专利名称：用于亲水分子脂质化的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明广义上涉及生物和医药领域。具体而言，本发明涉及适于提高哺乳动物吸收和保留亲水分子，尤其是肽和蛋白质的方法和组合物。
生物技术的日新月异使具有治疗活性的纯蛋白质及肽的大量生产成为可能。通常，此类试剂中的大多数只有在通过侵入性途径例如注射给药后才能发挥其治疗作用。很多蛋白质的半衰期很短，因此只有通过频繁的注射给药才可以保持这些试剂的有效浓度。虽然蛋白质的注射给药是体内给药的最有效方式，但患者对多次注射的耐受性极差。此外，药物的注射需要训练有素并且这些专业人士不能总受到患者的推辞。在通过蛋白质类药物挽救生命的情况下，注射给药能被病人所接受。但是，当蛋白质类药物仅是数种可行治疗中的一种时，患者可能无法接受蛋白质和肽的注射。因此，需要开发蛋白质和肽的其他给药途径。
所述其他途径可以包括经颊、经鼻、口服、经肺、直肠和经眼给药。无一例外的是，这些途径虽然比非肠道给药途径低效，但由于给患者提供了方便和可控性，所以它们仍比非肠道途径更易被接受。口服给药尤其可取，这是由于它最方便并且最具有患者接受性。
将机体内部与外界分隔的粘膜屏障(例如胎(G1.)、眼、肺、直肠和鼻的粘膜)包含着一层紧密连接的细胞单层，它对分子的转运进行严格调节。屏障内的各个细胞通过紧密接点相连，这些紧密接点调节着进入细胞间隙的入口。因此，粘膜位于生理屏障的第一级，透膜转运则是依赖于跨细胞途径或细胞旁侧途径[Lee.V.H.L.,CRC.Critical Rev.Ther.Drug Delivery Sys.,5:69-97(1988)]。
通过水紧密接点的细胞旁转运仅限于小分子(MW＜1kDa)，并且基本上是以浓度梯度为驱动穿过粘膜的扩散过程[Lee.(1988),supra:Artursson.P.,&Argnusson.C.,J.Pharm.Sci.,79:595-600(1990)]。紧密接点包括少于0.5％的粘膜总表面积[Gonzalez-Maniscal,L.M.et al.,J Membrane.Biol.,86:113-125(1985)；Vetvlcka,V.&Lubor.F.,CRC Critical Rev.Ther.DrugDeliv.Sys.,5:141-170(1988)]；所以，它在蛋白质药物的跨膜转运中起次要作用。
倘若药物的物化性质适合穿过疏水性细胞屏障进行转运时，较小药物的跨细胞转运显然是有效的。然而，蛋白质和肽的跨细胞转运仅限于胞转作用[Shen,W.C.,et al.,Adv.Drug Delivery Rev.,8:93-113(1992)]。胞转(胞吞转运)是一个复杂的过程，其中蛋白质和肽从细胞一侧被摄取到吞噬泡内，随后被往返转运并穿过细胞以到达细胞的另一侧，在那里它们自内吞噬泡内排出[Mostov,K.E.&Semister,N.E.细胞学，43:389-390(1985)]。粘膜屏障的细胞膜是疏水脂质双层，该双层对于亲水性带电大分子，例如蛋白质和肽不具有亲和力。此外，粘膜细胞可分泌粘蛋白，这些粘蛋白是许多大分子转运的障碍[Edwards,P.，英国药物杂志.，34:55-56(1978)]。因此，除蛋白质和肽的特定转运机制之外，其固有的跨粘膜屏障转运几乎可以被忽略。
除对蛋白质和肽的转运构成一个紧密物理屏障之外，粘膜屏障还含有可以在蛋白质和肽跨膜之前、之后和期间将起降解作用的多种酶。这样的屏障被称作酶屏障。酶屏障是由内肽酶和外肽酶组成，这些酶使蛋白质和肽的末端或结构内部发生断裂。人们已研究了若干种粘膜的酶活性，研究结果证实在白兔的颊、鼻、直肠和鞘的粘膜匀浆中实质上存在蛋白酶活性，这些活性可以与髂骨内所存在的蛋白酶活性相比[Lee，等人(1988)supra]。因此，在不考虑粘膜时，存在的酶屏障将在蛋白质和肽分子的降解中发挥强有力的作用。
肽的N末端和C末端都带电，并且带电侧链的存在赋予上述大分子以较高的亲水特性。另外，带电侧链的存在也意味着蛋白质和肽具有强烈的键合氢的能力；据证实，这种H-键合性能在抑制极小肽的跨细胞膜转运时发挥主要作用[Conradi,R,A,et al,Pharm.Res.,Res.,8:1453-1460(1991)]。所以，蛋白质和肽的大小以及亲水性共同严重制约着它们的跨粘膜屏障的转运。
改变粘膜屏障物理性质的方法之一是采用渗透促进剂。渗透促进剂的使用是基于低分子量的试剂对细胞屏障的破坏，所述低分子量的试剂可以使细胞膜流化[Kaji,H.等人.，生命科学.，37:523-530(1985)]、打开紧密接点[Inagaki,M.et al.,Rhinology,23:213-221(1985)]以及在细胞膜内造孔[Gordon,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:7419-7423(1985)；Lee,V.H.L.et al.,Critical Reviews in therapeutic Drug Carrier Systems,CRC Press,8:91-192(1992)]。应用这些试剂将导致屏障完整性的非特异丧失，也可以造成对多种大分子的吸收而这些大分子却对体内细胞有毒。
蛋白酶抑制剂已同蛋白质和肽联合给药，并且已在增加上述大分子的体内吸收中表现出一些有限的活性[Kidron,M.，等人.，生命科学.，31:2837-2841(1982)；Takarol,K.，等人.，生化、生物物理研究通讯.，137:682-687(1986)]。该途径的安全性和长效性仍在彻底研究中。
前药是基于保护肽不被酶降解和识别的肽修饰方式。这可以通过取代肽结构内的氨基酸D-型、通过酰胺化和酰化作用来阻断肽上的脆弱基团、反转肽的手性以及在肽结构内引入构型制约因素来达到。合成前药仅适用于具有易识别结构域的活性的小肽。
减小分子的大小是提高蛋白质转运功效的另一种可行方式。然而，需要在尝试降低大小前映象出蛋白质的活性位点。通常，这种方式难以适合多数蛋白质。
利用其性质的影响力，载体配体可以改变细胞的摄取作用及蛋白质和肽的转运特性。这种方式的实质是，细胞不通透性蛋白质或肽共价附着在易转运至细胞内的载体上。载体配体的胞吞和胞转机制在判定载体对提高蛋白质和肽转运的适合性时很重要。所述大分子载体是亲水性的并且不在膜内分配。因此，载体对细胞膜的亲和力可导了大的高分子载体向细胞内的转运。通常，大分子偶联物的摄取是从与细胞膜的结合开始。载体与细胞的结合可以是特异性(例如抗体与细胞表面抗原的结合)、非特异性(阳离子性配体或凝集素与细胞表面糖类的结合)或由受体介导的(转铁蛋白或胰岛素与其受体的结合)。一旦载体键合在细胞表面，它就被摄入吞噬泡内，进而这些吞噬泡被逐步加工并且通过数种途径。一种途径是，所述吞噬泡再循环回其内陷的膜位置。另一种破坏偶联物的途径是与溶酶体融合。其它导致偶联物胞吞的途径之一是，吞噬泡在相对于进入位的侧膜上发生融合。
胞吞和胞转过程之间的正确平衡决定着蛋白质偶联物向其靶位的传递。例如，胞吞可以决定靶细胞摄取偶联物的程度，但胞转决定了偶联物是否能够到达其靶位[Shen.et al.(1992),supra]。为使吸收顺利通过G1道，偶联物必须与G1粘膜的顶膜结合、逐渐进入膜细胞、跨细胞传递并最终自基底外侧膜释放。
现有文献有许多报导证实，非特异性载体，例如聚赖氨酸[Shen,W.C.&Ryser,H.J.P.,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,78:7589-7593(1981)]和凝血素[Broadwell,R.D.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:632-645(1988)]，特异性载体，例如转铁蛋白[Wan,J.et al.，生物化学杂志.，267:13446-13450(1992)]，脱唾液酸糖蛋白[Seth,R.,et al,传染病杂志，168:994-999(1993)]以及抗体[Vitetta,E.S.，临床免疫杂志.，10:15S-18S(1990)]可以提高蛋白质胞吞至细胞内。有关蛋白质胞转的报导却较少，对于定量跨细胞屏障转运蛋白质偶联物的研究则更少。小麦胚凝集素[Broadwell,et al.,(1988),supra]和抗转铁蛋白/甲氨蝶呤的偶联物[Friden,P.M.&Walus,L.R.Adv.Exp.Med.Biol.,331:129-136(1993)]显示出穿过体内血脑屏障的胞转。并且，辣根过氧化物酶(HRP)和聚赖氨酸的偶联物以及HRP的转铁蛋白偶联物可以穿过体内的细胞单层进行胞转[Wan,J&Shen,W.C.药物研究.，8:S-5(1991)；Taub,M.E.&Shen,W.C.，细胞生理杂志.150:283-290(1992)；Wan,J.,et al，生物化学杂志.，267:13446-13450(1992),supra]。
作为磷脂组成的脂肪酸构成了细胞膜的大部分。从市场上可以购买到它们并且价格较低。鉴于其脂质性质，脂肪酸很容易以无毒方式分配在细胞膜内并与细胞膜相互作用。因此，脂肪酸可能成为蛋白质和肽给药的最有效载体配体。在蛋白质和肽给药中脂肪酸的应用方式包括对蛋白质和肽进行共价修饰以及应用脂肪酸乳液。
一些研究报导了脂肪酸乳液在肽和蛋白质体内给药中的成功应用[Yoshikawa,H.et al.，药物研究.，2:249-251(1985)；Fix,J.A.,et al，美国生理杂志.，251:G332-G340(1986)]。脂肪酸乳液促进蛋白质和肽吸收的作用机理还不清楚。脂肪酸乳液可以打开紧密接点、使膜增溶、使蛋白质和肽不易被GL环境识别以及运载蛋白质和肽作为其吸收的一部分以穿过GL-粘膜[Smith,P.et al.,Adv.Drug Delivery Rev.,8:253-290(1992)]。已有报导提出了后一机理，但却与现有的脂肪吸收机制相矛盾。
另一种使蛋白质和肽跨GL上皮传递的合理方式是用脂肪酸作为非特异性膜吸收剂。若干研究表明，与蛋白质连接的非特异膜结合剂可以促进蛋白质偶联物跨细胞的体内胞吞[Wan,J.,et al.，细胞生理杂志.，145:9-15(1990)；Taub&Shen(1992),supra]。另外据证实，脂肪酸偶联物可以改善大分子的摄入和跨细胞膜[Letsinger,R.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6553-6556(1989)；Kabanov,A.,et al.,Protein Eng.,3:39-42(1989)]。然而，在脂肪酸与肽和蛋白质的偶联中却存在一些困难，其中包括(1)脂肪酸在偶联反应水溶液中缺乏溶解性；(2)脂肪酸酰化后，肽和蛋白质丧失了生物活性；和(3)与脂肪酸偶联的肽在水溶液中缺乏溶解性[参见，例如，Hashlmoto,M.,et al.，药物研究，6:649-652(1989)；Martins,M.B.F.,et al.，生化，72:571-675(1990)；Muranishl,S.,et al.，药物研究.，8:649-652(1991)；Robert,S.et al.，生化、生物物理研究通讯.，196:447-454(1993)]。
本发明的目的是提供用于脂肪酸偶联于亲水性分子并改善肽和蛋白质生物利用度的方法和组合物。
在本发明中，利用含有巯基或二硫化物化合物的脂肪酸衍生物(例如含有或被修饰至含有巯基的肽、蛋白质或寡核苷酸)达到将含巯基或二硫化物化合物载运到哺乳动物细胞，所述脂肪酸衍生物包含了带有二硫键的脂肪酸偶联产物。这样的改性显著提高了哺乳动物细胞对所述化合物的吸收，而这是相对于未偶联化合物而言，这种改性还可以延长化合物在血液和组织中的保留。此外，偶联物中的二硫键在细胞内或体内较不稳定，从而便于将脂肪酸基团上的化合物完整地释放到细胞内或细胞外。本发明还提供了用于制备脂肪酸衍生物的试剂和方法。
附图简介参考附图可以更好地理解本发明，其中
图1.是柱状图，用于图示BBL、BBLssPal和BBLssOleic在Caco-2细胞中的摄取；图2A-2D图示了BBL和BBLssPal在CF-1小鼠的血液、肾脏、肺和肝脏中在静脉内给药后的生物分布；图3A-3D图示了BBL和BBLssOlei在CF-1小鼠的血液、肾脏、肺和肝脏中在静脉内给药后的生物分布；图4A-4C柱状图，图示了BBL和BBLssPal在CF-1小鼠腹膜内给药后的生物分布；图5A和5B分别是曲线图和柱状图，它们分别图示了BBL、BBLssPal(2)和BBLssPal(4)穿过和进入Caco-2细胞的胞转和累积；和图6图示了从含有胞转BBL、BBLssPal(2)和BBLssPal(4)的Caco-2细胞的基础培养基获得的Sephadex*G50凝胶过滤分析结果；图7A和7B曲线图，图示了尿崩症大鼠皮下DP和DP-P给药后的效果，给药剂量为3.3μg/kg；(7A)图示了排尿量，(7B)图示了水分摄取量；图8为曲线图，它比较了在尿崩症大鼠治疗中DP和DP-P以不同剂量作单剂量皮下注射的功效；图9为曲线图，它比较了去氨加压素-脂肪酸偶联物在具有不同脂肪酸链长度时的构效关系，该偶联物以0.5μg/kg的剂量皮下注射，“C-6”代表己酸，“C-10”代表癸酸，“C-16”代表棕榈酸，并且“C-18”代表硬脂酸。
图10图示了去氨加压素(DP)或其棕榈酸偶联物(DP-P)静脉内给药后在小鼠血浆中的去氨加压素曲线；图11A和11B图示了降钙素(CT)或其棕榈酸偶联物(CT-P)皮下给药后在小鼠血浆中的降钙素和钙曲线，给药剂量为100μg/kg；(11A)图示CT-P处理；(11B)图示CT处理。
根据本发明，含巯基化合物(例如此后将作为生物聚合物)是通过可逆的、生物可降解的二硫键与脂肪酸衍生物连接。这种偶联物预计与细胞膜的顶侧结合，膜的转运和翻转使偶联物到达GL上皮的基底外侧膜，并且可以因二硫键的还原而被释放到细胞间质液内。
根据本发明的一个方面，提供了通式Ⅵ的偶联物
其中P为从含巯基化合物衍生的残基；R1为氢、低级烷基或芳基；R2疏水性取代基(此后将定义)；和R3羟基、疏水性取代基或含有1或2个氨基酸且以-CO2H或-COR2为末端的氨基酸链。这些偶联物特别适合提高含巯基化合物PSH的吸收和延长在血液和组织中的保留。
本发明另一方面提供了用于提高式PSH所示含巯基化合物在哺乳动物内的吸收或延长其在血液和组织中的保留的方法，其中从含巯基化合物制得式Ⅵ的偶联物，随后将该偶联物给予哺乳动物(例如，作为部分的药物组合物，如以水溶液或口服剂量单位形式)，其中所述偶联物是以达到预定目的的有效量给药。
本发明一方面还提供了式Ⅴ化合物A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(=O)R3Ⅴ其中A为芳香活性残基(此后将作定义)，和R1、R2和R3如上述定义。式Ⅴ化合物特别用于制备来源于式PSH所示含巯基化合物的式Ⅵ偶联物。
本发明的再一方面提供了从含巯基化合物PSH形成式Ⅵ偶联物的方法，其中包括将式PSH化合物与式Ⅴ化合物进行反应。该反应一般是在式Ⅴ化合物过量(例如过量2至10倍)和约4℃至约37℃的条件下、于适当的缓冲水溶液(例如磷酸盐、碳酸氢盐或硼酸盐缓冲液)中进行约1至约24小时。优选该反应在pH8的碳酸氢盐缓冲液中进行。
根据本发明的另一方面，提供了式Ⅲ化合物A-S-S-CH2-CR1(NH2)C(=O)R3’Ⅲ其中R3’为羟基或氨基酸链，该氨基酸链含有1或2个氨基酸并以-CO2H为末端，并且A和R1具有上述含义。式Ⅲ化合物用于制备式Ⅴ化合物。式Ⅲ化合物的制备适宜通过式Ⅱ化合物H-S-CH2-CR1(NH2)C(=O)R3’Ⅱ与式A-S-S-A或A-S-S-A’化合物进行反应，其中A’与A不同并且是芳香活性的残基。这些反应物是市售产品[例如2,2’-二硫吡啶和5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)]或是可通过所属领域技术人员所熟知的合成方法和途径制得。
在本发明的一个方面中，提供了制备其中R2为疏水性取代基的式Ⅴ化合物的方法，其中，将式Ⅲ化合物与式X-O2C-B或X-OC-B所示的活化脂基反应，其中X为活性脂基(此后将作定义)和B是脂基的一部分(此后将作定义)。式X-O2C-B或X-OC-B所示化合物很容易可以通过已知方法制备。
对于式Ⅲ化合物的制备，在例举的方法中是将等摩尔量的式Ⅱ化合物与式A-S-S-A或A-S-S-A’在极性有机溶剂(例如乙醇)中进行适当的混合。随后，将式Ⅲ产物通过在非极性有机溶剂(例如苯)中的结晶将其适当分离。显然，也可以采用本领域中其他的适用方法。
对于X-O2C-B和X-OC-B的制备，可以使脂肪酸与例如(a)N-羟基琥珀酰亚胺和碳化二亚胺反应物进行反应，从而生成H-羟基琥珀酰亚胺基活化酯，(b)与三氟乙酸酐反应，生成脂肪酸酐；或(c)与亚硫酰氯反应，生成脂肪酰氯。也可以采用其他适当的方法来引入上述或其他活性脂基。
对于本发明的目的，术语“疏水性取代基”和“含脂部分”是指脂基本身或是含有脂基的烃类基团(尤其是一个或多个氨基酸)。所述疏水性取代基可以含有约4至约26个碳原子，优选约5至约19个碳原子。结构式中连有羰基的适当疏水性基团包括但不限于脂肪酸基团，其包括肉豆蔻酰基(C13H27)、棕榈酰基(C15H31)、油酰基(C15H29)、硬脂酰基(C17H35)和反油酰基(elaidyl)(C17H33)；含有羧基的甾类残基，所述甾类物质包括胆酸、脱氧胆酸、17-羧基马萘雌酮和17-羧基雌酮。
“芳香活性基团”是指一种基团，该基团适合使式Ⅴ化合物的二硫键在与含巯基的式PSH化合物的取代反应中更不稳定(即，充当良好的离去基团)。现有的优选芳香活性基团为2-吡啶基；其他适用的芳香活性基团包括4-硝基苯基。
适合本发明目的的术语“活性脂基”是指一种基团部分，该基团在与式Ⅲ化合物反应时提供羧脂基(carboxylipid group)。目前的优选活性脂基是N-巯基琥珀酰亚氨基酯；其他适用的活性脂基包括酰氯和酸酐。
虽然本发明着重于包含多种含巯基化合物的式Ⅵ偶联物的制备和应用，但本发明所述方法和组合物也适用于含生物聚合物偶联物的制备。有关的生物聚合物包括肽、蛋白质和寡核苷酸(此后将作定义)。显然，所属领域专业人员可以看出，含有巯基的生物聚合物或硫醇化的生物聚合物可以在结构内含有许多与式Ⅵ偶联物相应的基团部分(例如那些具有式Ⅵ化合物+基团P结构的基团)。
为达到本发明的目的，术语“肽”是指含有2至50个氨基酸的氨基酸链，术语“蛋白质”是指含有50个以上氨基酸的氨基酸链。蛋白质和肽可以从天然物中分离出来，或者通过已知的方法，例如DNA重组技术或固态合成来制备。本发明中所用的肽和蛋白质可包括天然L-氨基酸、L-氨基酸和其他氨基酸(包括D-氨基酸和改性氨基酸)的结合物或除L-氨基酸以外的氨基酸。为了形成式Ⅰ所示的偶联物，肽或蛋白质必须含有至少一个活泼巯基。在多数情况下，所述肽或蛋白质含有半胱氨酸残基(含巯基氨基酸)。无巯基的蛋白质和肽可以通过专业人员已知的方法进行修饰；尤其是，一般常采用以此为目的的巯基化试剂[例如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基联硫基)丙酸盐(SPDP)和2-亚氨基四氢噻吩(Traut氏试剂)]。
术语“寡核苷酸”是指含有两个或多个天然或改性核酸的链，例如天然或重组的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)序列。为生成本发明所述的偶联物，所述寡核苷酸必须通过硫醇化反应改性，从而使其含有可以与含脂基团相键合的巯基。这种改性一般是采用已知方法进行。例如，利用碳化二亚胺将寡核苷酸与胱胺偶联，随后通过二硫苏糖醇进行还原以生成游离的巯基。所述寡核苷酸偶联物适用于载运体内或体外的治疗活性寡核苷酸，即，偶联物与体外细胞接触以有效转染。随后，将所述细胞施用给动物，从而达到治疗的目的。此外，还可以用寡核苷酸偶联物提高哺乳动物体外细胞的转染，从而体外生产出有价值的重组蛋白质。
优选寡核苷酸是反义寡核苷酸。反义寡核苷酸是含有核苷酸序列的DNA或RNA分子或DNA或RNA衍生物，所述核苷酸序列与特异性mRNA(信息RNA)互补。反义寡核苷酸与特异性mRNA中的互补序列结合并抑制mRNA的翻译。已有多种已知的翻译寡核苷酸及其衍生物。参见，例如，美国专利5,602,240、5,596,091、5,506,212、5,521,302、5,541,307、5,510,476、5,514,787、5,543,507、5,512,438、5,51 0,239、5,514,577、5,519,134、5,554,746、5,276,019、5,286,717、5,264,423以及WO96/35706、WO96/32474、WO96/29337(硫羰三酯改性的反义寡核苷酸硫代磷酸酯)、WO94/17093(寡核苷酸的烷基化磷酸酯和烷基化硫代磷酸酯)、WO94/08004(寡核苷酸的硫代磷酸酯、磷酸甲酯、氨基磷酸酯、连二硫酸酯、桥硫代磷酸酯、桥氨基磷酸酯、砜、硫酸脂、酮糖、磷酸酯和磷酰丁胺(van der krol et al.，生物技术.6:958-976(1988)；Uhlmannet al.,Chem.Rev.90:542-585(1990))、WO94/02499(寡核苷酸的烷基硫代磷酸酯和芳基硫代磷酸酯)以及WO92/20697(3’-封端的寡核苷酸)。优选的反义寡核苷酸也包括衍生物，例如S-寡核苷酸(硫代磷酸酯衍生物或S-寡核酸oligos，参见JackCohen.Oligodeoxynucleotides,Antisense Inhibitors of GeneExpression,CRC Press(1989))。S-oligos(核酸硫代磷酸酯)是寡核苷酸(O-oligos)的等电子类似物，其中磷酸酯基的非桥连氧原子被硫原子取代。所述S-oligos可以通过用3H-1,2-苯并联硫基-3-酮-1,1-二氧化物处理相应的O-oligos来制备，所述3H-1,2-苯并联硫基-3-酮-1,1-二氧化物是硫转移剂。参见Lyer等人在有机化学杂志5 5:4693-4698(1990)’和Lyer等人在美国化学学会杂志112:1253-1254(1990)中所述的内容。
在一类优选的式Ⅵ化合物中，R1为氢，R2为疏水性取代基或脂基，并且R3为-OH。此类偶联物适合从半胱氨酸制得。另一类优选的本发明偶联物中，R1为氢，R2为-CH2CH2CH(NH2)CO2H或-CH2CH2CH(NHCO-脂)CO-脂并且R3为-NHCH2CO2H或-NHCH2CO-脂，其中R2和R3中至少一个与所连羰基一起构成脂基。此类偶联物适合从谷胱甘肽制得。
路线Ⅰ表示一个合成式Ⅵ化合物的例子(其中P为蛋白质)。显然，所属领域专业人员很容易看出，还可以开发出许多其他合成路线。
路线1
本发明的另一方面是提供脂肪酸偶联物，该偶联物如下式(Ⅹ)所示
其中P1为从含二硫基化合物衍生的残基，该基团可以任选性含有其它与疏水性基团相连的二硫基。P1的非限定例是肽和蛋白质或含有二硫键的式(N)化合物的衍生物，该衍生物此后将作描述。P和(N)优选是药物。优选偶联物(X)是有机化合物。n是1至20的整数，优选不超过10，更优选不超过5。R1、R2和R3如上述式Ⅵ的定义。R4为氢、低级烷基或芳基；R6为疏水取代基(如前定义)；R8为羟基，疏水取代基或含有1或2个氨基酸并以-CO2H或-COR2封端的氨基酸链。R1可以与R4相同或不同。R2可以与R5相同或不同。R3可以与R6相同或不同。
R2和R5与所连的羰基一起分别优选(1)含有脂基的含脂质部分；或(2)含有脂基和氨基酸链的含脂部分，所述氨基酸链含有1或2个氨基酸并以-CO2H为末端。R3和R6分别优选(1)羟基；(2)亲水基团；或(3)氨基酸。R3和R6的非限定例是甘氨酸。R2和R5的非限定例是谷氨酸衍生物、脂肪酸和甾类，例如脱氧胆酸和胆酸。
本发明还可以应用于许多生物活性剂，其中包括但不限于含巯基-或含二硫基的蛋白质和肽。通常，这些试剂难以被转运穿过生物屏障、从血浆中迅速排除，并且对化学降解和蛋白降解敏感；因此，其治疗用途受到制约。本发明可以克服上述所有局限性。含巯基或二硫基的蛋白质和肽包括但不限于胰岛素[Czech,M.P.,Ann.Rev.Biochem.,46,359(1977)]、降钙素[Brown,E.M.Aurbach,G.D.,Vitam.Horm.,38,236(1980)]、去氨加压素[Varra et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,188,241(1974)]、α干扰素、β干扰素和γ干扰素[Stiem,E.R.,Ann.Inter.Med.,96,80-93(1982)]、白介素-2、白介素-3、白介素-6和白介素-11[Kluth,D.C.,Ress,A.J.Semin.Nephrol.,16,576-82(1996)；Holyake,T.L.,Blood Rev.,10,189-200(1996)]、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)[Spiekermann,K.et al.,Leukemia,11,466-78(1997)]、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)[Jonuleit,H.etal.,Arch.Dermato.Res.,289,1-8(1996)]、人生长激素[Strobl,J.S.Thomas,M.J.,Pharmcol.Rev.,46,1-34(1994)]、红细胞生成素[Spivak,J.L.,Semin.Hematol.,30,2-11(1993)]、后叶加压素[Schroder,E.,Lubke,K.,The Peptide,2,336-350(1996)]、善得定[Sheppard,M.C.Stewart,P.M.,Metabolism:Cl inical&Experimental,45,63-64(1996)]、抑肽酶[Haberland,G.,McConn,R.,Fed.Proc.,38,2760-2767(1979)]、催产素[Nachtmann,F.et al.,Anal.Prof.Drug Subst.,10,563-600(Florey,K Ed.,AcademicPre s,New York,1981)]、β-TGF[Moses,H.L.,Serra,R.,Curr.Opin.Genet.Dev.,6,581-6(1996)]、BDEF(脑衍生神经营养因子)[Apfel,S.C.Kessler,J.A.,Baillieres,Clin.Neurol.,4,593-606(1995)]、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)[Bikfalvi,A.et al,Endocr.Rev.,18,26-45(1997)]、PDGF(血小板衍生生长因子)[Hughes,A.D.et al.,Gen.Pharmacol.,27,1079-89(1996)]、TNF(肿瘤坏死因子)[Majno,P.E.et al.,Swiss.Surg.,4,182-5(1995)]、心钠素[Nakao,K.,Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.,2,45-50(1993)]、弛缓素[Schwabe,C.et al.,Recent Progr.Horm.Res.,34,123-211(1978)]、糊精[Rink,T.J.et al.,Trends,Pharmacol.Sci.,14,113-8(1993)]、脱氧核糖核酸酶[Laskowsk,The Enzymes,2,289-311(Boyer,P.D.,Ed.,Acedamic Press,New York,1971)]、表皮生长因子[Carpenter,G.,Curr.Opin.Cell.Biol.,5,261-4(1993)]、水蛭素[Markwardt,Methods Enzymol.,19,924(1970)]、新制癌菌素[Dedon,P.C.Goldberg,I.H.,Chem.Re s.Toxicol.,311-32(1992)]、血调节肽(hemoregulatory peptide)[Paukovits,W.R.et al.,Cancer Treat.Rev.,17,347-54]和生长抑素[Moss,R.L.,Ann.Rev.Phsiol.,41,617(1979)]。
偶联物(X)的非限定例是
在上式中，“Gly”代表甘氨酸，并且“Glu”代表谷氨酸，“n”为整数，优选不超过10。
优选偶联物(X)具有下列通式(其中R1=R4、R2=R5和R3=R6)
若基团P1为巯基，它可以通过本发明所述的二硫键与疏水性基团连接，从而使偶联物具有奇数个疏水取代基，例如n1为奇数。
这些偶联物特别适合提高含二硫化物化合物的吸收并延长在血液和组织内的保留。
本发明的另一方面提供了增加偶联物(X)在动物，例如哺乳动物内的吸收或延长其在血液和组织中的保留的方法，该偶联物是作为药物组合物的组成部分(例如，以水溶液形式或口服剂型)施用给动物。
本发明一方面还提供了生产偶联物(X)的方法。偶联物(X)的制备优选从含一个或多个二硫键以及一个或多个可有可无的巯基的化合物开始。
式(Ⅹ)化合物例的合成如路线Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ所示(分别用式(D)、(H)和(M)的偶联物作为偶联物(X)的例子)。当然，所属领域技术人员可以看出，还可以开发出许多其它的合成路线。
这些合成路线表示了制备式(Ⅹ)双脂肪酸二硫化物衍生物的方法，它们是以含二硫化物的化合物(例如肽或蛋白质)或以合成路线Ⅳ的化合物(N)作为反应物，化合物(N)可以是R-NH2或R-OH，其中R为有机基团。(N)的非限定例是蛋白质、肽、氨基酸、核苷酸、核酸、碳水化合物及其衍生物和药物。(N)作为药物时的非限定例是抗生素和亲水性药物分子，例如阿昔洛韦。这些方法优选双脂肪酸二硫化物衍生物的可逆性修饰，例如偶联物(X)得自含二硫化物的肽或蛋白质或化合物(N)。
所述方法包括，将含二硫化物的化合物(例如肽、蛋白质)或从化合物(N)改性得到的含二硫化物的化合物(例如合成路线Ⅳ的(L))与式Ⅴ化合物，即上述式A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(=O)R3反应，生成偶联物(X)。为了说明，式Ⅴ化合物在合成路线Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中的例子是化合物(C)。基于在此公开的内容，所属领域技术人员可以了解制备酸性偶联物(X)所用的适当式Ⅴ化合物。若含二硫化物的化合物还含有一个或多个巯基，它们也可以与疏水基团进行偶联，由此得到具有附加疏水基团的化合物，并且疏水基团的奇偶数取决于巯基的数目。
在到达血液或组织时，偶联物(X)可以被转化为原型二硫化物分子或化合物(N)。上述方法和偶联物(X)通过改善充当药物的肽、蛋白质和有机化合物(N)的渗透性、稳定性和生物利用度而使它们克服了主要的缺陷。与未改性肽、蛋白质和有机化合物(N)相比，偶联物(X)(例如脂肪酸-肽偶联物或脂肪酸-药物偶联物)在体内的吸收，例如胃肠吸收(当口服给药时)得到改善，同时使其在体内的释放持久(例如当它们通过皮下注射时)。本发明具有下列超过现有技术的优越性(1)反应可以在有水条件下进行，(2)产物一般可溶于水，和(3)在血液或组织中可以将产物转化为原型肽，并由此使药物的药理学活性再生。
例如，通过使用Ⅴ化合物(脂化剂)，以上述方法来制备环状含二硫化物的肽药物或激素的脂肪-二硫化物偶联物。如合成路线Ⅱ所示，肽或多肽(A)中的环状二硫键可以被还原成为两个游离的巯基(B)。这些巯基可以与脂肪酸-二硫化物衍生物(例如N-酰化半胱氨酸吡啶二硫化物(C))反应，生成式(D)所示的双脂肪酸-二硫化物偶联肽或多肽衍生物。该衍生物(D)可以提高对细胞的渗透性并延长在组织内的保留时间。优选它不具有生物活性。当将衍生物(D)给药到患者体内时，它可以在体内还原并转化成原型肽或多肽(A)。
合成路线Ⅱ
合成路线Ⅱ从环状含二硫化物的肽(A)制备双脂肪酸二硫化物偶联物(D)。(D)可以通过例如中间体(E)在血液或组织中被还原转化为原型肽(A)。
合成路线Ⅲ表示了本发明的另一个实施例从二硫化物交联的双链多肽制备脂肪酸衍生物，以制备式(H)所示的偶联物
合成路线Ⅲ
合成路线Ⅲ从其环状结构是由两个或多个二硫键组成的双链肽(F)制备双脂肪酸二硫化物偶联物(H)。与合成路线Ⅱ相似，(H)可以通过还原转化为原型肽(A)。
合成路线Ⅳ是制备偶联物(X)的另一种方法，该路线中将所需二硫键引入到起始化合物(N)中，化合物(N)不含有二硫键或环或易受影响的二硫键或环。首先，将含环状二硫化物的分子，例如硫辛酸(J)通过酯键或酰胺键与化合物(N)偶联，随后还原，形成两个二硫化物脂肪酸键合。该双脂肪酸偶联物可以在血液或组织中被还原转化为原型药物分子(N)，进而被组织酶水解。实施例20和21代表了合成路线Ⅳ的例子。
合成路线Ⅳ
偶联物(X)应可溶于水，它所具有的亲脂性基团或组成部分使其容易被细胞吸收，这是由于该偶联物具有允许它在体内持续释放的断裂键。肽或多肽可以含有任何数量的氨基酸和环状二硫键。肽或蛋白质的改性通常发生在水溶液(例如PBS)或其他已知缓冲液中。所用脂肪酸一般具有4至26个碳，更常见含有5至19个碳。脂肪酸的非限定例是乙酸(含有2个碳)、己酸(含有6个碳)、癸酸(含有10个碳)、月桂酸(含有12个碳)、肉豆蔻酸(含有14个碳)、棕榈酸(含有16个碳)和硬脂酸(含有18个碳)(参见实施例11，)。合成路线Ⅱ的方法是具有1至5个环状二硫键的肽或多肽所常用的方法。
所述反应是在室温下进行。反应起始时，脂肪酸通常比肽或多肽的摩尔浓度过量；脂肪酸与具有一个环状二硫化物的肽或多肽间的配比一般是3比1。在偶联物(X)中，脂肪酸的重量比肽或多肽小。因此，较少量的脂肪酸所产生的毒性也较低，这与脂质制剂、微团或脂质体给药不同。
所述反应一般是在含水介质内进行，介质的pH优选在6至8之间，更优选pH为7.6。该反应的速度较快，一般在约30分钟或更短的时间内就可达到完全，生成稳定的偶联物(X)。偶联物(X)可以利用已知的蛋白质和肽提纯方法进行纯化。偶联物中的肽或多肽是通过已知方法确定的，例如色谱法。
可以按照路线Ⅱ进行改性的肽或蛋白质例子是去氨加压素(含有9个氨基酸和一个二硫环的小肽，参见实施例11)、降钙素(含有30个氨基酸和一个二硫环的肽，参见实施例17)、善得定(含有一个二硫环的八肽)、催产素(含有一个二硫环的小肽)和上皮生长因子(由53个氨基酸与3个二硫环组成的多肽单链)。胰岛素是一个可以按照路线Ⅱ或Ⅱ改性的多肽例，这是由于胰岛素多肽由双链(A-和B-链)和共51个氨基酸以及A-链内所含有的一个二硫环(适合通过路线Ⅱ改性)与在A-链与B-链间由两个二硫环形成的单环结构(适合通过路线Ⅲ改性)组成。
本发明的另一个实施例中，偶联物中的脂肪酸部分可以被其他类脂取代，例如甾类(如实施例15和16中所述的例子)。式Ⅴ反应物中的基团A(即A-S-S-CH2-CR1(NHCOR2)C(=O)R3)是一个易离去基团。所谓易离去基团是指一种基团，它使式Ⅴ所示化合物(A)中的联硫基在与式PSH含巯基化合物的取代反应中更不稳定，由此充当一个离去基团。易离去基团的非限定例是对硝基邻羧基苯硫酚硫代吡啶。离去基团的定义可以在许多有机化学教材中找到。例如，在Cam&hammond氏所著的有机化学，McGraw-Hill Book Co.(2nd ed.,1964)第241页中，离去基团“L”被定义为“C-L键断裂的方式是组成该键的电子对归L所有”。因此，如果有机分子中的基团能够通过电负性或共振稳定性获得电子对，则该基团是易离去基团。
本发明的脂肪酸偶联物可溶于绝大多数缓冲溶液，其中蛋白质和肽也可溶。特别是，游离羧基在中性pH条件下带电，从而改善了偶联物的溶解性。这对含有偶联物和适当可药用载体或辅剂的制剂十分有利，这些制剂可通过口服或其他途径向患者进行蛋白质或肽给药。
在R1与R4-不同，R2与R5不同，和R3与R6不同的情况下，偶联物(X)的制备是通过将式Ⅵ1化合物与式Ⅵ2化合物进行偶联，从而生成式(Ⅹ)化合物。通式Ⅵ1和Ⅵ2如下所示
其中P2和P3是从含巯基化合物衍生的残基，R1、R2、R3、R4、R5和R6如上述定义。所属领域专业人员知道，式Ⅵ1和Ⅵ2化合物是上述式Ⅵ化合物的例子；经过偶联反应，P2和P3变为P1。优选P1、P2和P3是蛋白质或肽，此后，所属领域技术人员可以利用改性肽或蛋白质的已知偶联方法进行合成。
本发明的一个特有优越性是，脂肪酸基团与肽或蛋白质之间的二硫键易被还原。因此，活化肽或蛋白质分子被完整地释放到靶组织或细胞内，此外，偶联物的脂肪酸基团仅含有氨基酸和脂质分子，它们对哺乳动物，特别是人类无毒。
本发明的药物组合物可以通过任何方式给药，以便获得其预期目的。例如，可以通过口服、非肠道、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经皮、鞘内或颅内途径给药。给药的剂量取决于年龄、健康状况和接受者的体重、联合治疗的种类以及可能的治疗频率、所需效果的性质。
本发明所述的组合物包括其中含有有效量的本发明化合物以达到预期目的的所有组合物。根据个体需要来决定各化合物有效量的最佳范围是所属领域所熟知的。
除将本发明所述脂质化的化合物作为处于溶液中的原料化学品给药之外，所述化合物可以作为含有适当可药用载体的药物制剂的一部分给药，所述可药用载体包括那些有助于将上述化合物加工成制剂的可药用赋形剂和辅剂。适合非肠道给药的制剂包括化合物以水溶性形式存在的水溶液。此外，作为适当的油性注射悬浮液，也可以以化合物的悬浮液给药。适当的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)。注射用含水悬浮液可以含有提高悬浮液粘度的物质，其中包括三甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。悬浮液可以选择性地含有稳定剂。
本发明的化合物还可以和能形成脂质体的亲脂性阳离子化合物结合。将脂质体引入细胞的应用已见报导，例如美国专利4,897,355、4,394,448和5,635,380。还可以参见美国专利4,235,871、4,231,877、4,244,179、4,753,788、4,673,567、4,247,411、4,814,270中所公开的制备含有生物材料的脂质体的常规方法。在优选实施例中，将双肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、胆甾醇和硬脂酰胺(7∶2∶1)的甲醇溶液蒸发后得到一种干膜。该膜在含有适量脂质化化合物的Tris*缓冲液中水合，随后进行探针式声处理。
通过参考实施例可以更好地理解本发明，但这些实施例仅起说明作用，从任何意义上讲，它们都不对本发明的范围构成限定，本发明的范围由权利要求书确定。
实施例实施例1N-棕榈酰基-2-吡啶基联硫基半胱氨酸(Pal-PDC)的合成将冰冷的L-半胱氨酸(Ⅰ)(3.0g)乙醇(50ml)溶液滴加到搅拌中的2,2-联硫基吡啶(Ⅱ)(7.5g)中，并使反应在25℃下持续18小时。将该溶液离心以除去沉淀物，用旋转蒸发器将上清液浓缩至体积为40ml。随后，将该反应混合物滴加到400ml冰冷的苯中。通过过滤，将在苯中结晶出的PDC(Ⅲ)分离出来，将其重新溶解在40ml乙醇中，进而按照上述方法在400ml冰冷的苯中重结晶。过滤分离出的重结晶产物，真空下干燥过夜，最终将其储存在-20℃的干燥器内。
将PDC(Ⅲ)(100mg)溶解在5mlDMF中并用100μl三乙胺混合，在25℃下，将所得悬浮液与棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Ⅳ)(250mg)在DMF(5ml)中反应24小时，反应期间，该悬浮液变为澄清。用40ml pH为3.0的冰冷水稀释该溶液，在10000rpm下离心3 0分钟，分离出含有Pal-PDC(Ⅴ)和棕榈酸的沉淀。将沉淀悬浮在pH为7.0的水中以将Pal-PDC(Ⅴ)和棕榈酸分开，这种pH条件的水只溶解Pal-PDC(Ⅴ)而不溶解棕榈酸。将上述酸沉淀步骤重复两次以进一步纯化Pal-PDC(Ⅴ)。实施例2合成偶联物除非另有说明，偶联步骤(Pal-PDC和PDC)中所有最终使用的反应物都利用含有荧光指示剂的硅涂层薄层层析(TLC)平板进行分析。这些平板在分析前不加热活化。对于合成反应物的常规分析，将含有反应物(5mg/ml)的5μl乙醇溶液置于平板上。进而，将该平板在溶剂池中展开，用流动相平衡。一旦溶剂延展到足够长的距离后，取出平板，干燥，在UV-灯下观察。立刻标记出平板上所有点的位置，由此得到绘好的平板和样品点。计算并记录下可目测各点的Rf值。分析中调整所用流动相的组成，以使反应物点的分离达到最佳。
为了达到说明的目的，合成了BBL的偶联物。BBL是亲水性蛋白质，它被细胞吸收得很少，由此无法经口服生物利用。此外，BBL在Gl道中稳定并且可对抗哺乳动物肠内的蛋白酶降解[Yavelos,J.,etal.,Cancer.Res.43:2453s-2459s(1983)]。BBL在化学预防中的应用只有在开发出口服可吸收BBL形式后才能得以实现。
将BBL(20mg)溶解在1ml碳酸氢钠(0.3M,pH8.0)溶液中并与SPDP(5mg/100μl DMF)在25℃下反应2小时。用Sephadex*G50凝胶-过滤色谱纯化BBL-PDP后，通过测定BBL-PDP在和二硫苏糖醇(DTT)还原反应后所释放出的硫代吡啶基来评估BBL的PDP衍生作用，所用方式是，每个BBL分子中的约4个氨基被SPDP修饰。BBL的衍生度可以通过调节反应缓冲液的pH来加以控制，BBL的改性也可以被调整，当反应在pH7下进行时每个BBL分子中有一个氨基改性，直至反应在pH8.5下进行时将有4.5个氨基改性。
将溶于PBS(1ml,pH5.0)中的BBL-PDP(20mg)用DTT(25mM)还原30分钟，进而从Sephadex*G50柱中洗脱。将在柱空隙容积时洗脱下的含巯基BBL馏分用Elman氏试剂进行鉴别，随后与过量3倍(每个BBL上的巯基)并溶于PBS中的Pal-PDC(Ⅴ)(pH7.0)在4℃下反应16小时。此后，用盐酸(1M)将反应混合物酸化至pH3.0并置于冰上30分钟。用Sephadex*G50凝胶-过滤柱分别对上清液进行分析。通过离心分离出含有BBL的棕榈酰二硫化物偶联物、BBLssPal(Ⅵ)和过剩反应物的沉淀，将其溶解在DMF(2ml)中并用DMF从Sephadex*LH20柱上洗脱。分离出在柱空隙容积时洗脱下的BBLssPal(Ⅵ)馏分，用500个体积的水透析3次，随后脂质化。由此方法所制备的偶联物的收率约为80％(重量)。在以相同的偶联条件将[3H]-标记的Pal-PDC(Ⅴ)与BBL偶联后，可以证实并定量Pal-PDC与BBL之间的偶联作用。另外，利用相同的方法，可以合成油酸偶联的BBL(BBLssOleic)。实施例3偶联物的转运在37℃下用9.5ml胰蛋白酶/EDTA溶液(0.5％胰蛋白酶，5.3mM EDTA)培养10分钟后，可从25cm2储用培养物瓶中脱离出人结肠癌细胞(Caco-2)。随后将这些细胞悬浮在5ml Dulbecco’s最小必需培养基中并用库尔特粒度仪计数，该培养基中补充有15％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酸(1％)和必需氨基酸(1％)。
将悬浮在1.5ml培养基中的Caco-2接种在转孔(transwell)的顶室中，其接种密度是每插0.5百万个细胞。随后在各个转孔的基底室中加入2.5ml培养基。不间断地令细胞吸附2天，每隔一天补料直至试验开始。在试验前将细胞保存约14至20天，并且在各试验前24小时补料。在接种的一周内，该细胞单层发展到具有约500至600Ωcm2的跨上皮电阻(TEER)，并且在接种后至多21天内仍维持这种阻抗。
用氯胺T法对BBL和BBLssPal进行放射碘化作用[McConahey,P.C.&Dixon,F,F.J.,Meth.Enmzymol.,70:221-247(1980)]。将融合的且已达14天的细胞单层用无血清Dulbecco培养基洗涤两次并在该培养基中和37℃下培养30分钟。随后，用含有125I-BBL(10μg、ml)的无血清培养基代替该培养介质，125I-BBL既可以是原型BBL也可以是BBLssPal或BBLssOleic，将该细胞单层在37℃下继续培养60分钟。进而所述细胞单层用冰冷的PBS冲洗3次，并且在37℃条件下于胰蛋白酶(0.5％,EDTA5.3mM)下暴露10分钟。将脱离细胞转移到若干试管内，离心分离，用冰冷的PBS冲洗3次，用γ计数器测定其累积放射活性，最后用已公开的方法[Lowry,O.H.,et al.,J.Biol.Chem.193:265-275(1950)]检测细胞的蛋白质。
一些试验中测定了细胞对还原125I-BBLssPal的摄取。用DTT(50mM)在60℃下将125I-BBLssPal还原5分钟，随后在37℃下还原25分钟。对照试验是在相同的温度下将125I-BBLssPal暴露在培养基中而不是DTT下。
下面测定BSA(无脂肪酸)存在下的125I-BBLssPal摄取作用。加入细胞单层前，用含有0.1％BSA的培养基在37℃下将125I-BBLssPal培养30分钟。在一些摄取试验中，首先将BSA与过量3倍的棕榈酸混合，随后在试验前将其与偶联物一起培养。在测定含FBS培养基中125I-BBLssPal的摄取作用的试验中，直接将偶联物加入到含有所需量FBS的培养基中。
首先，将2至3周并具有约500Ωcm2TEER的融合细胞单层用含有1％FBS的Dulbecco’s培养基在37℃下孵育30分钟。随后，除去培养基，将1.5ml培养基中的125I-BBL(10μg/ml)偶联物加入到转孔的顶室内，向基底室中加入2.5ml培养基并在37℃下孵育该转孔。在预定时间时，除去各转孔基底室内的全部培养基(2.5ml)，用γ计数器对放射活性进行计数。在各试验中，一般是在培养后1、2、3、4、5、6和24小时时取样7次。取样24小时后，用冰冷的PBS漂洗细胞单层，切断插入物，用γ计数器对累积放射活性进行计数。
利用Sephadex*G50凝胶-过滤色谱来研究跨细胞单层转运的完整125I-BBL偶联物。简单来说，将基础培养基在24小时时取样后，将1.0ml培养基以2000rpm的转速离心，随后用PBS从G50柱(10ml)上洗脱，收集1ml馏分，用γ计数器测定馏分的放射活性。完整的偶联物在柱空隙体积时洗脱出来，并且小于1KDa的片段也在该柱容积或大于该柱容积时洗出。
不论是游离蛋白质还是和棕榈酸的偶联形式，在不同量加入的FBS存在下的125I-BBL摄取结果皆列在表1中。当将偶联物与细胞在无血清培养基中培养时，BBLssPal的摄取比BBL的高约140倍。在含有1％FBS的培养基的存在下，BBLssPal的内化比BBL的高约35倍。将血清浓度增高到10％，将致使细胞对BBLssPal的摄取进一步降低，达到仅比原型BBL的高约10倍。对于含有1％和10％FBS的培养基，BBLssPal进入Caco-2细胞中的内化将分别由于血清的存在而急剧降低至无血清摄取时数值的14％和2.3％。
表1
该细胞单层用125I-标记的10μg/ml偶联物在37℃下培养60分钟。所列出的结果是三个单层±SEM的平均值。摄取试验是在含有或不含有附加FBS的Dul becco培养基中进行。
由于细胞对BBLssPal的摄入肯定是由偶联物上的棕榈酸配体介导，也需研究DTT还原前后Caco-2细胞对125I-BBLssPal的摄取。培养介质中血清的存在对偶联物的细胞摄取产生抑制作用。未处理125I-BBLssPal的细胞摄取比125I-BBL的高80倍。将125I-BBL暴露在DTT下并不使摄取减少。相反，用DTT还原的125I-BBLssPal将偶联物的细胞摄入减少至约80％。BBLssPal与DTT的还原反应脱除了偶联物上的棕榈酸酸。因此，125I-BBLssPal的摄取是通过棕榈酸配体转导的。
表2
不论是原型蛋白质或作为BBLssPal，对125I-BBL细胞摄取的测定是在60℃下进行5分钟并在37℃下进行25分钟，这种测定在DTT(50mM)还原的前后皆如此。
已知牛血清白蛋白(BSA)是体内脂肪酸的载体，它含有可与脂肪酸紧密结合的疏水区。血清的存在致使125I-BBLssPal的摄取减少，据推测可能是因为125I-BBL与FBS中所含的BSA键合。在含有无脂肪BSA的培养基或含有脂肪酸载体BSA培养基的存在下，研究了125I-BBLssPal和125I-BBL的细胞摄取。其结果列于表3中。在无BSA培养基的存在下，125I-BBLssPal的细胞摄取比BBL高80倍，如同在上述实施例中所得的结果。当脱脂-BSA(无脂肪酸BSA)(0.1％)存在于培养基中时，125I-BBLssPal的摄取减少了82％，而125I-BBL的摄取不受影响。在脂肪酸载体BSA(0.1％)的存在下，125I-BBL的摄取仍不受影响，所述脂肪酸载体BSA是通过将无脂肪酸BSA与3摩尔过量的棕榈酸掺加后制得的。因此，125I-BBLssPal有力地结合在BSA上，而且这种结合依赖于以键合在BSA上的脂肪酸数量。
表3
摄取试验是在存在或不存在无脂肪酸BSA(BSA)或脂肪酸载体BSA(BSA/FA)的条件下、在Dulbecco培养基中进行的。不论是原型BBL或是偶联物形式，在无血清培养基中对125I-BBL进行的Caco-2细胞摄取试验的结果在图1中图示。结果以内化BBL的纳克平均值±SEM表示，n=3。125I-BBLssPal的细胞摄取约比125I-BBL的高100倍。同样，125I-BBLssPal的细胞摄取约比125I-BBL的高108倍。125I-BBLssPal和125I-BBLssOleic之间的摄取区别并不明显。实施例4对生物分布的分析动物试验所选用的是2至3周龄、每只体重20至25g并且试验前自由进食进水的CF-1雌性小鼠。将作为原型BBL或作为BBLssPal或BBLssOleic偶联物的125I-BBL(3mg/kg)经动物的尾静脉给药。在注射后0.5、3和24小时，从各试验组中取3只动物处死并取出它们的血(200μl)、肾脏、肺和肝脏，在冰冷的PBS中漂洗，检测透明度累积放射活性。记录下器官的重量并用于调节器官内偶联物的浓度。
在静脉内生物分布(iv-biodistribution)的试验中，不论作为原型BBL或是作为BBLssPal,125I-BBL(3mg/kg)均被给药在各动物腹腔左下位内。随后，以上述方式处理这些动物以研究静脉内的生物分布。
BBL和BBLssPal静脉内给药后的生物分布结果如图2所示，并以％累积剂量/g器官±SEM表示。这些结果表明，虽然BBL从体内迅速排出，致使其在血液内的水平不高，但BBLssPal却在血液内累积并达到较高的水平，并且从血液循环中排出得更缓慢。肾脏的生物分布结果表明，虽然BBL在肾内迅速累积，但BBLssPal并非如此。BBLssPal在肝脏内的累积约比BBL的高5倍，并且残留在肝脏内的BBLssPal水平也较高，甚至在注射后24小时也如此。BBLssPal在肺中的累积也比BBL的高约2倍，但该结果可能是由切除后的器官中残存的血所引起的。显然，BBLssPal在血液和肝脏中保留较长的时间并且保留的水平较高。另一方面，BBLssPal在肾脏内的清除率比原型BBL的约低4倍。
我们也研究了BBL和BBLssOleic在CF-1小鼠中的静脉内生物分布。在0.5、3和24小时的结果如图3所示并以％累积剂量/g器官±SEM,n=3表示。BBLssOleic的生物分布与BBLssPal的极其类似。正如在BBLssPal中观察到的，BBLssOleic在血液内的水平比BBL的高并且从循环内清除得极其缓慢。在相同的时刻，BBLssOleic在血液中的水平比BBL的约高4倍。与原型BBL相比，BBLssOleic的肾脏清除率约低4倍，肝脏累积量约高4倍。BBLssOleic延长了在肝脏内的保留，同时肝脏中的偶联物水平甚至在注射后24小时的时候都较明显。BBLssOleic在肺内的水平比原型BBL的高约2倍，但肺内较多的残血可能会造成这样的观察结果。
在注射后0.5小时(图4A)、3小时(图4B)或24小时(图4C)时，125I-BBLssPal在CF-1小鼠中的静脉内生物分布如图4所示并以平均％累积剂量/器官”范围(柱)表示。在0.5和3小时的时刻，125I-BBLssPal的肾脏累积比原型125I-BBL的低约4倍。在24小时，肾脏内125I-BBLssPal的水平比125I-BBL的高。125I-BBLssPal的血液水平在0.5小时时与125I-BBL的类似，在3小时时比BBL的高1.5倍，并且在24小时比BBL的高约3倍。125I-BBLssPal的肝脏累积在0.5小时时比125I-BBL高1.5倍，在3小时时高2.5倍，在24小时时高4倍。在24小时，肝脏和肾脏中存在较大量的125I-BBLssPal。实施例5体外转化试验转化试验是按照已公开的方法[Reznikoff,C.A.,etal.,Cancer.Res.,33:3239-3249(1973)；Reznikoff,C.A.,et al,.Cancer Res.,33:3231-3238(1973)]并选用C3H10T1/2(克隆B)细胞来完成的。通过每7天进行一次50,000细胞/75cm2瓶的滤过使储备培养物保持无支原体。按照这样的时间安排，所述细胞在达到融合前一般需要约2天的时间。令储备培养物在Eagle基础培养基中生长，所述培养基中还含有10％FBS、青霉素(100单位)和链霉素(100μg)，在达到第9至14传代时将其用于转化分析试验。细胞的传代是通过将储备细胞用胰蛋白酶(0.1％)的PBS溶液处理5分钟并再用5ml介质将胰蛋白酶灭活。这种方法适合将储备培养物的自发转化作用降至最低并且使培养皿中的平板效率最高。培养物所用的FBS储备物需要预筛，以确保血清能够支持转化细胞的表达和生长。
在转化分析试验中，将C3H 10T1/2细胞(1000/皿)接种到60mm培养皿中并使其在湿润的5％CO2气氛下和Eagle基础培养基中生长24小时，所用培养基中补充有10％FBS、青霉素(100单位)和链霉素(100μg)。随后，通过用25μl 3-甲基胆蒽(MCA)的丙酮储备液(0.25mg/ml)处理来引发细胞，MCA最终的浓度为1μg/ml。使该细胞在致癌物或溶剂存在的条件下生长24小时，随后用不含致癌物的新鲜培养基代替各个培养皿中的培养基。在试验的第一个两周内，每周更换两次培养皿的培养基，此后每周更换一次直至试验的后四周。在试验中，为了测定偶联物的转化抑制活性，将细胞在试验的头3周内保存在含有偶联物(1μ/ml)的培养基中；此后，将细胞保持在不含偶联物的培养基中。
在经过6周的致癌物处理后，在显微镜下检查细胞粘附在培养皿上的情况，并且用PBS洗涤，随后在100％甲醇中固定。进而用吉姆萨染液对已固定的细胞单层染色。各试验中以每组20个培养皿进行处理。除了试验组，所有转化试验还至少包括3个其它组阴性对照组(未用致癌物或溶剂处理)、丙酮对照组(用25μl丙酮处理)和阳性对照组(用MCA(1μg/ml)的25μl丙酮溶液处理)。在显微镜下研究平板中的转化灶(直径＞3mm)，并且按照公开的标准将它们分成Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型[Landolph,J.R.,建立细胞系的转化分析机理和应用(ed.Kakunaga,T.,&Yamasaki,H.)IARC Scientific Publications,Lyon,France pp.185-201(1985)]。简单而言，Ⅲ型灶是浓密的、多层的、嗜硷染色的细胞生长区，它经吉姆萨染液染色后呈深蓝色并且具有粗糙的十字形边缘。Ⅱ型灶也是浓密的、多层的细胞生长区，但它经吉姆萨染色后呈紫色并且比Ⅲ型灶的边缘更光滑，Ⅰ型灶在试验中没有记录。
我们还研究了各个转化试验中细胞的平板效率(PE)。为了测定不同处理组中的细胞PE，将各试验组的细胞(200个细胞/皿)接种在3个60mm的培养皿中，并且按照与上述相同的方式处理，以转化分析细胞。这些分析试验中的细胞在第10天时终止、用100％甲醇固定，用吉姆萨染液染色；在显微镜下对含50或更多细胞的可见克隆进行计数。按照(克隆数目/接种细胞数目)×100％来确定平板效率。
BBL、BBLssPal和BBLssOleic的体外抗转化活性如表4所示。不论以游离蛋白质或是以和棕榈酸或油酸的偶联物的形式，BBL在转化试验阶段的第一个3周内以1.0μg/ml的量加入到培养基中以在MCA处理后立刻开始。将经MCA处理的细胞在3-甲基胆蒽下暴露24小时，该化合物是溶解在25μl丙酮中并且浓度为1μg/ml。丙酮处理的细胞只暴露在25μl丙酮下。未处理细胞既不暴露在MCA中也不在丙酮下。统计学分析(卡方)第4组对第3组，p＜0.05；第5组对第3组，0.05＜p＜0.1；第6组对第3组，p＜0.05。对照的未处理细胞在接种后约14天左右在培养皿中达到融合并形成牢固粘附的接触抑制单层。这些培养皿在试验结束时不含有转化灶。丙酮处理的细胞也在接种后14天达到融合并形成牢固粘附单层并且不含有转化灶。但是，在MCA-处理的培养皿中含有转化灶的形态19个评分培养皿中的6个中含有Ⅲ型灶。BBL处理组不含有转化灶，这表明BBL可以防止MCA诱发的细胞转化。在试验评分的20个培养皿中，BBLssPal处理的细胞含有一个Ⅱ型灶。BBLssOleic处理组不含有转化灶。该试验中所有组的PE都在20％至25％之间。如表4所示，BBLssPal和BBLssOleic都保留了BBL的原始生物活性。
表4
实施例6单偶联物和多偶联物的转运用转孔和六孔平板研究顶膜结合的125I-BBLssPal的转运。在六孔平板试验中，将125I-BBL或125I-BBLssPal(10μg/ml)与Caco-2细胞一起在无血清培养基中和37℃下培养1小时。随后，将细胞用冰冷的PBS漂洗3次，随后分成两组。在第一组中，偶联物的内化是在细胞经胰蛋白酶处理和分离后测定的。在第二组中，细胞用无血清培养基进行反复培养并在24小时内追踪从细胞中释放出的偶联物，每隔一小时就更换一次培养基并且测定它的放射活性。在追踪阶段结束时，将细胞胰蛋白酶解、分离并对累积放射活性进行计数。测定出各试验中的总计数(介质+细胞室)，同时也测定出不同时刻的总释放数的百分率。
在转孔试验中，偶联物与细胞顶膜一起在37℃下孵育1小时。随后用冰冷的PBS漂洗转孔，进而在无血清培养基中再孵育。通过在不同的时间对全部基础培养基或顶部培养基进行计数，从而在24小时内追踪释放到顶部和基础培养基中的偶联物。在追踪结束时所得的总计数值(转孔+介质计数的和，计算出在不同时间释放的(％总数)。为了确保在24小时所得的转孔内的计数值是由于细胞内存在的偶联物而不是非特异性结合的塑料，需将转孔在胰蛋白酶下暴露10分钟，用冰冷的PBS漂洗3次，最后对累积放射活性计数。
BBL可以用2或4个棕榈酸修饰，它们的转运是在转孔内测定的。BBL、用4个棕榈酸修饰的BBL[BBLssPal(4)]和用2个棕榈酸修饰的BBL[BBLssPal(2)]在Caco-2单层中的累积转运如图5A所示；这些结果以BBL(ng/单层)±SEM,n=3表示。转运程度的顺序是BBLssPal(4)＞BBL＞BBLssPal(2)。偶联物进入相同细胞的内化作用的结果如图5B所示，并且以ngBBL/单层表示。正如所预料的，BBLssPal(4)的细胞摄取作用最高，随后依次是BBLssPal(2)和BBL。在24小时时从转孔获得的基础培养基用G50柱分析；结果如图6所示。正如上面所观察到的，BBL和BBLssPal(4)都无法跨单层胞转。然而，却有少量但明显的含有由BBLssPal(2)组成的完整偶联物的基础培养基。它的量是基础培养基总放射活性的约10％至约20％。实施例7BBLssPal的皮肤吸收将从脱毛小鼠上新取的皮肤固定在小圆环上。在各固定的皮肤上，将5μl125I标记的BBL或BBLssPal以0.5mg/ml的浓度涂敷在0.38cm2的面积上。每种处理采用2片皮肤。将这些皮肤保持在湿润的环境中和室温下(23℃)。30分钟后，皮肤表面首先用PBS小心地漂洗；随后，将皮肤从圆环上解除固定并在100mlPBS中浸泡两次。随后，将皮肤涂抹在滤纸上并在γ计数器中计数。皮肤上的BBL残留量用通过标记的BBL或BBLssPal的特定放射活性来计算。小鼠皮肤对BBL和BBLssPal的吸收分别为0.14和1.6μg/cm2。这证实了当该多肽用Pal-PDC改性后，皮肤对BBL的吸收提高了10倍。实施例8棕榈酰化的辣根过氧化物酶(HRPssPal)的合成将处于0.5mlPBS中的10毫克辣根过氧化物酶(分子量40,000；Sigma化学品公司，St.Louis,MO,USA，目录号P8375)与2ml SPDP在0.1DMF的存在下和25℃混合2小时。用0.5mlPBS稀释以终止该反应，并在500mlPBS中和4℃下透析。24小时后，取出透析管中的溶液，加入50μl的1M DTT进行还原，用Sephadex*G-50柱分离。将在柱空隙体积时洗脱下的馏分合并，与摩尔数过量10倍的Pal-PDC的硼酸盐缓冲液(pH9.6)在25℃下混合4小时。随后将反应混合物在4℃下透析3天以达到完全，从终产物估算出每个HRP分子还原10个棕榈酸残基。该HRP分子保留了约20％的原始酶活性。实施例9HRPssPal的细胞摄取将在6孔培养簇板(cluster plate)中的小鼠成纤维L929细胞的融合单层在无血清培养基中与30μg/mlHRP一起孵育，HRP是原型或是棕榈酸偶联物(HRPssPal)。在37℃下孵育1小时后，细胞单层用PBS冲洗3次并溶解在1ml 0.05％Triton-X100中。通过测定各细胞提取物中的酶活性来确定细胞内的HRP，并且将结果换算成ngHRP/细胞单层。结果表明，HRP和HRPssPal的细胞摄取分别是7和229ngHRP/单层。因此，HRP通过与Pal-PDC改性，其细胞摄取提高了30倍。实施例10寡核苷酸的脂质化利用下列方法将与单胺氧化酶B互补的21元反义寡核苷酸硫醇化。将寡核苷酸在水溶性碳化二亚胺试剂，EDC的存在下与摩尔数过量2倍的胱胺混合。将混合物在25℃下保持2小时，加入比胱胺的摩尔数过量2倍的DTT以还原二硫键。用Sephadex*G-25柱将寡核苷酸从游离胱胺和DTT分离出来后，取少量硫醇化寡核苷酸与Ellman氏试剂反应，用412nm时的吸收度确定巯基浓度(假定ε为1.36×104M-1)。随后，测定每个寡核苷酸分子的巯基数。将硫醇化的寡核苷酸在碳酸氢盐缓冲液(pH8)中与Pal-PDC混合，所用Pal-PDC是寡核苷酸中巯基数量的2倍。用Sephadex*G-25柱纯化该棕榈酰化的寡核苷酸。实施例11合成去氨加压素-脂肪酸偶联物将去氨加压素(DP,4mg)溶解在2mlPBS(pH7.4)中并在37℃下用74.9ml的二硫苏糖醇(DTT,0.1M)处理。用TLC监测该反应(溶剂丁醇∶水∶乙酸(4∶5∶1)，上层)。DP中的二硫键在30分钟内全部被还原，TLC单一的紫外(UV)-吸收点(Rf=0.20)表明DP(Rf=0.15)已全部转化。当进行随后的偶联反应时，不必将已被DTT还原的DP(二硫去氨加压素)作进一步的加工。将还原的DP溶液与2.24ml 10mM Pal-PDC(10mM,pH7.6)在25℃混合30分钟，随后用盐酸(1N)将其酸化至pH3。通过离心分离出酸化反应混合物中的沉淀物并将其再溶解在1mL二甲基甲酰胺(DMF)中，该沉淀物是由去氨加压素的棕榈酰二硫偶联物(DP-P)和过量的反应物组成。进而用Sephadex*G-15柱(40ml)并以DMF作为洗脱剂来纯化DP-P。在柱空隙体积洗脱下的含DP-P馏分通过TLC(DP-P:Rf=0.24)分析来确定，并且将这些馏分合并。真空下除去溶剂后，得到3.8mg纯化的DP-P。
在DTT(作为还原剂)的存在下验证DP-P向DP的体外转化。将10ml DP-P(1mg/ml,PBS)用5ml DTT(0.1M)处理并且在37℃下反应。用TLC分析所得溶液，结果表明DP-P(Rf=0.24)逐渐消失，而同时DP(Rf=0.15)重新出现。1小时后，DP-P完全转化为DP。
DP与乙酸、己酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸或硬脂酸的偶联物可以通过类似于上述的方法但分别用脂肪酸-PDC代替Pal-PDC来制备。实施例12DP-P对遗传性丘脑尿崩症大鼠的作用用患有遗传性丘脑尿崩症的Brattleboro大鼠来比较DP和DP-P缓解疾病症状，即多尿和烦渴的作用。将每组3只Brattleboro大鼠置于三个代谢测定笼中。每天测定它们的体重、饮水量和排尿量。将DP和DP-P溶解在10％Liposyn*(Abbott实验室，Abbott Park,IL,USA)中并皮下(s.c)注射到每只大鼠，剂量范围是0.02至20μ/kg。图7图示了对3.3μg/kg剂量DP处理的典型反应，该剂量使大鼠的症状至少消失1天。另一方面，相同剂量的DP-P可以使大鼠的症状消失3天以上，此时饮水量和排尿量减少，但体重无明显改变。
为了评估Battleboro大鼠中对DP和DP-P的剂量依赖型反应，根据维持被处理动物尿液体积减少50％所需的时间的长短来确定抗利尿活性的有效作用。如图8所示，当对尿崩症进行皮下给药的处理时，DP-P至少比DP的效率高250倍，这是由于用0.02μg/kg DP-P和5μg/kg DP处理得到相似的效果。实施例13去氨加压素-脂肪酸偶联物在体内的构效关系测定Brattleboro大鼠中的DP及其脂肪酸衍生物的抗利尿作用。以0.5μg/kg的剂量(Abbott实验室)，将DP或其脂肪酸偶联物在10％Liposyn*中对3只大鼠进行皮下注射。测定每只大鼠的排尿量，求平均值，相对于日期绘线。如图9所示，为了提高抗利尿活性的有效性，DP偶联物的脂肪酸基团中的最低碳数为10。实施例14去氨加压素-棕榈酸偶联物(DP-P)静脉内给药后在小鼠体内的生物分布用125I按照氯胺T方法将DP和DP-P碘化。将125I-DP或125I-DP-P静脉内注射到CF小鼠中，所用剂量为1×108cpm/小鼠。在不同时刻取各组中的3只经处理小鼠处死，在γ计数器中对0.2ml的血液进行计数，从而测出血液内的放射活性。如图10所示，DP-P的血浆半衰期比DP的更长，结果是AUC(曲线下面积)增加了约6倍。实施例15合成N-脱氧胆酰基2-吡啶基联硫基半谷氨酸(DOC-PDC)在25℃和25ml乙酸乙酯中，将脱氧胆酸(585.2mg)、N-羟基琥珀酰亚胺(230.0mg)和二环己基碳化二亚胺(412.6mg)的混合物搅拌16小时。过滤除去二环己基脲沉淀，在减压条件下蒸发乙酸乙酯滤液，得到产物脱氧胆酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯。
将脱氧胆酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯粗品重新溶解在10ml DMF中，加入533mgPDC，随后再加入556.7μl三乙胺。将所得悬浮液在25℃搅拌5小时。进而，将该反应混合物用80ml蒸馏水稀释并用盐酸(6N)酸化至pH3。DOC-PDC沉淀通过离心被分离，将其重新溶解在40ml蒸馏水中，用氢氧化钠(5N)调节终溶液至pH8。在此条件下，将DOC-PDC溶解在水溶液中，离心除去不溶物。上清液用盐酸(6N)再酸化并且通过离心收集DOC-PDC，真空干燥。用TLC分析监测的终产物很纯净，可以直接用于制备偶联物而无需纯化。实施例16合成去氨加压素-脱氧胆酸(DP-DOC)偶联物按照与实施例11类似的方法制备DP-DOC。简单地说，将280μl10mMDOC-PDC(10mM,pH7.7)加入到还原DP的溶液(0.5ml 1mg/mlPBS)中。当TLC分析表明偶联反应达到完全时，该混合物已在25℃下搅拌30分钟。随后将该反应混合物用盐酸(1N)酸化为pH3，分离出成为沉淀的终产物DP-DOC。实施例17合成降钙素-棕榈酸偶联(CT-P)将鲑鱼降钙素(CT,4mg)溶解在2mlPBS(pH7.4)中并用46.6μl二硫苏糖醇(DTT,0.1M)在37℃下处理30分钟。由此得到的还原降钙素(二硫降钙素)无需分离即可用于下步偶联反应。向混合物中加入1.4ml1mMPal-PDC(10mM,pH7.6)。将该混合物在25℃下搅拌45分钟，随后用盐酸(1N)酸化至pH3。将含有棕榈酰二硫偶联物的降钙素偶联物(CT-P)和过剩反应物的沉淀物溶解在1mlDMF中。在Sephadex*LH20柱(40ml)中用DMF作为洗脱剂洗脱以纯化CT-P。在柱空隙体积时洗脱出的含有CT-P馏分通过TLC和UV(280nm)分析，并且将它们合并。真空下蒸发溶剂，得到3.2mgCT-P终产物。实施例18皮下给药的降钙素(CP)及其棕榈酸偶联物(CT-P)在小鼠中的缓释作用用125I按照氯胺T方法将CT和CT-P碘化。将125I-CT或125I-CT-P皮下注射到小鼠体内，所用剂量为125μg/kg并且以10％Liposyn*为介质。在不同时刻取各组中的3只经处理小鼠处死，用市售钙诊断试剂盒(SigmaChemical Co.)来测定血样中的钙水平。分离从各小鼠获取的血浆并且在冰浴中用5％三氯乙酸(TCA)处理。TCA沉淀的放射活性被认为是血浆中的完整CT。如图11所示，CT-P注射小鼠中的CT血浆半衰期比CT注射小鼠的明显高。CT-P注射小鼠的血钙水平只表现出短暂的降低，表明CT-P保留了CP的体内生物活性。更重要的是，与皮下注射CT的快速血液清除率相比，皮下注射CT-P后在约16小时内，CT或CT-P在血液中的水平几乎是一个常数。实施例19口服给药的降钙素-棕榈酸偶联物(CT-P)的胃肠道吸收和降钙作用用管饲针以100μg/kg的剂量(在PBS中)对CF小鼠进行CT和CT-P的口服给药。处理后1小时，各组取3只小鼠处死，从它们的血液中分离出血浆。分别用市售CT-PIA(Phoenix)和钙诊断(Sigma Chemical Co.)试剂盒来测定CT和钙的水平。结果如表5所示。用RIA检测小鼠中的CT水平，发现CT-P口服给药的CT水平明显比CT口服给药的高。此外，CT-P处理的小鼠在1小时时的血钙水平比CT处理小鼠的低，这与对CT水平的发现一致。由于CT-P与抗-CT抗体的交叉反应只有约10％,CT-P处理小鼠血浆中的实际总CT浓度甚至比表5中所列的数值要高。
表5CT和CT-P以100μg/kg的剂量口服给药1小时后小鼠体内的血钙浓度和钙降低率(N=3,”S.D)
实施例20合成阿昔洛韦-硫辛酸酯偶联物(ALV-LA)阿昔洛韦(ACV)和硫辛酸(LA)间的酯化反应是用二环己基碳化二亚胺在对甲苯磺酸(TsOH)的存在下催化的。产物，ACV-LA用制备TLC纯化。
将阿昔洛韦(ACV,25mg)、硫辛酸(LA,229mg)和二环己基碳化二亚胺(572.5mg)共同溶解在DMF(2.5ml)中。向所得溶液中加入10.8,gTsOH。在室温下将该混合物搅拌3天。过滤除去二环己基脲沉淀。真空下蒸除滤液中的DMF。将蒸发残余物悬浮在5ml去离子水中并用乙酸乙酯(2×3ml)提取。分离并冻干水层。
将冻干残余物重新溶解在数量甲醇中，并且上样到制备TLC平板上。用二氯甲烷∶丙酮∶甲醇(4∶1∶1)作为溶剂体系展开该平板。确定不同于ACV紫外吸收带的产物(Rf=0.41)，并且将其从TLC板上刮下，硅胶用2×15ml相同于TLC展开所用的溶剂混合物进行提取。在旋转蒸发器中蒸发溶剂提取物，得到11.7mg ACV-LA终产物。实施例21合成阿昔洛韦-硫辛酸-二棕榈酸偶联物(ACV-LA-DP)按照类似于去氨加压素-棕榈酸偶联物(实施例11)的方法制备本标题偶联物。将阿昔洛韦-硫辛酸(ACV-LA,0.6mg)溶解在0.5mlPBS(pH7.4)中并用14.5ml二硫苏糖醇(DTT,0.6mg)处理。还原反应是在37℃下进行30分钟。还原的ACV-LA(二硫化合物)无需进一步的分离即可用于下步偶联反应。向该混合物中加入531μl 10mMPal-PDC(10mM,pH7.7)。在25℃下将该混合物搅拌30分钟。反应混合物用盐酸(1N)酸化至PH3并出现沉淀。得到含有ACV-LA-DP的沉淀。产物可以通过色谱法进一步的纯化。实施例22脂质体制剂对去氨加压素-棕榈酸偶联物(DP-P)抗利尿作用的影响测定脂质体DP-P和处于Tris*缓冲液中的DP-P在以37.5μg/kg剂量向Brattliboro大鼠口服给药后的抗利尿作用。为了制备脂质化的DP-P，将二肉豆蔻酰磷酯酰胆碱、胆甾醇和硬脂酰胺(7∶2∶1)的甲醇溶液蒸发，得到一个干膜。将该膜在含有适量DP-P的Tris*缓冲液中水合(2小时/25℃)，随后进行探针式声处理(15分钟/37℃)。将所得脂质化制剂用Tris*缓冲液稀释至总体积为5ml，该溶液需立刻使用。在用DP-P溶液处理的大鼠中，在口服给药后头5小时内收集到的尿的总体积是53.3±15.3ml，这与对照组的并无明显区别(47.0±3.5ml)。然而，脂质化DP-P表现出显著的抗利尿作用，这是由于其在头5小时内收集到的排尿总体积是27.0±1.0ml。
所属领域技术人员很容易从上述描述中弄清本发明的特征所在，并且在不背离本发明宗旨和范围的条件下，可以将本发明用于多种用途和情况。根据具体的情况或为了提供方便，可以考虑形式上的改变和等同替换，并且在此所用的特定术语只具有说明的意义而不是出于限定性目的。所有在此引用的公开物、专利和专利申请都以全文引入作为参考文献。
权利要求
1．具有下列通式的化合物
其中P1为从含二硫化物衍生的残基，该基团可以任选性含有与二硫基相连的如下式所示的疏水性取代基
各个R1和R4独立地选自由氢、低级烷基或芳基组成的基团；各R2和R5独立地为蔬水性取代基；各R3和R6独立地选自羟基、疏水性取代基和含有1或2个氨基酸并且以-CO2H或COR2为末端的氨基酸链；并且n是1至20的整数。
2．根据权利要求1所述的化合物，其中各R1与R4相同，各R2与R5相同，并且各R3与R6相同。
3．根据权利要求2所述的化合物，其中各R1为氢，各R2为脂基部分，各R3为羟基并且n不大于10。
4．根据权利要求2所述的化合物，其中各R1为氢，各R2为脂肪酸部分或甾类化合物，各R3为羟基。
5．根据权利要求2所述的化合物，其中所述疏水性取代基是含有约4至约26个碳的部分脂肪酸残基。
6．根据权利要求5所述的化合物，其中所述疏水性取代基是是含有约5至约19个碳的部分脂肪酸残基。
7．根据权利要求6所述的化合物，其中所述脂肪酸是棕榈酰基、油酰基或硬脂酰基。
8．根据权利要求2所述的化合物，其中各R2是甾类化合物。
9．根据权利要求8所述的化合物，其中所述甾类化合物选自脱氧胆酸盐和胆酸盐。
10．根据权利要求1所述的化合物，其中P选自肽、蛋白质、氨基酸、核苷酸、核苷、寡核苷酸和碳水化合物；或是它们的衍生物。
11．根据权利要求1所述的化合物，其中P1具有下式
12．根据权利要求1所述的化合物，其中所述任选性的与疏水性取代基键合的二硫化物不存在。
13．药物组合物，其含有权利要求1所述的化合物以及可药用载体。
14．根据权利要求13所述的药物组合物，它是脂质体形式。
15．提高哺乳动物对含二硫基有机化合物体内吸收的方法，所述方法包括给哺乳动物施用有效量的权利要求1所述化合物。
16．根据权利要求15所述的方法，其中含二硫基有机化合物选自肽、蛋白质、氨基酸、核苷酸、核苷、寡核苷酸和碳水化合物；或它们的衍生物。
17．根据权利要求15所述的方法，其中各R1和R4为氢，各R2和R5为部分脂基，并且各R3和R6为羟基，并且n不大于10。
18．根据权利要求1 5所述的方法，其中各R1和R4为氢，各R2和R5为部分脂肪酸或甾类化合物，并且各R3和R6为羟基。
19．延长含二硫基有机化合物在哺乳动物体内血液和组织中保留的方法，该方法包括给哺乳动物施用有效量的权利要求1所述化合物。
20．根据权利要求19所述的方法，其中含二硫基有机化合物选自肽、蛋白质、氨基酸、核苷酸、核苷、寡核苷酸和碳水化合物；或它们的衍生物。
21．根据权利要求19所述的方法，其中各R1和R4为氢，各R2和R5为部分脂基，并且各R3和R6为羟基，并且n不大于10。
22．根据权利要求19所述的方法，其中各R1和R4为氢，各R2和R5为部分脂肪酸或甾类化合物，并且各R3和R6为羟基。
23．制备权利要求1所述化合物的方法，所述方法包括步骤a)还原含二硫化物的化合物，以形成还原的含二硫化物的化合物；和b)将还原的含二硫化物的化合物与下式所示的化合物反应A-S-S-CH2CR1(NHCOR2)C(=O)R3其中A是芳香活性的残基，通过此方法可以制得所述化合物。
24．根据权利要求2 3所述的方法，其中所述含二硫化物的化合物含有一个以上的二硫化物，并且所述含二硫化物的化合物在步骤a)中部分还原。
25．制备权利要求1所述化合物的方法，其中各R1与R4不相同，各R2与R5不相同，并且各R3与R6不相同；所述方法包括步骤将通式Ⅵ1化合物与通式Ⅵ2化合物偶联，以生成权利要求1所述化合物，其中通式Ⅵ1和Ⅵ2如下所示
其中P2和P3是从含巯基化合物衍生的残基，通过该方法可以制得权利要求1所述化合物。
全文摘要
本发明涉及将含有二硫化物的脂肪酸衍生物(例如含二硫化物的肽和蛋白质)的化合物用于哺乳动物细胞给药,所述衍生物包括带有二硫键的脂肪酸偶联产物。与未偶联化合物的吸收率相比,这种改性可以显著地提高哺乳动物相比对化合物的吸收,也可以延长化合物在血液和组织中的保留。此外,偶联物中的二硫键在体内相当不稳定,因此很容易将完整的化合物从脂肪酸基团上释放到细胞内或细胞外。
文档编号C07H19/16GK1235594SQ97199191
公开日1999年11月17日 申请日期1997年9月26日 优先权日1996年9月26日
发明者W－C·沈, J·王 申请人:南加利福尼亚大学