专利名称：一种从混合物中分离胸苷的方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，涉及一种从混合物中分离胸苷的方法。
胸苷，(代号dT)是一种重要的生化试剂，在生物化工领域的研究和生产中有着十分广泛的应用。近年来，由于爱滋病在全球蔓延，严重威胁着人类的生命，因此抗爱滋病毒药物的开发研究得到了人们的关注，胸苷是制备抗爱滋病药——叠氮胸苷(AZT)的重要原料，无论作为生化试剂还是作为制备叠氮胸苷(AZT)的原料，其含量必须在98％以上，而且其中的5-甲基尿苷的含量不能超过0.3％。目前胸苷的制备主要有化学合成和DNA酶解两种方法，所得到的胸苷粗品中含有大量的杂质由化学合成法所得到的胸苷粗品中含有油状物，色素，5-甲基尿苷等胸苷衍生物，酶解法所得到的胸苷粗品中则含有脱氧腺苷(dA)，脱氧胞苷(dC)，脱氧乌苷(dG)，脱氧肌苷(dI)等杂质，如何从胸苷的混合物中分离出高纯度的胸苷，则成为许多科技人员所关注的课题。
目前，化学合成法所得胸苷粗品的常用分离方法是这样的先蒸发除去溶剂，然后加甲醇或乙醇溶解，滴加乙酸乙酯，加热回流，冷却结晶，从而获得胸苷产品，该方法由于反复结晶，收率低，色泽差，5-甲基尿苷的含量高，且结晶母液不能回收；文献(E.查加夫，J.N.达达伏生《核酸》第1卷，19，279页)公开了一种在硼酸盐系统中利用强碱阴离子交换层析法分离胸苷的方法，但是，该方法不能去除杂质和色素，不适宜于工业化生产。因此，必须尽快研究开发一种高收率、适宜于工业化生产的分离胸苷的方法，以满足工业生产的需要。
本发明的目的在于公开一种采用大孔弱酸性阳离子交换树脂和大孔弱碱性阴离子交换树脂吸附和加入硼酸盐以去除胸苷溶液中的杂质，从而获得高纯度胸苷的方法，以期克服现有技术所存在的缺点，满足工业生产的需要，本发明所得胸苷的含量可达98％以上，且能适宜于工业化生产。
由于胸苷混合物的来源不同，因而混合物中胸苷的含量也不同，杂质的种类也不同，根据不同的胸苷混合物和产品要求，发明人依据大量的试验，提出如下去除杂质的构思(1)对于采用化学法合成的胸苷混合物，先用大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂吸附混合溶液中大部分色素和少量杂质，然后再用大孔弱碱性离子交换树脂吸附混合溶液中剩余少量的色素和大量的杂质，如5-甲基尿苷等胸苷衍生物，同时在溶液中或结晶时加入少量的硼酸盐，使其与残留于溶液中的少量5-甲基尿苷形成络合物，增加其溶解度，通过常规的结晶方法即可获得高纯度的胸苷产品；(2)对于采用DNA酶解法获得的胸苷混合物，则先用强酸性阳离子交换树脂除去大部分dG，dC，dI，dA等杂质，然后再用(1)的方法获得高纯度的胸苷。
(3)对于仅含少量5-甲基尿苷的胸苷混合物，可直接加入少量硼酸盐，降低产品中5-甲基尿苷的含量，然后通过常规的结晶方法而获得高纯度的胸苷产品。
本发明亦是这样实现的由5-甲基尿苷为原料合成的胸苷粗品中含有胸苷50％、5-甲基尿苷10％和其它杂质，将含有杂质的胸苷粗品固体溶解于去离子水中，其水溶液呈深棕色，并有油状物和悬浮物，将该水溶液以40～60ml/h的流速流过大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂柱，除去大部分的油状物、悬浮物、色素及部分胸苷衍生物，常用的阳离子交换树脂为市售的HD-1、122、125等，其用量为dT∶树脂＝1∶6(W∶V)；然后再以40～60ml/h的流速流过大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂柱，除去剩余的色素及胸苷衍生物，常用的大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂为市售的D301、D309、D396、D351、709、710A、710B、Amberlite IRA-63、IRA-93、IRA-94、IRA-943、Amberlyst -A-21、XE-1003、Diaon WA-20、WA-21、Lewatit MP-60、Duolite A-305等，其用量为dT∶树脂＝1∶12(W∶V)。上述弱酸阳离子交换树脂柱和弱碱阴离子交换树脂柱相互串联，连成一体。串联通过两柱后流出的为无色或淡黄色胸苷水溶液，绝大部分的杂质已被吸附除去，该水溶液采用常规的浓缩、结晶、干燥方法，即可获得含量高于98％的胸苷结晶体。为了有效地除去溶液中的5-甲基尿苷，可在胸苷粗品的水溶液中或在结晶时加入少量硼酸盐，如四硼酸钠等，使胸苷结晶体的纯度达到99％以上。硼酸盐加入量为5-甲基尿苷∶硼酸盐＝1∶0.1～1，最佳为1∶0.3～0.5(质量比)。由于弱酸阳离子交换树脂和弱碱阴离子交换树脂不吸附胸苷，因此胸苷的回收率几乎可达100％，而结晶母液可再次通过上述方法加以回收。
对于由DNA酶解法所获得的胸苷粗品，因其中含有dG，dC，dI，dA等杂质，故可使该胸苷粗品的水溶液先通过强酸性阳离子交换树脂，以先除去其中的dG，dC，dI，dA等杂质，然后再以上述方法获得高纯度的胸苷结晶体，回收率亦可达到95％以上，常用的强酸性阳离子交换树脂为市售的732、001×7、001×6、001×8、Amberlite IR-12等。
对于仅含有少量5-甲基尿苷的胸苷，则可直接加入少量硼酸盐，如四硼酸钠等，使胸苷结晶体的纯度达到99％以上。硼酸盐加入量为5-甲基尿苷∶硼酸盐＝1∶0.1～1，最佳为1∶0.3～0.5(质量比)。
下面将结合附图进一步阐明本发明的内容。
图1为分离提纯化学合成法得到的胸苷粗品的工艺流程简图。
其中1————大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂柱2————大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂柱3————浓缩釜4————结晶器5————过滤器将溶于水中的胸苷粗品或结晶母液按序流过大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂柱1、大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂柱2，其流速控制在40～60ml/h左右，流出阴离子交换树脂柱的胸苷溶液进入浓缩釜3浓缩，在结晶器4中结晶，通过过滤器5可得到高纯度的胸苷晶体；由于浓缩、结晶、过滤为现有技术，此处不再赘述。为了获得高纯度的胸苷晶体，可在溶液中或结晶时加入少量硼酸盐，一般加入量为5-甲基尿苷∶硼酸盐＝1∶0.1～1，最佳为1∶0.3～0.5。
图2为分离提纯酶解法得到的胸苷粗品的工艺流程简图。其中6————强酸性阳离子交换树脂柱将溶于水中的胸苷粗品或结晶母液按序流过强酸性阳离子交换树脂柱6、大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂柱1、大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂柱2，其流速控制在40～60ml/h左右，流出阴离子交换树脂柱的胸苷溶液进入浓缩釜浓缩3，在结晶器4中结晶，通过过滤器5即可得到高纯度的胸苷晶体。
下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，由于强酸性阳离子交换树脂7、大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂1和大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂2的种类繁多，有关的工程技术人员可以按照本发明所公开的构思和技术方案，举一返三地实现本发明，故实施例本身并不限制本发明的保护范围。
实施例1将15克含有50％胸苷、10％5-甲基尿苷和其它杂质的胸苷粗品溶于120ml去离子水中，将此胸苷溶液以40ml/h的流速流过HD-1阳离子交换树脂柱1和D315阴离子交换树脂柱2，HD-1的用量为45ml，柱的直径为12mm，柱的长度为600mm，D315的用量为90ml，柱的直径为20mm，柱的长度为600mm，上样完毕，再加入200ml去离子水，将留在柱中的胸苷溶液排出。开始流出的为100ml的水，接着流出的为300ml的胸苷溶液，回收率为95％，浓缩后加入0.4克四硼酸钠，结晶、过滤和干燥后可得胸苷4.5克，含量99.2％，结晶母液可按上述方法再次回收胸苷1.8克，二次总得率为84％。
实施例2称取结晶母液54.7公斤，其中胸苷含量为19％，5-甲基尿苷含量为7％，在此溶液中加入1公斤硼酸钠，用去离子水稀释至200L。然后以60L/h的流速流过过HD-1阳离子交换树脂柱和D315阴离子交换树脂柱，HD-1的用量为90L，柱的直径为400mm，柱的长度为2000mm，D315的用量为120L，柱的直径为400mm，柱的长度为2000mm，然后再加入去离子水，将留在柱中的胸苷溶液排出，收集柱中排出的溶液，胸苷回收率为99％，浓缩后加入1公斤四硼酸钠、结晶、干燥后可得胸苷5公斤，含量99.6％，结晶母液可按上述方法再次回收，二次总得率为70％。
实施例3称取由DNA酶解法制备的胸苷溶液160ml，其中含有2克胸苷以及dA、dC、dG、dI等杂质，将此溶液先流过732强酸性阳离子交换树脂30ml，然后再以60L/h的流速按序流过HD-1阳离子交换树脂柱和D315阴离子交换树脂柱，HD-1的用量为30ml，柱的直径为12mm，柱的长度为600mm，D315的用量为120ml，柱的直径为12mm，柱的长度为60mm，然后再加入去离子水，将留在柱中的胸苷溶液排出，收集柱中排出的溶液，经浓缩、结晶、干燥后可得胸苷14克，含量98.2％，得率为70％。
实施例4采用与实施例1相同的原料，工艺参数和交换柱，采用122阳离子交换树脂和D301阴离子交换树脂，可得胸苷6.1克，含量99.3％，得率81％。
实施例5采用与实施例1相同的原料，工艺参数和交换柱，采用125阳离子交换树脂和D709阴离子交换树脂，可得胸苷6.0克，含量99.7％，得率80％。
实施例6采用与实施例1相同的原料，工艺参数和交换柱，采用HD-1阳离子交换树脂和Amberlite IRA-63阴离子交换树脂，可得胸苷6.2克，含量99.5％，得率83％。
实施例7采用与实施例1相同的原料、工艺参数和交换柱，结晶时不加硼酸盐，可得胸苷6.1克，含量98.6％，得率82.0％。
实施例8采用与实施例1相同的原料、工艺参数和交换柱，结晶时不加硼酸盐，而在原料溶液中加入四硼酸钠0.15克，可得胸苷6.2克，含量99.0％，得率82.5％。
实施例9采用与实施例1相同的原料、工艺参数和交换柱，结晶时加入四硼酸钠1.5克，可得胸苷6.3克，含量99.2％，得率82.6％。
权利要求
1.一种从混合物中分离胸苷的方法，主要包括杂质的去除、浓缩(2)、结晶(3)、过滤(4)过程，其特征在于杂质的去除是这样进行的将含有杂质的胸苷水溶液按序流过两根串联的离子交换树脂柱，所说的离子交换树脂柱为大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂柱(1)和大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂柱(2)。
2.据权利要求1所述的方法，其特征在于含有杂质的胸苷水溶液首先流过一强酸性阳离子交换树脂柱(6)，然后再流过大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂柱(1)和大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂柱(2)，常用的强酸性阳离子交换树脂为732阳离子交换树脂。
3.据权利要求1、2所述的方法，其特征在于所说的大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂为HD-1、122、125中的一种；所说的大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂为D301、D309、D396、D315、709、710A、710B、Amberlite IRA-63、IRA-93、IRA-94、IRA-943、Amberlyst-A-21、XE-1003、Diaon WA-20、WA-21、Lewatit MP-60、Duolite A-305中的一种，常用的为D315、D301或Amberlite IRA-63中的一种。
4.据权利要求1所述的方法，其特征在于结晶时或在胸苷的水溶液中加入硼酸盐，常用的硼酸盐为四硼酸钠，使四硼酸钠与5-甲基尿苷形成络合物，加入量为5-甲基尿苷∶硼酸盐＝1∶0.1～1(质量比)。
全文摘要
本发明属于生物化工技术领域,涉及一种从混合物中分离胸苷的方法。所说的方法将含有杂质的由化学合成法获得的胸苷溶液按序流过大孔酚醛系弱酸阳离子交换树脂和大孔弱碱丙烯酸系阴离子交换树脂,并在溶液中加入适量的硼酸盐,以提高胸苷产品的纯度;对于酶解法所获得的胸苷溶液,则可添加一个强酸性阳离子交换树脂,以便更好地除去溶液中的杂质。本发明所述的方法,工艺简单,产品得率高,纯度可达99%以上,能够满足工业生产的需要。
文档编号C07H1/06GK1190656SQ9811060
公开日1998年8月19日 申请日期1998年1月5日 优先权日1998年1月5日
发明者邱蔚然, 邵任森, 邵学锋 申请人:华东理工大学, 上海力博生物化工厂