2ml前述种培养于其上，30℃振荡培养3天作为酵母培养液。实施例1-3链霉菌类No.6907株生产的酰基酶的制备将30ml由可溶性淀粉6％、脱脂大豆粉4％、碳酸钙0.5％组成的种子培养基注入到100ml三角烧瓶中，120℃灭菌20分钟，接种链霉菌类No.6907株斜面琼脂培养的1-2铂环量，30℃振荡培养3天作为种培养。
然后将蔗糖4％、花生粉1％、干酵母1％、磷酸钙0.5％组成的生产培养基的pH调整到6.5，将该生产培养基100ml注入到500ml三角烧瓶中，120℃灭菌20分钟，接种2ml前述种培养于其上，30℃振荡培养4天作为酵母培养液。实施例1-4属于链霉菌菌属的保存株生产酰基酶的制备对于(财)发酵研究所(大阪市淀川区十三本町2-17-85)分给的属于链霉菌菌属的保存株，采用与实施例1-1相同的方法，可得到与环圈链霉菌No.4811株相同的酵母培养液。
灰色链霉菌灰色亚种(Streptomyces griseus subsp.griseus)IFO 13189接着是用本发明的新型环状脂肽酰基酶对环状脂肽抗真菌物(例如FR901379及其类似体)的酰基侧链进行脱酰化的方法，对此进行详细说明。
本发明脱酰化的实施可如下进行。
将属于链霉菌菌属、生产新型酰基酶的微生物接种到适当的培养基上，约20-35℃振荡培养数日，以此作酵母培养液。将该培养液加入到底物FR901379等环状脂肽物中，45～60℃。pH保持约6.0～9，通过高速液相色谱(HPLC)来检测，分离FR179642等物的环状肽核。
列举以下实施例来对本发明的脱酰化方法进行具体说明，但本发明并不局限于此。实施例2-1向实施例1-1中所得的环圈链霉菌No.4811株的培养液700μl中加入FR901379物的水溶液(100mg/ml)100μl(FR901379物10mg；8.35μmol)、甲醇100μl和缓冲液(0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0)100μl,30℃反应30分钟，反应终了后加4％醋酸1ml终止反应，加入2ml甲醇，用滤膜(0.45μm)过滤，除去高分子蛋白等之后，通过HPLC、在210nm处监测生成的FR179642物、测定酰基酶活性。
HPLC由波长可变的UV检测器(岛津SPD-10A)、泵(岛津LC-10AD)及积分装置(岛津C-R6A)构成，使用LiChrospher100RP-18(e)(250mm×4mmi.d.、粒径5μm)作固相，以3％己腈/0.5％磷酸二氢铵作移动相，以1ml/分的流速洗脱物质FR179642。FR179642的保持时间大约为6.3分钟。以该结果来计算物质FR179642的生成量，为730μg(0.78μmol)。实施例2-2向700μl实施例1-2中所得的环圈链霉菌No.8703株的培养液中加入物质FR901379的水溶液(100mg/ml)100μl(FR901379物10mg；8.35μmol)、甲醇100μl和缓冲液(0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0)100μl,30℃反应30分钟。反应终了后，加入4％醋酸1ml终止反应，加入2ml甲醇，用滤膜(0.45μm)过滤，除去高分子蛋白后，通过HPLC在210nm处监测所生成的FR179642物并测定酰基酶活性。
HPLC由波长可变的UV检测器(岛津SPD-10A)、泵(岛津LC-10AD)及积分装置(岛津C-R6A)构成，使用LiChrospher100RP-18(e)(250mm×4mmi.d.、粒径5μm)作固相，以3％乙腈/0.5％磷酸二氢钠作移动相，以1ml/分的流速洗脱物质FR179642。物质FR179642的保持时间约为6.3分钟。用该结果计算FR179642的生成量，为830μg(0.89μmol)。实施例2-3将FR901379物的水溶液(100mg/ml)100μl(FR901379物为10mg38.35μmol)100μl、甲醇100μl和缓冲液(0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液；pH6.0)100μl加入到实施例1-3中所得的链霉菌类No.6907株的培养液700μl中，30℃反应30分钟。反应终了后加入4％醋酸1ml终止反应，加入2ml甲醇，用滤膜(0.45μm)过滤，除去高分子蛋白质等物后，通过HPLC于210nm监测生成的FR179642物并测定其酰基酶活性。
HPLC由波长可变的UV检测器(岛津SPD-10A)、泵(岛津LC-10AD)及积分装置(岛津C-R6A)构成，LiChrospher100RP-18(e)(250mm×4mmi.d.、粒径5μm)作固相，以3％乙腈/0.5％磷酸二氢钠作移动相，以1ml/分的流速洗脱物质FR179642。FR179642的保持时间约6.3分钟。以该结果计算FR179642的生成量为560μg(0.60μmol)。用Lineweaver-Burk法测定时Km值为257μm,Vmax为14.3U/mg-蛋白质。实施例2-4将棘孢曲菌素A的二甲基亚砜溶液(100mg/ml)100μl(棘孢曲菌素A10mg；9.65μmol)含有1.2M KCl的500mM磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)500μl、水300μl加入到实施例1-3中所得的链霉菌类No.6907株的培养液100μl中，40℃反应15分钟。用4％醋酸1ml终止反应，加入甲醇2ml后用滤膜(0.45μm)过滤除去高分子蛋白，之后通过HPLC于210nm监测所生成的棘孢曲菌素A核物质并测定酰基酶活性。HPLC由波长可变的UV检测器(岛津SPD-10A)、泵(岛津LC-10AD)及积分装置(岛津C-R6A)构成，使用LiChrospher 100RP-18(e)(4mm×250mmi.d.、粒径5μm(Merck))作固相，以4％乙腈/1％磷酸二氢铵作移动相，以1ml/分的流速洗脱棘孢曲菌素A核物质。棘孢曲菌素A核物质的保持时间约8.7分钟。以该结果计算棘孢曲菌素A核物质的生成量为370μg(0.47μmol)。用Lineweaver-Burk法测定时Km值为279μm,Vmax为16.8U/mg-蛋白质。实施例2-5将棘白菌素B的二甲基亚砜溶液(100mg/ml)100μl(棘白菌素B为10mg；9.43μmol)100μl、含1.2M KCl500mM磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液(pH7.0)500μl、水300μl加入到实施例1-3中所得的链霉菌类No.6907株的培养液100μl中，40℃反应15分钟。用1ml 4％醋酸终止反应，加入2ml甲醇后用滤膜(0.45μm)过滤，除去高分子蛋白质等，之后通过HPLC于210nm监测生成的棘白菌素B核物质并测定酰基酶活性。HPLC由波长可变的UV检测器(岛津SPD-10A)、泵(岛津LC-10AD)及积分装置(岛津C-R6A)构成，用LiChrospher 100RP-18(e)(4mm×250mmi.d.、粒径5μm(Merck))作固定相，以4％乙腈/1％磷酸二氢铵作移动相，以1 ml/分的流速洗脱棘白菌素B核物质。棘白菌素B核物质的保持时间约8.7分钟。以该结果计算棘白菌素B核物质的生成量为90μg(0.11μmol)。用Lineweaver-Burk法测定时Km值为146μm,Vmax为7.85U/mg-蛋白质。
应用链霉菌属的本发明新型酰基酶的生产菌所生产的酰基酶对环状脂肽抗真菌物(例物质FR901379)的酰基侧链进行脱酰化过程中的特征在下面论述。
这些数据是应用实施例2-1、2-2或2-3中所述的实施方法、改变缓冲液的种类(0.5M柠檬酸钠缓冲液、0.5M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液和Tris-HCl缓冲液的适当组合)、反应温度、甲醇的添加浓度等而得到的。各种酰基酶的活性以反应终了时物质FR179642的浓度(用HPLC测定)表示。
反应时的最适pH试验1-1环圈链霉菌No.4811株生产酰基酶的最适pH

试验1-2环圈链霉菌No.8703株生产酰基酶的最适pH

试验1-3链霉菌类6970株生产酰基酶的最适pH

试验2-2环圈链霉菌No.8703株生产酰基酶的最佳温度

试验2-3环圈链霉菌No.6907株生产酰基酶的最佳温度

以上结果表明，在本发明实施例中对于每一酰基酶反应时的最佳温度为40-60℃。
反应时添加甲醇的效果试验3-1用环圈链霉菌No.4811株生产的酰基酶进行反应时甲醇的效果

试验3-2用环圈链霉菌No.8703株生产的酰基酶进行反应时甲醇的效果

试验3-3链霉菌类No.6907株生产的酰基酶进行反应时甲醇的效果

以上结果表明，在本发明的实施例中对于每一酰基来讲，向反应液中加入5-20％的甲醇，活性会提高1.6～2.2倍。
下面对由培养链霉菌属的酰基酶的生产菌而得到的环状脂肽酰基酶进行具体说明。·由链霉菌类6907株而来的酰基酶的特征1)作用能催化FR901379及棘白菌素B、棘孢曲菌素A等FR901379物的类似体所代表的环状脂肽物的脂质酰基部分脱酰化。2)最佳pH:pH8～93)作用优选的温度范围50℃附近4)抑制、活化及稳定性甲醇反应液中的含量到10％时呈浓度依赖性活化作用，此浓度以上为抑制作用。5)分子量纯化的该酶经SDS-PAGE后分出2带。
大片段肽；61kD
小片段肽；19kD6)结晶构造纯化的蛋白质量少，未得到结晶。7)氨基酸分析N末端氨基酸序列大片段肽；Ser-Asn-Ala-Val-Ala-Phe-Asp-Gly-Ser-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Gly小片段肽；Gly-Ser-Gly-Leu-Ser-Ala-Val-Ile-Arg-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Gly-Ile-Pro-His-His-Val-Ala8)底物特异性对FR901379、棘白菌素B及棘孢曲菌素A有催化作用。但对FR901469无效。
为了对本发明的酰基酶进行具体说明，列举了以下实施例，但本发明并不局限于此。酰基酶的纯化实施例3低温下、用1.5M KCl搅拌抽提实施例1-3中所得的链霉菌类No.6907株的培养液，用No.2滤纸所得的抽提滤液在UF膜(旭化成；AIP-1010)上脱盐(20mM Tris-HCl缓冲液(pH9)置换，过HP-20柱所得流出液上DEAE-Toyopearl柱(Cl-型)，用含0.3M NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液(pH9)洗脱。向活性级分中添加、溶解0.5M相当量的(NH4)2SO4，过Phenyl-Toyopeanl柱，用含0.1M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8)洗脱。用DF膜(旭化成；SIP-0013)将所得活性级分脱盐浓缩(20mMTris-HCl缓冲液(pH9)置换)，在YMC-Diol柱上进行凝胶过滤(移动相含0.2M NaCl的0.1M磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液pH7.0)，再由用递相系的Cosmosil 5C4-AR-300柱对活性级分进行分离纯化(移动相(A液)0.5％三氟醋酸。(B液)0.5％三氟醋酸-80％乙腈、A∶B=60∶40→40∶60(线性梯度))。该纯化的酰基酶经SDS-PAGE分出2条带。由此得到分子量为61kD和19kD的2种肽。底物特异性FR901469物是由真菌No.11243株(FERMBP-3373)所产生的、具有抗真菌活性的已知物质(WO92/19468号公报记载)，是具有下面结构式〔Ⅲ〕

的化合物。
与本发明的新型酰基酶同样具有脱酰化作用的来源于犹他游动放线菌(Actinoplanes utahensis)的酰基酶(特开平4-228072号公报记载)对前面所讲化合物FR901469或其盐具有催化活性，能产生下面结构式〔Ⅳ〕<p>试验1-3链霉菌类6970株生产酰基酶的最适pH

以上结果表明，本发明的实施中对于每一酰基酶来讲反应在弱酸性(pH4附近)以上进行，pH值一高反应速度就上升。
反应的最适温度试验2-1环圈链霉菌No.4811株生产酰基酶时的最佳温度

生产FR901379物的Coleophoma sp.F-11899株及生产本发明酰基酶的环圈链霉菌No.4811株、环圈链霉菌No.8703株及链霉菌类No.6907株保藏于通商产生省工业技术院生命工学工业技术研究所(茨城县筑波市东1-1-3)。
微生物 保藏号Coleophoma sp.F-11899株 FERM BP-2635Streptomyces anulatus No.4811株 FERM BP-5808Streptomyces anulatus No.8703株 FERM BP-5810Streptomyces sp.No.6907株FERM BP-5809No.11243株 FERM BP-337权利要求
1．由链霉菌属菌而来的环脂肽酰基酶。
2．权利要求1的酰基酶，它能催化通式〔Ⅰ〕
〔式中，R1为酰基，R2为羟基或酰氧基，R3为氢或羟基，R4为氢或羟基，R5为氢或羟基磺酰氧基，及R6为氢或氨基甲酰基〕所示的环状脂肽化合物或其盐中R1的酰基脱酰化，能产生通式〔Ⅱ〕
〔式中，R2、R3、R4、R5和R6代表与前相同的基团〕中所示的环肽化合物或其盐。
3．权利要求2的酰基酶，其特征在于权利要求2中R5为羟基磺酰氧基和R6为氨基甲酰基。
4．权利要求1的酰基酶，其特征在于酰基酶的生产菌为环圈链霉菌。
5．权利要求1的酰基酶，其特征在于酰基酶的生产菌为环圈链霉菌No.4811株。
6．权利要求1的酰基酶，其特征在于酰基酶的生产菌为环圈链霉菌No.8703株。
7．权利要求1的酰基酶，其特征在于酰基酶的生产菌为链霉菌类No.6907株。
8．具有下列性质的权利要求1的酰基酶1)作用催化FR901379及棘白菌素B、棘孢曲菌素A等FR901379物类似体所代表的权利要求1的环脂肽物的脂质酰基部分脱酰化；2)最佳pH:pH8～9；3)作用优选的温度范围50℃附近4)抑制、活化及稳定性甲醇反应液中含量达10％呈浓度依赖性的活化作用，浓度高于此则呈抑制作用；5)分子量大片段肽61kD小片段肽19kD6)氨基酸分析N末端氨基酸序列大片段肽Ser-Asn-Ala-Val-Ala-Phe-Asp-Gly-Ser-Thr-Thr-Val-Asn-Gly-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Gly小片段肽；Gly-Ser-Gly-Leu-Ser-Ala-Val-Ile-Arg-Tyr-Thr-Glu-Tyr-Gly-Ile-Pro-His-His-Val-Ala7)底物特异性对FR901379、棘白菌素B及棘孢曲菌素A有催化作用，但对FR901469无作用。
9．权利要求8的酰基酶，其特征在于酰基酶的生产菌为链霉菌类No.6907株。
10．生产权利要求1的酰基酶的属于链霉菌属的酰基酶生产菌。
11．生产权利要求1的酰基酶的环圈链霉菌生产菌。
12．环圈链霉菌No.4811。
13．环圈链霉菌No.8703。
14．链霉菌类No.6907。
15．环肽物或其盐的制备方法，它是通过将环脂肽物或其盐与生产菌为链霉菌属的酰基酶的粗提或纯化酶液接触，对其脂质部分进行脱酰化而形成的。
16．通式〔Ⅱ〕
〔式中，R2、R3、R4、R5和R6代表与后相同的基团〕中所示环肽化合物或其盐的制备方法，其特征在于通式〔Ⅰ〕
〔式中，R1为酰基，R2为羟基或酰氧基，R3为氢或羟基，R4为氢或羟基，R5为氢或羟基磺酰氧基，及R6为氢或氨基甲酰基〕所示的环脂肽化合物或其盐在水性溶剂中与培养属于链霉菌属的酰基酶生产菌所得的酰基酶的粗提或纯化酶液接触进行。
17．权利要求16的制备方法，其特征在于权利要求16的式中R5为羟基磺酰氧基，及R6为氨基甲酰基。
18．权利要求15的制备方法，其特征在于酰基酶的生产菌为环圈链霉菌。
19．权利要求15的制备方法，其特征在于酰基酶的生产菌为环圈链霉菌No.4811。
20．权利要求15的制备方法，其特征在于酰基酶的生产菌为环圈链霉菌No.8703。
21．权利要求15的制备方法，其特征在于酰基酶的生产菌为链霉菌类No.6907。
全文摘要
环脂肽酰基酶,它能有效地使环脂肽化合物,具体而言,它能使下面通式[Ⅰ]中所示的FR901379物及其类似体的酰基侧链脱酰化,以及用该酰基酶制备环脂肽物的方法。通式[Ⅰ]如右式[式中,R
文档编号C07K7/56GK1218507SQ9719447
公开日1999年6月2日 申请日期1997年3月6日 优先权日1996年3月8日
发明者上田聪, 田中美穗, 江崎正美, 坂本宪俊, 桥本正治, 大烟畅敬, 平井胜, 山下道雄 申请人:藤泽药品工业株式会社