专利名称：改良的用于制备胺与邻羟基醛的席夫碱加合物的方法以及基于该物质的组合物的制作方法
技术领域：
本发明的技术领域涉及具有改善的稳定性和其它预期性能的、包含胺与醛或酮的席夫碱加合物的有机分子的合成。本发明特别涉及以工业规模生产大量这类加合产物的经济而有效的方法。上述技术领域尤其与具有胺组分的那些加合物有关，所述胺组分是公认在动物和人的治疗中有价值的蛋白质，其中该加合产物具有改善的与其给药和药物动力学有关的性能。
本发明是基于这样一个出乎意料的发现上面所述的加合产物可以具有定量收率地以一种容易的、可重复的和可转置的方法生产，该方法是利用冷冻干燥、喷雾干燥或相关方法来进行基础反应；并使该反应混合物的pH保持在7.0或更高；同时要求醛反应物选自芳族邻羟基醛。这一发现广泛地适用于所有蛋白质反应物，所述蛋白质反应物满足在下文中更详细描述的与它们的实用性有关的某些标准。例如，本发明涉及生产一种猪促生长素和芳族邻羟基醛即邻香草醛的席夫碱加合物。猪促生长素是一种用于提高猪的饲料效率的生长激素。
背景技术：
在与本发明最相关的领域中，大家都知道胺化合物，尤其是蛋白质，可以通过与醛或酮反应来提高它的稳定性和加工性能。例如，细胞色素C已经以一种容易逆转的方法与水杨醛反应，使得可就电荷修饰对蛋白质性能的影响进行研究。
与科技文献中的大多数描述不同，Williams和Jacobs在《生物化学与生物物理学学报》154(1968)323-331中的描述涉及席夫碱加合终产物的分离。使水杨醛和细胞色素c的混合物沉淀，并可从所用的达到长期平衡的次数推断是否已完全转化。该文献中涉及的加合物的形成可以用以下部分化学式来说明 其中伯胺是赖氨酸分子上的ε-氨基，它已与水杨醛分子的羰基部分反应形成亚胺，可表示为R-(R-)C=N-R。这类亚胺通常称之为席夫碱，它们的制备一般用酸或碱催化进行，或加热进行。一般通过沉淀亚胺、除去水、或二者结合来推动席夫碱形成反应的完成。
作为本领域中这类应用的另一个例子是，镰状红细胞已用各种醛和酮进行处理，从而与细胞内血红蛋白的氨基形成亚胺键。参见Zaugg等人，《生物化学杂志》252(23)(1977)8542-8548。已发现芳族醛比它们的脂族对应物更具反应性，而酮是惰性的。环取代对这种反应性的影响符合关于电子和位阻效应的正常预期结果。特别是，2,4-二羟基苯甲醛和邻香草醛显著增加了血红蛋白A和S的氧亲和性。然而，没有提示邻羟基醛将是在生产与蛋白质的席夫碱加合物中获得定量收率所必需的。
在有关与胺而不是蛋白质(例如小分子药物)的席夫碱加合物的科技文献中有几个偶然的例子。Fujiwara等在《化学与药学通报》30(1982)3310和《化学与药学通报》31(4)(1983)1335-1344中提到了头孢氨苄(一种抗生素头孢菌素)和醛的加合物的形成。但是，没有使用邻羟基醛的暗示；虽然这些产物是通过将其碱性溶液冷冻干燥而得到的；该参考文献没有提示本发明的制备方法和由此得到的定量收率。
在此以前，席夫碱已在用于确定蛋白质分子质量以及测量蛋白质中的伯氨基位点(N-末端加上赖氨酸残基)数目的分析操作中使用。参见例如，Le Blanc等，《分析化学》66(1994)3289-3296，该文涉及溶液中蛋白质-酮平衡的电喷射质谱研究。其中使用了丙酮，但未提出使用芳族邻羟基醛。
电喷射质谱分析被用于检验大蛋白质，例如胰岛素、遍在蛋白和血红蛋白，它也可以与本发明的方法联合使用，以提供一种准确而又精密的手段来确定席夫碱加合物已形成至何种程度。当胺为大蛋白质时，用于测定醛和胺之间形成的席夫碱的量的传统方法是无效的，因为这些技术通常是溶液方法，并且当分离的席夫碱加合物溶于水时，会发生可逆反应而导致一个平衡混合物。不过，Le Blanc使用的是丙酮，而没有提出使用芳族邻羟基醛。
席夫碱连接的缀合物已被用作导向蛋白与一种或多种诊断或治疗剂之间的接头。参见例如Reed的US 5,633,351。导向蛋白结合一个确定细胞群，诸如受体或酶底物，所述治疗剂是一种药物、毒素或放射性核素，而诊断剂是一种放射性核素。有关的席夫碱键具有以下结构 其中“L1”和“L2”是在一端带有一个酰肼或醛/酮活性基的异双功能接头。但是，没有暗示在pH≥7.0下使用芳族邻羟基醛以得到定量收率的席夫碱加合终产物。
Clark等在US 5,198,422中提到了一种用于胃肠外给药的稳定化促生长素，其中提到优选的芳族醛是2-羟基-3-甲氧基苯甲醛，即邻香草醛。然而，Clark等仅提到了当产物以结晶形式分离时所得到的促生长素生长激素的治疗益处。虽然一般性地提到使用冷冻干燥进行分离，但很清楚，Clark等意图的分离方法是“干燥”型方法，即涉及长时间干燥的方法，所举的例子是在真空烘箱中干燥过夜。所以，该参考文献没有教导本发明的制备方法。
在科技文献中仅有有限的文章涉及通过喷雾干燥制备席夫碱加合物。参见，例如，Tomlinson等，《食品化学》48(1993)373-379，该文献提到喷雾干燥葡萄糖和甘氨酸的水溶液。此方法生产出一种可用于食品着色的褐色粉末。所涉及的实际化学方法是美拉德反应或“棕黄”反应，其中蛋白质的氨基与糖的羟基反应，形成褐色色素。
上述Tomlinson等人提到并以之为基础的是Baines等的早期工作，见US 4,886,659,该专利也涉及用于食品化学的有色化合物的生产。Baines等提示，可以从美拉德起始物开始在非常短暂的喷雾干燥反应条件下生产出颜料，例如，在所有的水蒸发而有效地终止反应之前的反应时间小于10秒，有时小于1秒。
该文中也提到使用一个固定喷嘴或一个旋转圆盘，调节它们的设置以控制液滴大小、干燥颗粒的大小和其它液滴特性。反应温度据信接近于出口的空气温度。还提到预先加热水溶液，例如不超过60℃。在加入喷雾干燥器之前，产物的水分含量为3.5-15％重量。还提到了一个旋转圆盘式喷雾干燥器，其圆盘旋转速率为35,000-40,000rpm。
但是，Tomlinson等人和Baines等人没有提示本发明的制备方法，因为他们关注的是美拉德反应，这是一个在任何方面都与本发明方法完全不同的方法。美拉德反应通常是不可逆的，它导致低聚物的形成。这些特性限制了美拉德反应在深色颜料制备过程中的有用性。
Dhont,《Proc.Int.Symp.Aroma Research,Zeist》(1975)193-194中提到了有关诸如从大豆蛋白质得到的那些合成食品的芳构化的工作。其中提到将白蛋白和香草醛的溶液冷冻干燥，这样，加入的香草醛有大约90％被蛋白质结合，尽管还注意到蛋白质通过包封或吸附保留了一些香草醛。其中提出了席夫碱的形成，但是，香草醛不是一种邻羟基醛，并且反应物没有完全转化成席夫碱。因此，Dhont所采用的方法既不同于本发明的方法，也没有对本发明的方法作出提示。
发明概述本发明涉及一种用于制备席夫碱缩合加合终产物的新的改良方法，该终产物的组分包含一种对动物具有有益活性的蛋白质和一种芳族邻羟基醛。本发明的制备方法基本上能定量形成缩合加合物并提高终产物的总收率。
本发明的方法还涉及一种容易的、可重复的、可转置的、有效而又经济的生产缩合加合终产物的方法。所述方法包含将上述组分一起混合在pH7.0或更高pH值下的含水环境中而形成一种反应混合物。该反应混合物的溶剂是水，即反应发生的介质，包括在反应过程中形成的缩合的水，所述反应发生在能有效推动所述缩合反应实质上完成的条件下，缩合反应的实质完成是通过除去在所述缩合反应过程中存在的约97.0％-约99.9％重量的水，优选约98.0％-约99.0％重量的水，同时保持该缩合反应物和加合终产物的完整性，而所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
上述缩合反应也可以在减少水分的条件下进行，由此加快水的去除速率和提高所去除的总量。条件是，与通过除去存在的约97.0％-约99.9％重量的水来推动缩合反应完成的目标相一致，在缩合加合终产物中所存在的水分的量将相当于该终产物重量的3.0％-0.001％，优选为2.0％-3.0％重量，以所述终产物的重量计。缩合反应完成后，所存在的水分的量可以降至0.1％-0.001％重量，或0.05％-0.005％重量，或者甚至低至0.03％-0.01％重量，以终产物的重量计。另外，当蛋白质的稳定性需要时，也可以存在实质上更高含量的水分，该水分的含量在3.0％-20.0％重量范围内，优选为5.0％-15.0％重量，更优选为8.0％-12.0％重量，以终产物的重量计。
用于上述缩合方法的芳族邻羟基醛优选包含一个或多个下式化合物 其中R1和R4独立地选自氢；羟基；卤素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)环烷基；(C2-C6)链烯基；-C(=O)OR7；-OC(=O)R7；-S(=O)2；-S(=O)2N(R7)(R9)；-S(=O)2R7；-S(=O)2OR7；-C(=O)NR7R9；-C(=O)R9和-N(R7)(R9)，其中R7是氢或(C1-C4)烷基，R9是(C1-C4)烷基；其中定义R1和R4的所述烷基、环烷基和链烯基可选地被选自以下成员的一个或两个取代基独立地取代卤素；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺酰基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；和X和Y独立地为N，或分别为CHR2或CHR3，其中R2和R3独立地选自氢；羟基；卤素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)环烷基；(C2-C6)链烯基；-C(=O)OR11；-OC(=O)R11；-S(=O)2；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11是氢或(C1-C4)烷基，R13是(C1-C4)烷基；并且其中定义R2和R3的所述烷基、环烷基和链烯基可选地被选自以下成员的一个或两个取代基独立地取代卤素；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺酰基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；优选的是，R1和R4独立地为氢；羟基；三氟甲基；(C1-C4)烷基；(C1-C4)烷氧基；-C(=O)OR7或-N(R7)(R9)，其中R7是氢或(C1-C2)烷基，R9是(C1-C2)；更优选R1和R4独立地为氢；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；羧基或甲氨基，在这种情况下R7为氢而R9为甲基。优选的是，当R1和R4定义为烷基并被取代时，仅有选自以下成员的一个取代基羟基；(C1-C2)烷氧基；羧基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；更优选所述单个取代基选自羟基、甲氧基和二甲氨基。
优选的是，X或Y之一为N而另一个分别为CHR2或CHR3；更优选X为CHR2,Y为CHR3，其中R2和R3优选独立地为氢；羟基；卤素；三氟甲基；(C1-C4)烷基；(C1-C4)烷氧基；-C(=O)OR11；-S(=O)2N(R11)(R13)；或-N(R11)(R13)，其中R11优选为氢或(C1-C2)烷基，R13为(C1-C2)烷基；更优选R2和R3独立地为氢；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；羧基；或甲氨基，在这种情况下R11为氢，R13为甲基。
优选当R2和R3定义为烷基并被取代时，仅有选自以下成员的一个取代基羟基；(C1-C2)烷氧基；羧基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
首选的是，所述邻羟基醛包含邻香草醛；水杨醛；2,3-二羟基苯甲醛；2,6-二羟基苯甲醛；2-羟基-3-乙氧基苯甲醛；或吡哆醛；它们可以用下列结构式表示 邻香草醛 水杨醛 2,3-二羟基苯甲醛 2,6-二羟基苯甲醛 吡哆醛 2-羟基-3-乙氧基苯甲醛另外，该席夫碱缩合加合终产物的蛋白质组分包含一个对动物具有有益活性的肽，所述有益活性包括有作为用于生产食品的动物生长促进剂的效用，以及作为用于治疗和预防多种疾病和不利状态的兽医产品的治疗效用。该蛋白质组分也具有作为治疗和预防人的疾病和不利状态的治疗剂的效用。
该蛋白质组分在化学结构上是伯胺，并可以具有少至两个氨基酸直到数百个氨基酸甚至多到上千个以上氨基酸。所述蛋白质组分和如本文中规定形成的缩合加合终产物公认具有治疗动物和人的价值。
以下特定蛋白质尤其适用于本发明
内源性的和合成的蛋白质阿片样止痛剂和拮抗剂，包括脑啡肽、内啡肽和强啡肽，它们是μ、κ和δ阿片样物质受体亚型的选择性和非选择性兴奋剂和拮抗剂，包括[Leu5]和[Met5]脑啡肽；强啡肽A和B；α-和β-新内啡肽；[D-Ala2,MePhe4,-Gly(ol)5]脑啡肽(DAMGO)；[D-Pen2,D-Pen5]脑啡肽(DPDPE)；[D-Ser2,Leu5]脑啡肽-Thr6(DSLET)；[D-Ala2,D-Leu5]脑啡肽(DADL)；D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP)；[D-Ala2,N-MePhe4,Met(O)5-ol]脑啡肽(FK-33824)；Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2]δ啡肽Ⅰ；Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2,Glu4]δ啡肽Ⅱ；Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2(morphiceptin)；Tyr-Pro-MePhe-D-Pro-NH2(PL-017)；和[D-Ala2,Leu5,Cys6]脑啡肽；内分泌物，包括为响应选自组织损害、病毒感染和变态反应的炎症事件而由蛋白水解反应产生的缓激肽和胰激肽，其中所述蛋白质局部见效而导致疼痛、血管舒张、血管通透性增加和前列腺素合成，其中所述蛋白质具有兴奋剂和拮抗剂活性，可用于治疗男性不育，用于癌症化疗剂越过血脑屏障释放，和用于治疗疼痛、哮喘和其它慢性炎症疾病，包括Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(缓激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脱-Arg9-缓激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脱-Arg10-胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu(脱-Arg9-[Leu8]-缓激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-[D-Phe]-Phe-Arg([D-Phe7]-缓激肽)；和[D-Arg]-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg(HOE 140)，其中Hyp是反式-4-羟基-Pro；Thi是β-(2-噻吩基)-Ala；Tic是[D]-1,2,3,4-四氢喹啉-3-基-羰基；Oic是(3as,7as)-八氢吲哚-2-基-羰基；对分别介导加压应答和抗利尿应答的加压素受体亚型V1和V2有效的蛋白质，包括在充血性心力衰竭、高血压、手术后肠梗阻和腹部膨胀的治疗中有益的V1拮抗剂，用于通过控制多尿和烦渴来治疗中枢性尿崩症的V2兴奋剂，以及用于治疗出血性疾病包括威勒布兰特病的V2兴奋剂，包括特异性天然产生的加压素样肽下式表示的精氨酸加压素(AVP) 和赖氨酸加压素([Lys8]-AVP)；合成加压素肽V1a-选择性兴奋剂[Phe2,Ile2,Orn8]AVP；V1b-选择性兴奋剂脱氨基[D-3-(3’-吡啶基)-Ala2]AVP；V2-选择性兴奋剂去氨加压素(dDAVP)和脱氨基[Val4,D-Arg8]AVP；以及肽拮抗剂，包括下式表示的V1a-选择性拮抗剂d(CH2)5[Tyr(Me)2]AVP 和V1b-选择性拮抗剂dp[Tyr(Me)2]AVP；以及V2-选择性拮抗剂脱Gly-NH29-d(CH2)5[D-Ile2,Ile4]AVP和d(CH2)5[D-Ile2,Ile4,Ala-NH29]AVP；用作胃液分泌的一种指示剂的五肽胃泌素，化学式为N-叔丁氧羰基-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2；用于治疗胃肠道肿瘤的症状、其它疗法难以治疗的腹泻、能动性障碍和胃肠出血的奥曲肽，化学式为L-半胱氨酸酰胺-D-Phe-L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-N-[2-羟基-1-(羟甲基)丙基]-，环(2→7)-二硫化物，[R-(R*,R*)]-；用作免疫抑制剂的抗体试剂，包括抗胸腺细胞球蛋白；鼠单克隆抗体-CD3单克隆抗体；和Rh0(D)免疫球蛋白；以及用于治疗免疫缺损状态的蛋白质免疫刺激剂，包括免疫球蛋白；由白细胞产生并具有各种各样免疫调节作用的细胞因子，包括干扰素，集落刺激因子和白介素，特别是α-干扰素；干扰素-γ(IFN-γ)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；和白介素-1(IL-1)至白介素-12(IL-12)；涉及调节成熟血细胞不断被替换的过程的造血生长因子，它们可用于治疗原发性血液疾病，并可在严重感染的治疗和对经受化疗或骨髓移植的病人的处理中用作佐剂，具体包括生长因子，包括红细胞生成素(EPO)；干细胞生长因子(SCF)；白介素(IL-1-12)；单核细胞/巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,CSF-1)；P1XY321(GM-CSF/IL-3融合蛋白)；和血小板生成素；用于溶解病理性血栓和血管损伤部位的血纤蛋白沉积物的溶栓蛋白，包括链激酶；组织纤溶酶原激活物(t-PA)；和尿激酶；垂体前叶激素和调节它们的使用的下丘脑因子，包含(a)促生长激素，包括生长激素(GH)，促乳素(Prl)和胎盘催乳激素(PL)；(b)糖蛋白激素，包括促黄体素(LH)，促滤泡激素(FSH)和促甲状腺素(TSH)；和(c)POMC衍生激素，包括促肾上腺皮质素(ACTH)，α-促黑激素(α-MSH)，β-促黑激素(β-MSH)，β-促脂解素(β-LPH)和γ-促脂解素(γ-LPH)；调节所述激素释放的下丘脑因子，包括生长激素释放激素(GHRH)，促黄体素释放激素(LHRH)，胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-2)，促生长素抑制素和促性腺素释放激素(GnRH)；用作生长激素缺陷儿童的替代疗法的生长激素，包括促生长素抑制素，促生长素抑制素的合成类似物，奥曲肽；用于生殖疾病的诊断和不育症治疗的促性腺激素，包括LH,FSH和绒毛膜促性腺激素(GC)，包括尿促卵泡素，一种用于诱导排卵的基本上已除去了大多数LH的人绝经期促性腺激素(hMG)，和戈那瑞林，一种用于刺激促性腺激素分泌的合成人GnRH；合成GnRH兴奋剂，包括用于治疗对性类固醇减少敏感的内分泌紊乱的亮丙瑞林，组氨瑞林，那法瑞林和戈舍瑞林；
促甲状腺素(TSH)，其分泌受促甲状腺素释放激素(TRH)的控制，用于甲状腺机能减退患者的激素替代疗法和非中毒性甲状腺肿患者或对甲状腺癌进行了治疗后的患者的TSH抑制疗法；用于治疗胰岛素依赖性糖尿病患者和非胰岛素依赖性糖尿病患者的胰岛素；在葡萄糖和酮体代谢的调节中具有生理学作用的胰高血糖素，它可用于治疗严重低血糖，也可由放射学家用于抑制胃肠道；用于阻断分泌内分泌物的肿瘤中的激素释放的促生长素抑制素，及其合成类似物-奥曲肽，所述肿瘤包括胰岛瘤，胰高血糖素瘤，血管活性肠多肽肿瘤，类癌肿瘤和生长激素瘤；降钙素，一种特定作用于破骨细胞以抑制骨吸收的激素，它可用于处理高钙血和增加的骨骼重建疾病，包括佩吉特病；用于治疗脊柱性骨质疏松症患者的甲状旁腺素；阿地白介素，125-L-丝氨酸-2-133-白介素2，用作抗肿瘤剂和免疫刺激剂；阿糖苷酶，一种497个氨基酸的单体糖蛋白和人胎盘组织β-葡糖脑苷脂酶的修饰型，可用作葡糖脑苷脂酶的补充剂；丙赖促皮质肽，一种合成的促肾上腺皮质素类似物1-β-Ala-17[L-2,6-二氨基-N-(4-氨基丁基)己酰胺]-α1-17-促肾上腺皮质素；阿克伐司，一种527个氨基酸的丝氨酸蛋白酶，其序列与血管壁中内皮细胞产生的天然的蛋白酶的序列相同，可用作纤溶酶原激活物；阿韦舒托，一种通过基因工程使CD4的细胞外结构域的头178个氨基酸经两个接头残基与假单胞菌属外毒素A的氨基酸1-3和253-613相连而得到的合成嵌合蛋白，可用作抗病毒剂；amlintide，一种37个氨基酸的蛋白质，可用作抗糖尿病剂；阿莫胃泌素N-羧基-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-3-苯基-L-丙氨酸酰胺；anakinraN2L-Met-白介素1受体拮抗剂，可用作治疗炎性肠病的非甾族抗炎药和抑制剂；醋酸阿那立肽，心房肽激素-21(鼠)，N-L-Arg-8-L-Met-21a-L-Phe-21b-L-Arg-21c-L-Tyr-，醋酸盐，用作抗高血压剂和利尿剂；血管紧张素胺，血管紧张素Ⅱ，1-L-Asn-5-L-Val-，用作血管收缩药；抑肽酶，一种有58个氨基酸的胰腺胰蛋白酶抑制剂，用作酶抑制剂(蛋白酶)；阿法拉新，1-琥珀酰胺酸-5-L-Val-8-(L-2-苯基甘氨酸)血管紧张素Ⅱ，用作抗高血压药；鞣酸精氨加压素，加压素，8-L-Arg-，鞣酸盐，用作抗利尿剂；门冬托星，催产素，4-L-Asn-，用作抗生素，由浅灰链霉菌产生；阿托西班，催产素，1-(3-巯基丙酸)-2-(0-乙基-D-Tyr)-4-L-Thr-8-L-Orn-，用作一种催产素拮抗剂；阿伏帕星，一种从纯白链霉菌得到的糖肽类抗生素；basifungin,N-[(2R,3R)-2-羟基-3-MeVal]-N-L-MeVal-L-Phe-N-L-MePhe-L-Pro-L-别-Ile-N-L-MeVal-L-Leu-3-羟基-N-L-MeValα1-内酯，用作抗真菌剂；becaplermin，重组人血小板衍生生长因子B，一种在氨基酸组成和生物活性方面与内源性人PDGF-BB同型二聚体类似的由基因工程酿酒酵母产生的重组蛋白，用于通过促进间充质衍生细胞的增殖来治疗慢性皮肤溃疡；bivalirudin，一种具有20个氨基酸的抗凝剂，抗血栓形成剂；卡贝缩宫素，1-丁酸-2-[3-(对甲氧苯基)-L-Ala]催产素；卡古缩宫素，1-丁酸-6-(L-2-氨基丁酸)-7-甘氨酸催产素；蓝肽，5-O-L-Pro-L-Gln-L-α-Asp-L-O-硫代-L-Tyr-L-Thr-L-Gly-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-L-Phe-酰胺，用作胃液分泌刺激剂；cetermin，具有112个氨基酸的转化人生长因子β2；cilmostim,1-233-集落刺激因子1(人克隆p3ACSF-69蛋白部分)，环(7→90),(48→139),(102→146)-三(二硫化物)二聚体，用作生血剂(巨噬细胞集落刺激因子)；多粘菌素E甲磺酸钠，一种用作抗细菌剂的粘菌素A组分；可的瑞林，ovine triflutate，促肾上腺皮质素释放因子(绵羊)，三氟乙酸盐，用作肾上腺皮质缺乏和库欣综合征的诊断助剂，和用作一种促肾上腺皮质素释放激素；替可克肽，醋酸二十四肽促皮质素，α1-24-促肾上腺皮质素，用作促肾上腺皮质激素；环孢菌素，一种含有11个氨基酸和在6位上的3-羟基-4-甲基-2-(甲氨基)-6-辛烯酰部分的环蛋白，用作免疫抑制剂；dacliximab(Ro-24-7375)，一种由四个经二硫键连接的亚单位组成的、分子量约为150kD的人源化抗TAC单克隆抗体，用作免疫抑制剂；daclizumab；达托霉素，一种蛋白质抗细菌剂；地西卢定，包含63个氨基酸的来自医用水蛭的63-脱磺基水蛭素，用作抗凝剂；地洛瑞林，包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；醋酸去氨加压素，加压素，1-(3-巯基丙酸)-8-D-Arg-，一醋酸盐，三水合物，包含9个氨基酸，用作抗利尿剂；包含10个氨基酸的醋酸地肽利司，用作LHRH拮抗剂；度莫瑞林，27-L-Leu-44a-Gly生长激素释放因子(人)；依降钙素，1-丁酸-7-(L-2-氨基丁酸)-26-L-Asp-27-L-Val-29-L-Ala降钙素(鲑)；emoctakin，有两个Cys桥的包含72个氨基酸的白介素8(人)；依泊丁α，一种调节红细胞生成的165个氨基酸的糖蛋白，由已插入了人促红细胞生成素基因的中国仓鼠卵巢细胞产生，用作抗贫血和补血剂；厄索夫明，包含157个氨基酸的重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，是一种从人胎盘分离并在大肠杆菌中克隆和表达的非糖基化蛋白，用作伤口愈合剂；苯赖加压素是包含9个氨基酸的加压素，2-L-Phe-8-L-Lys，用作血管收缩药；非尔司亭，一种175个氨基酸的单链多肽，非糖基化的，由大肠杆菌表达，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂；高血糖素，一种29个氨基酸的单链蛋白质，用作抗糖尿病药；醋酸戈那瑞林，包含10个氨基酸的促黄体激素释放因子醋酸酯的二醋酸盐，用作性腺促进物质；戈舍瑞林，包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；组氨瑞林，包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；imiglucerase,495-L-组氨酸葡糖神经酰胺酶胎盘同工酶蛋白，用作葡糖脑苷脂酶的酶补充剂；胰岛素，去丙氨酸的，是一种通过除去胰岛素B链C-末端的丙氨酸而制得的胰岛素衍生物，用作抗糖尿病药；干扰素α-2a，包含165个氨基酸的干扰素αA(人白细胞蛋白质部分来源的)，用作抗肿瘤剂和生物应答调节剂；干扰素α-2b，包含165个氨基酸的干扰素α2b(人白细胞克隆Hif-SN206蛋白质部分来源的)，也用作抗肿瘤剂和生物应答调节剂；干扰素β-1a，一种从含有人干扰素β的人工改造基因的培养中国仓鼠卵巢细胞生产的、由166个氨基酸残基组成的糖基化多肽，也用作抗肿瘤剂和生物应答调节剂；干扰素β-1b，一种从大肠杆菌生产的、由165个氨基酸残基组成的非糖基化多肽，也用作免疫调节剂；干扰素γ-1b,1-139干扰素γ(人淋巴细胞蛋白质部分来源的)，N2-L-Met，用作抗肿瘤剂和免疫调节剂；iroplact，包含71个氨基酸残基、有两个Cys桥的N-甲硫氨酰血小板因子4(人亚单位)；lanoteplase，一种通过缺失纤连蛋白样和EGF样结构域并使Asn117突变为Gln117而从人t-PA衍生得到的组织纤溶酶原激活物蛋白，通过在哺乳动物宿主细胞中编码肽序列的DNA序列的表达而制得，用作纤溶酶原激活物和溶栓剂；包含8个氨基酸和一个二硫键的醋酸兰瑞肽，用作抗肿瘤剂；来诺拉提，一种通过表达来自于人口腔鳞状上皮细胞系-mRNA的人粒细胞集落刺激因子-cDNA而在中国仓鼠卵巢细胞中产生的、由174个氨基酸残基组成的糖蛋白，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂；醋酸黄体瑞林，一种包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；莫拉司亭，一种包含127个氨基酸的集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白质部分来源的)，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂；莫罗德明，一种表皮生长因子(鼠唾液腺)；醋酸那法瑞林，包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；nagrestipen，包含69个氨基酸、有两个二硫键的26-L-丙氨酸淋巴因子MiP 1α(人克隆pAT 464炎症巨噬细胞)；胃酶抑制剂，N-(3-甲基-1-氧丁基)-L-Val-L-Val-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酰-L-Ala-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，用作胃蛋白酶抑制剂；pramlintide，一种包含37个氨基酸和有一个二硫键的蛋白质，用作抗糖尿病药；人胰岛素原，包含86个氨基酸残基、有三个二硫键的胰岛素原(猪)，用作抗糖尿病药；沙莫司亭，集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白质部分)，23-L-Leu，一种从酿酒酵母表达的、127个氨基酸残基的单链糖基化多肽，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂；天然产生的和合成的、包括重组衍生的人和动物促生长素(生长激素)，尤其是牛和猪促生长素；牛瑞生长素，促生长素(牛来源的)，1-[N2-L-Met-L-α-Asp-L-谷氨酰胺]-，包含191个氨基酸，用作催乳剂，尤其是兽医应用；猪丙氨生长素，促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-丙氨酰-生长激素，总共包含191个氨基酸，用作激素(生长，猪)；人蛋氨生长素，促生长素(人)，N-L-Met-，包含具有两个二硫键的191个氨基酸，用作生长激素；促生长素，一种具有从人脑垂体前叶得到的主要生长刺激激素的正常结构的、包含191个氨基酸的单链多肽，用作生长激素；促生长素，可以以重组形式获得；牛亮氨生长素，促生长素(牛)，127-L-Leu-，牛垂体促生长素中的四个天然产生的分子变体之一，用作催乳剂；猪诺生长素，促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190个氨基酸，用作猪生长激素；牛蛋氨生长素，促生长素(牛)，1-L-Met-127-L-Leu-，包含191个氨基酸，用作兽医生长刺激剂；猪蛋氨生长素，促生长素(猪重组体)C979H1527N265O287S8；塞泊生长素，促生长素(猪重组体)C938H1465N257O278S6；牛度生长素，促生长素(牛重组体)C1020H1596N274O302S9；替普罗肽，缓激肽增效剂B，2-L-Trp-3-去-L-Leu-4-去-L-Pro-8-L-谷氨酰胺-，包含9个氨基酸，用作血管紧张肽转化酶抑制剂；特立帕肽，一种包含34个氨基酸的蛋白质，用作骨吸收抑制剂和骨质疏松症治疗佐剂；thymalfasin，包含28个氨基酸的胸腺素α1(牛)，用作抗肿瘤剂，用于治疗肝炎和传染病，以及用作疫苗增强剂；胸腺喷丁，一种用作免疫调节剂的五肽；曲普瑞林，促黄体激素释放因子(猪)，6-D-Trp，包含10个氨基酸，用作抗肿瘤剂；包含具有一个二硫键的8个氨基酸的伐普肽，用作抗肿瘤剂；包含具有一个二硫键的9个氨基酸的、8-L-Arg-或8-L-Lys-型加压素，用作抗利尿激素；肌红蛋白；血红蛋白；β-乳球蛋白；免疫球蛋白-G(IgG)；抗血友病因子(因子Ⅷ)；溶菌酶；遍在蛋白；血小板活化因子(PAF)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；肿瘤坏死因子-β(TNF-β)；巨噬细胞炎性蛋白(MIP)；肝素；嗜伊红性粒细胞阳离子蛋白(ECP)；重组因子Ⅸ；非何杰金氏B细胞淋巴瘤的单克隆抗体；干扰素α，用于治疗丙型肝炎；和用于治疗创伤和烧伤的成纤维细胞衍生的人造皮肤。
能有效推动本发明方法的缩合反应实质完成的条件包括能使存在的水从液相变为气相或固相由此从所述缩合反应的环境中除去水的那些。为了使本发明的方法获得成功，所述条件还必须具有可量测性的特征，即，容易且有效地适应大规模工业生产的能力，还必须有再现性，即，最终结果没有实质偏差地连续进行生产的能力。因此，所述条件是使必需输入该方法中的能量优化以最有效地将发生缩合反应的含水环境中的水(包括所述缩合反应本身产生的水)和起始反应物以及缩合加合终产物分离开的那些。
在0℃以上的温度下，优化输入到该方法中的能量的条件包括(a)按照保持蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法(包括所述缩合反应)的要求，将在所述含水环境中的所述反应混合物加热至最高温度；(b)按照保持蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法(包括所述缩合反应)的要求，将在所述含水环境中的所述反应混合物细分成最小液滴；和(c)给由此形成的所述液滴提供关于它们所从中通过的惰性气体的最高比速，这应符合保持蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法(包括所述缩合反应)的要求。
另外，将反应混合物加热至温度为25℃-125℃，优选为40℃-120℃，更优选为50℃-115℃，仍更优选为60℃-110℃，首选为75℃-105℃，同时通过在需要时应用抬高的压力而使该含水环境保持为液相。但是，鉴于反应物中有一种是蛋白质，因此通常更有利的是利用较低的、即降低的压力。降低的压力容许本质上相同量的能量输入该系统中，同时使该系统中保持较低的温度，从而使反应混合物从液体变为气相。因此，应当理解，必须作出关于反应混合物允许经受的任何高温的警告。在多数情况下，上面所提到的温度的最高值可以仅仅维持非常短暂的时间，通常是几秒钟左右。当反应物或终产物的熔点低至足以对它们的加工造成问题的时候，可选地借助于减压使反应混合物维持较低的温度证明是有益的，甚至是必需的。
另外，将在所述含水环境中的反应混合物分成平均直径为1.0μm-5.0mm的液滴，优选为10μm-1.0mm，更优选为100μm-900μm，仍更优选为200μm-800μm，首选为300μm-700μm。
所述液滴经受的比速为0.1m/秒-5.0m/秒，优选为0.2m/秒-4.0m/秒，更优选为0.3m/秒-3.0m/秒，仍更优选为0.4m/秒-2.0m/秒，首选为0.5m/秒-1.0m/秒。
在0℃及0℃以下的温度下，所述优化输入该方法的能量的条件包括(a)将在所述含水环境中的所述反应混合物冷却至温度低到足以使所述含水环境中存在的所有非结合液态水实质冻结的程度，所述温度符合保持蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法(包括所述缩合反应)的要求；(b)使所述由此冷却后的在所述冻结的含水环境中的反应混合物在通入惰性气体的条件下经受降低的压力，这应符合保持蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法(包括所述缩合反应)的要求。
另外，将反应混合物冷却至温度为-110℃至0℃，优选为-45℃至-5℃，更优选为-40℃至-10℃，仍更优选为-35℃至-15℃，首选为-30℃至-20℃，同时保持该含水环境为固相。
在所述含水环境中的所述冷却的反应混合物经受的降低的压力为5.0mmHg绝对压力-0.0001mmHg绝对压力，优选为1.0mmHg绝对压力-0.0005mmHg绝对压力，更优选为0.5mmHg绝对压力-0.001mmHg绝对压力，仍更优选为0.2mmHg绝对压力-0.005mmHg绝对压力，首选为0.1mmHg绝对压力-0.01mmHg绝对压力。
本发明的缩合反应过程也可以在减少水分的条件下进行，由此加快水分的去除速率和提高所去除的总量。这与通过去除已存在或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水来推动该缩合反应完成的目标是一致的，以确保转化成所述缩合加合终产物的速率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。与该目标一致，该缩合加合终产物中存在的水分的量将相当于3.0％-0.001％重量，以终产物的重量计，优选为2.0％-3.0％重量，以所述终产物的重量计。进一步达到的是，在缩合反应完成之后，所存在的水分的量可能降低至0.1％-0.001％重量，或0.05％-0.005％重量，甚至低至0.03％-0.01％重量，以终产物的重量计。当蛋白质的稳定性需要时，也可以存在实质上更高含量的水分，该含量在3.0％-20.0％重量范围内，优选为5.0％-15.0％重量，更优选为8.0％-12.0％重量，以终产物的重量计。
上述制备方法(包括缩合反应方法)可以在减少水分的条件下进行，由此加快水的去除速率和提高所去除的总量。这一方法与通过去除已存在或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水来推动该缩合反应完成的目标是一致的。但是，该缩合加合终产物中存在的水分的量必须符合保持所述终产物完整性的要求。因此，该加合终产物中水分的含量最好是在3.0％-20.0％重量的范围内，优选为4.0％-15.0％重量，更优选为5.0％-10.0％重量，以终产物的重量计。例如，当产物为羊促生长素时，该终产物中存在的水分的量为6.0％-9.0％重量。
将上述条件应用于本发明的制备方法将有效地去除所述缩合反应过程中存在的约97.0％-99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水，同时符合保持缩合反应物和加合终产物完整性的要求，且所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
另外，起始反应物也可以作为水溶液就在缩合加合终产物以液滴形式分散之前或实质上与其同时而彼此完全接触。这种水溶液形式的完全混合是通过机械作用实现的，该机械作用足以使所述起始反应物彼此接触，同时又不会使所述缩合加合物的蛋白质组分机械降解。有一些关于选择具有温和作用的机械混合设备以避免溶液中产生显著水平的剪切应力的准则。例如，熟练技术人员可以选择带有搅拌棒、搅拌桨或其它类型搅拌器的固定式混合容器；带有搅拌工具的料槽形式的连续混合装置，它包含一个与整个料槽的摇摆联合运转的缓慢移动的螺杆或挡板；套管式装置，其中反应混合物装在中心管中，两个管子之间的环隙中是逆向流动的加热介质，通过在中心管中一个带有叶片的旋转轴进行搅拌；带有用于加热的排管的搅拌反应容器，其中的下降管中安装有叶轮，通过强制循环提高向反应混合物的热传递；浓缩反应混合物的混合设备；以及带有一个保持在低压下的搅拌反应室的真空反应器。
上面所提及的水溶液形式的完全混合也可以通过反乳剂的转化实现，其中所述起始反应物已作为连续相(即所述反乳剂的溶剂相)和分散相(即所述反乳剂的水相)中的溶质而彼此分离。所述反乳剂的转化是通过使所述反乳剂迅速分布到一个含水系统中而实现的，该含水系统与分散相是相同的。然后，如下文中进一步描述的那样，利用上述任何一种混合方法得到的缩合加合终产物可以在环境条件下以液滴形式分散。
起始反应物也可以以液滴形式彼此完全接触，即，所述缩合加合终产物的形成就在所述终产物以液滴形式分散之前或实质上与其同时发生。所述起始反应物以液滴形式完全混合是通过直接单独喷洒每种所述起始反应物形式的机械作用实现的，以这种方式，所述液滴彼此最大程度地混合、碰撞和接触。用于该方法的喷洒器械可包括足以传递所需能量的机械或液压泵装置，所述能量是将含有所述起始反应物的水流分成要去除已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水所需要的尺寸大小的液滴所必需的，同时符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并且也是确保转化为所述缩合加合终产物的转化率所必需的，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。所述泵装置可以与一个喷嘴装置联合使用，由此将机械剪切力施加于所述起始反应物的所述水流，结果所述水流被接连分成更小的液滴，直到液滴达到所需大小为止。
也可以使用包含气流发生器和用于分散其中的所述起始反应物的所述水流以使其成为具有所需液滴大小的液滴的装置的喷洒器械。所述气体实质上对于所述起始反应物和所述缩合加合终产物来说是惰性的，其中包括空气、氮气或氦气，它们已被压缩至一定压力，该压力足够高，以得到具有夹带所述起始反应物的所述液滴和确保其最大程度地混合、接触和碰撞所需的体积和速度的气流，所述液滴的夹带及其最大程度的混合、接触与碰撞足以去除已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水，同时也符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并且足以确保转化为所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
用于本发明方法的喷洒器械包括上述气流发生器和有关的分散装置与上面所述的液压泵装置和有关的喷嘴装置的任何适当的组合。
按照本发明，所述起始反应物以液滴形式完全混合也可以通过一个快速旋转的圆盘形式的机械作用实现，包含所述每一种起始反应物的水流指向该圆盘表面的上方。可以对每种起始反应物使用一个单独的圆盘，或者使用一个已制成能适应所述两种起始反应物水流的单个圆盘。所述每种水流以从所述圆盘的边缘以液滴形式推进的方式通过所述圆盘。所述旋转圆盘的速率可以变化，以传递足够的能量将所述每种水流分成具有能使所述液滴最大程度地混合、碰撞和接触的大小和速率的液滴。所述起始反应物的混合实质上发生在关于温度、湿度和压力进行调节的环境条件下，以去除已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水，同时也符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并且能确保转化为所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
本发明的范围内包括在实质上的室温条件下进行上述制备方法。但是，在本发明的优选实施方案中，对所述实质上的环境条件进行了重要的修改，以提高水从所述缩合反应和所得加合终产物中去除的速率和总量。具体地讲，所述修改包括在本文中提供的所述制备方法的一些或全部过程中加热所述起始反应物的水流和对这些起始物水流进行加工的器械装置。因此，反应的速率和向缩合加合终产物转化的量实质上提高了。
也可以通过在与所述制备方法有关的器械或原料的不同部分施加电场来修改制备方法，由此使得所涉及的所述起始反应物液滴的混合、碰撞和接触增加到最大程度，并使所述缩合加合终产物的收率实质提高。
有一些器械装置和加工步骤可以置于实质降低的压力条件下，特别是那些与所述起始反应物的反应有关的装置和步骤，从而使反应物实现最大程度的混合、接触和碰撞，由此足以去除已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水，同时也符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并且足以确保转化为所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
可以利用流化床装置来提高水从缩合加合终产物液滴中去除的速率和程度，以及提高所述缩合加合终产物液滴的收率，使其等于或高于约98.5％重量，以所述起始反应物的重量计。
本发明还涉及新的由本发明的上述制备方法生产的物质的组合物，它包含席夫碱缩合加合物，该加合物的组分包括蛋白质和芳族邻羟基醛，其中所述组分已在一定条件下形成一个反应混合物并得到了缩合加合终产物，所述条件能使有效地去除已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水，同时也符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并且能确保转化为所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。本发明还提供了所述液滴形式的物质的组合物，该液滴的平均直径在约0.1μm-约10.0μm的范围内，优选为约1.0μm-约5.0μm，更优选为约2.0μm-约4.0μm，首选为约2.5μm-约3.5μm。
本发明物质的新组合物包括其中其所述蛋白质组分可以对动物给药并在给药后被吸收、有利地利用、代谢和清除(即从所述动物体内消除)的那些。所述蛋白质组分可能在其与芳族邻羟基醛反应形成本发明的改良席夫碱缩合加合物之前就具有这类特性；然而，这种缩合加合物的形成将显著增强这类性能和特性，并由此提供一种合适的蛋白质候选物，如果没有经过这种增强作用的话，它本来可能会是不适宜的。
所述蛋白质组分具有在其给药的特定动物体内产生有益效用的能力，该特定动物是用其进行治疗的最普通的一员。所述蛋白质组分包括具有对动物或对动物的使用有益的其它生物活性的蛋白质，包括蛋白质激素，诸如用于调节动物(通常是用作食品生产原料的家养牲畜)生长的促生长素，对这类动物给药的促生长素具有增加饲料的利用效率和减少这类原料动物进入市场所需的时间的有益效用。还包括使用本发明的方法改进的蛋白质，改进的方面是它们长期储藏的稳定性以及增加的对动物以胃肠外固体植入物这种方式给药的机会。进一步还包括公认的具有作为动物和人的治疗剂功效的蛋白质，以及可以与本发明的方法一起使用的蛋白质。
发明详述本发明涉及一种制备包含邻羟基醛和蛋白质的席夫碱缩合加合物的方法，该方法体现了对本领域中此前已知的用于生产这种类型的加合产物的制备方法的显著改善。不仅体现在本发明的制备方法能更容易地重复、更有效、收率高并具有转置能力(即对按比例扩大生产的适应能力)，而且该方法的缩合加合终产物还体现了对使用过去的制备方法生产的产品的显著而令人惊奇的改善。本发明的缩合加合终产物直接产生于本发明的改善的缩合方法，该方法本身具有令人惊奇地更好的重复性、效率、高收率和转置能力(即对按比例扩大生产的适应能力)。
如文中所示，本发明涉及对在科技文献中描述的席夫碱缩合方法的显著改善。这类方法的代表是Clark等在US 5198422中提及的，其中制备的是包含生长激素尤其是猪促生长素pST和芳香醛的稳定复合物，最终的复合物产品作为结晶产物从水溶液中分离得到，据称该结晶产物能使所述生长激素长时间释放。
在Clark等的方法中将最终的复合物产品从水溶液中分离出来的特定操作涉及通过蒸发一段实质长的时间而除去含水溶剂，之后通过将其从进行反应的容器器壁上刮除下来而回收得到该产物。Clark等的方法难以控制，经常导致产物降解，并且事实上不可能按比例地进行扩大生产。产物降解的强烈可能性是将反应混合物(含有尤其是作为缩合加合终产物组分的经常会降解的蛋白质以及起始反应物的浓水溶液)长时间保持在抬高的温度下的直接结果。与之相比，本发明的制备方法，尤其是涉及喷雾干燥和冷冻干燥的实施方式，将起始反应物和缩合加合终产物在水溶液中的停留时间缩短到了最小程度。Clark等提到了通过冷冻干燥(即冻干)去除含水溶剂，但他们的意思似乎是决不试图采用该方法。因此，技术人员不可能对这种工艺操作有任何合理的预期。Clark等没有提示使用邻羟基醛和维持pH在7.0或以上在本发明方法中的临界性。即使技术人员执行了Clark等的这种冻干操作，正如刚刚描述的蒸发过程那样，它也将是一个以长时间干燥为特征的过程，会直接导致上述与重复性、产品质量和扩大生产能力有关的加工问题。
然而，Clark等的工作得到了在那之前在长期储藏稳定性和产品总体纯度方面次最佳的改良产物，严重限制了它们在动物治疗中的有用性。当该产物是固体植入物颗粒或是用于通过滴注或插入要进行治疗的动物的皮肤下或肌肉组织内而进行胃肠外给药的有关形式时，这具有特别不利的影响。尽管Clark等的方法能在产品稳定性方面取得一些改善，但显然没有可行的方式来将这样一种方法按比例扩大到能有效而又经济地进行适宜的大规模工业生产的水平，因为要使含水溶剂完全蒸发，需要消耗大量的能量和花费很长的时间。
因此，在本领域中仍然存在克服目前用于制备这类席夫碱缩合加合产物的方法的现有缺点的需要，以及克服用早期的基本不令人满意的方法生产的不稳定的加合产物的缺点的需要。正是从满足了本领域中的这些需要这个意义上来说，本发明的方法应当受到关注。
在克服科技文献中提及的方法和产品的缺点方面，可以发现本发明的要点在于可以利用非常容易、可重复和可转置(即，能有效地适应于以实质更大的规模进行)的方法去除含水溶剂，例如喷雾干燥方法，并因此使该方法适于按比例地扩大进行，从而以有效而又经济的工业水平进行生产。本发明制备方法的席夫碱缩合加合终产物的必需的非蛋白质组分是芳族邻羟基醛，下文中进一步详细描述了它们的类型。
席夫碱缩合加合产物最初在本领域中的应用是为了克服与产物在相关碱性蛋白中的稳定性有关的问题。所述问题的产生是蛋白质产物逐渐变性导致蛋白质的三级结构(即，构型)被破坏的直接结果，甚至所述蛋白质的二级和一级结构的某些方面也会有一些变性，导致该蛋白质的物理性能发生改变，所述蛋白质具有的生物活性显著丧失。这种蛋白质和羰基化合物的席夫碱缀合物已在本领域中用于试图得到更稳定的蛋白质产物，例如上面所提及的Clark等的努力，据称已得到了能长时间释放形式的促生长素。导致席夫碱加合物形成的基础缩合反应是一个平衡反应，它可以用以下图解等式表示 席夫碱缩合反应是一个平衡反应，并且在上述等式中不会明显向右移动，这些事实预示了即使用Clark等的方法也未能避免的问题，即，大量的有关蛋白质不是加合物的形式，因此因变性导致了它们结构的破坏，结果使得生物活性(在这种情况下是生长促进活性)丧失。
席夫碱缩合反应的另一个方面是已对反应的进行造成了一个碱性障碍物，尤其是由于那个方法已由Clark等人进行。这个问题涉及醛组分(包括芳族邻羟基醛)在长时间的干燥加工过程中的升华到了实质性程度。这种升华的程度可能达到了反应混合物最初的总醛含量的三分之一或更多。这种起始反应物的明显损失不仅导致终产物的收率不可避免地降低，而且也导致了其它一些问题，这些问题中许多是由未反应的蛋白质起始反应物造成的。未反应的蛋白质在干燥加工过程中因变性而受到降解，所得副产物进一步增加了操作的复杂化，例如，它们沉淀并粘着在本文中别处所描述的加工装置的热交换表面。与这些结果相反，本发明的方法导致了非常高的收率，几乎完全消除了醛组分升华的问题。
尽管除去如上述等式右侧所示通过缩合形成的水，根据质量作用定律将在理论上推动该反应的完成，但除去缩合的水却成了个大问题，因为该反应是在水溶液中发生的。有效地除去缩合的水意味着除去该反应的含水环境中存在的所有水。本领域现在已开始意识到了席夫碱缩合加合物形成的这种固有的问题，但是在本发明提供解决这个问题的方法之前，科技文献中还没有就其解决提出任何建议。
本发明的第一个方面是本发明取得成功的一个必需要素，即是使用芳族邻羟基醛作为反应形成席夫碱缩合加合物的两个关键组分之一。用于本发明的缩合方法的芳族邻羟基醛优选包含一个或多个下式化合物 其中R1和R4独立地选自氢；羟基；卤素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)环烷基；(C2-C6)链烯基；-C(=O)OR7；-OC(=O)R7；-S(=O)2；-S(=O)2R7；-S(=O)2OR7；-C(=O)NR7R9；-C(=O)R9；-S(=O)2N(R7)(R9)和-N(R7)(R9)，其中R7是氢或(C1-C4)烷基，R9是(C1-C4)烷基；其中
定义R1和R4的所述烷基、环烷基和链烯基可选地被选自以下成员的一个或两个取代基独立地取代卤素；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺酰基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；和X和Y独立地分别是N,O,S,CHR2或CHR3，条件是X和Y不可以同时都选自O和S；其中R2和R3独立地选自氢；羟基；卤素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)环烷基；(C2-C6)链烯基；-C(=O)OR11；-OC(=O)R11；-S(=O)2；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11是氢或(C1-C4)烷基，R13是(C1-C4)烷基；并且其中定义R2和R3的所述烷基、环烷基和链烯基可选地被选自以下成员的一个或两个取代基独立地取代卤素；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺酰基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
按照本发明的一个优选方面，R1和R4独立地选自氢；羟基；三氟甲基；(C1-C4)烷基；(C1-C4)烷氧基；-C(=O)OR7和-N(R7)(R9)，其中R7是氢或(C1-C2)烷基，R9是(C1-C2)。
在本发明更优选的实施方案中，R1和R4独立地选自氢；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；羧基或甲氨基。在这个特定实施方案中，R7为氢而R9为甲基。同样优选的是，当R1和R4定义为烷基并被取代时，仅有选自以下成员的一个取代基羟基；(C1-C2)烷氧基；羧基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。甚至更优选的是，所述单个取代基选自羟基、甲氧基和二甲氨基。
另外，在本发明的优选方面，X和Y独立地选自N,CHR2或CHR3；在本发明的更优选方面，X或Y之一为N而另一个分别为CHR2或CHR3。在本发明中仍更优选的是，X为CHR2而Y为CHR3，其中R2和R3优选独立地选自氢；羟基；卤素；三氟甲基；(C1-C4)烷基；(C1-C4)烷氧基；-C(=O)OR11；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11优选为氢或(C1-C2)烷基，R13为(C1-C2)烷基。在本发明中甚至更优选的是，R2和R3独立地选自氢；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；羧基；和甲氨基。在后一种情况下，R11为氢，R13为甲基。
本发明中优选的是，当R2和R3定义为烷基并被取代时，仅有选自以下成员的一个取代基羟基；(C1-C2)烷氧基；羧基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
为了进一步说明涉及尤其适用于此的特定芳族邻羟基醛的本发明的这个方面，接下来给出一张表，表中列出了这类优选醛的各个基团
在上面列举的适合并优选用于本发明制备方法及其产品的芳族邻羟基醛物质中，根据它们在所述方法中的可用性、成本、有效性和简易性及效率，并根据它们生产在随时间的稳定性和保持最初的生物活性水平方面具有最佳预期特性的改良产品的能力，有几种是最为优选的。所述最优选的种类包括水杨醛；2,3-二羟基苯甲醛；2,6-二羟基苯甲醛；邻香草醛；和吡哆醛；它们可以用下列结构式表示 邻香草醛水杨醛2,3-二羟基苯甲醛 2,6-二羟基苯甲醛吡哆醛2-羟基-3-乙氧基苯甲醛上面已描述了作为本发明成功必需要素的本发明的第一个方面，即，使用芳族邻羟基醛作为反应形成改良的席夫碱缩合加合物的两个关键组分之一。因此，下面将详细描述第二个组分-蛋白质，按照本发明制备方法的过程，它与所述芳族邻羟基醛反应形成本发明的改良的席夫碱缩合加合终产物。
用作本发明的改良席夫碱缩合加合物的第二个组分的蛋白质必须符合几个要求才能判定它适合这种应用。首先，对蛋白质的定义没有严格的限制，可以仅仅基于其大小而不是别的什么。蛋白质的分子量或质量用道尔顿或千道尔顿(kDs)表示，并且它可以包含少至两个氨基酸，多至数百个甚至千个以上的氨基酸。一种典型的蛋白质质量为30,000道尔顿。不过，重要的是，候选蛋白质应能对动物给药并在给药后被吸收、有益地利用、代谢和清除(即，从所述动物体内消除)。最好是所述蛋白质候选物在与芳族邻羟基醛反应形成本发明的改良席夫碱缩合加合物之前就具有这样的特性；然而，这种缩合加合物的形成将显著增强这类性能和特性，并由此使其成为一种适宜的蛋白质候选物，若没有这种增强作用的话，本来它可能是不合适的。
适用于形成本发明的席夫碱缩合加合物的蛋白质候选物的另一个主要特性是，它能对用其给药的特定动物产生有益的效用。这种有益效用是最普通的一种治疗效用，无论是对动物还是对人给药。本文中所用的术语“动物”是指动物王国及其主要组成部分中的所有成员，它们满足本发明提出的关于具有与其给药有关的有益效用的蛋白质的其它要求。本文中所用的“有益效用”通常是指对特定动物的有益活性，以及因此给人带来的在动物饲养业中的经济报酬。不过，这种表述的含义也可延伸至对特定动物不利或有害、但相反可能给人带来经济利益的活性。这类活性将包括各种杀虫活性，例如，抑制破坏重要经济农作物的或伤害对人有价值的家养动物的害虫的生长和繁殖或完全将其消灭。因此，具有经济重要性的所有主要门及其亚门下的动物都包括在本发明范围内，例如，节肢动物门的脊椎动物，包括昆虫类(昆虫纲)、蜘蛛和螨类(蛛形纲)以及甲壳动物(甲壳纲)；或脊椎动物亚门的脊椎动物，包括哺乳动物类(哺乳纲)、鸟爬行动物类(爬行纲)、两栖动物(两栖纲)和鱼；以及软体动物门的无脊椎动物，包括蛤和蜗牛；或环节动物门的无脊椎动物，包括蚯蚓和水蛭；或棘皮动物门的无脊椎动物，包括海星和海胆；或线虫纲的无脊椎动物，包括犬恶丝虫。
适用于本发明的蛋白质还可以具有对动物或对动物的使用有益的其它生物活性，这些活性通常可能不在性质上归类为治疗活性。例如，蛋白质激素如促生长素用于调节动物(通常是用作食品生产原料的家养牲畜)的生长，并且对这类动物给药的促生长素具有增加饲料的利用效率和减少这类原料动物进入市场所需的时间的有益效用。这种蛋白质激素的使用具有清楚而明确的并不与其治疗直接相关的商业和经济利益。
属于蛋白质并且目前已在商业上开发应用的身体功能的其它激素和调节剂也可以借助于本发明的方法进行改善。这种改善是提高它们的加合缩合水平，以及提高它们的收率，从而增加了它们以胃肠外固体植入物这种方式对动物给药的机会。
不过，可以与本发明的方法一起使用的绝大多数蛋白质是公认的具有作为动物和人的治疗剂功效的那些。这些蛋白质已得到应用或已被积极地开发用于各种各样的治疗用途。以下段落中的描述不仅将使我们清楚地看到有大量这类蛋白质，而且会看到当所有这些蛋白质用本发明的方法制备成改良的席夫碱缩合加合物时，因改善的长期稳定性和生物活性的保存而带来的益处。当蛋白质制备成颗粒或类似于将用作用于缓释给药的植入储存体形式时，这一点尤其真实。
有一大组蛋白质内源性的和合成的阿片样止痛剂和拮抗剂，它们已被有机地分成不同的三类，分别叫做脑啡肽、内啡肽和强啡肽。这些蛋白质是μ、κ和δ阿片样物质受体亚型的选择性和非选择性兴奋剂和拮抗剂，具有主要作为止痛剂的治疗效用。具体的蛋白质包括[Leu5]和[Met5]脑啡肽；强啡肽A和B；α-和β-新内啡肽；[D-Ala2,MePhe4,-Gly(ol)5]脑啡肽(DAMGO)；[D-Pen2,D-Pen5]脑啡肽(DPDPE)；[D-Ser2,Leu5]脑啡肽-Thr6(DSLET)；[D-Ala2,D-Leu5]脑啡肽(DADL)；D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP)；[D-Ala2,N-MePhe4,Met(O)5-ol]脑啡肽(FK-33824)；Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2]δ啡肽Ⅰ；Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2,Glu4]δ啡肽Ⅱ；Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2(morphiceptin)；Tyr-Pro-MePhe-D-Pro-NH2(PL-017)；和[D-Ala2,Leu5,Cys6]脑啡肽。
有一组归类为内分泌物的蛋白质，包括缓激肽和胰激肽，它们是为响应炎症事件诸如组织损害、病毒感染和变态反应而由一系列蛋白水解反应产生的。这些蛋白质局部见效并导致疼痛、血管舒张、血管通透性增加和前列腺素合成。具有兴奋剂和拮抗剂活性的这些蛋白质及它们的类似衍生物是潜在的治疗剂，可用于治疗男性不育，用于癌症化疗剂越过血脑屏障释放，和用于治疗疼痛、哮喘和其它慢性炎症疾病。具体的这类蛋白质包括Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(缓激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脱-Arg9-缓激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脱-Arg10-胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu(脱-Arg9-[Leu8]-缓激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-[D-Phe]-Phe-Arg([D-Phe7]-缓激肽)；和[D-Arg]-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg(HOE140)，其中Hyp是反式-4-羟基-Pro；Thi是β-(2-噻吩基)-Ala；Tic是[D]-1,2,3,4-四氢喹啉-3-基-羰基；Oic是(3as,7as)-八氢吲哚-2-基-羰基。
加压素和影响水的肾保存和对分别介导加压应答和抗利尿应答的加压素受体亚型V1和V2具有选择性的这类蛋白质类似物的产生的相关试剂对体液同渗重摩的调节已导致了大量具有不同活性的治疗剂。例如V1拮抗剂可能在充血性心力衰竭、高血压和手术后肠梗阻和腹部膨胀的治疗中是有益的。V2兴奋剂可用于通过控制多尿和烦渴来治疗中枢性尿崩症，和治疗出血性疾病如威勒布兰特病。具体的天然产生的加压素样肽包括下式表示的精氨酸加压素(AVP) 和赖氨加压素([Lys8]-AVP；合成加压素肽V1a-选择性兴奋剂[Phe2,Ile2,Orn8]AVP；V1b-选择性兴奋剂脱氨基[D-3-(3’-吡啶基)-Ala2]AVP；V2-选择性兴奋剂去氨加压素(dDAVP)和脱氨基[Val4,D-Arg8]AVP；以及肽拮抗剂，诸如下式表示的V1a-选择性拮抗剂d(CH2)5[Tyr(Me)2]AVP 和V1b-选择性拮抗剂dp[Tyr(Me)2]AVP；以及V2-选择性拮抗剂脱Gly-NH29-d(CH2)5[D-Ile2,Ile4]AVP，和d(CH2)5[D-Ile2,Ile4,Ala-NH29]AVP。
五肽胃泌素是一种用作胃液分泌指示剂的蛋白质诊断助剂，其具有下列化学式N-叔丁氧羰基-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2。
奥曲肽是一种促生长素抑制素的合成类似物，它可用于治疗胃肠道肿瘤的症状、其它疗法难以治疗的腹泻、各种能动性障碍和胃肠出血。奥曲肽可以作为醋酸盐和双羟萘酸盐获得，它具有下列结构L-半胱氨酸酰胺-D-Phe-L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-N-[2-羟基-1-(羟甲基)丙基]-，环(2→7)二硫化物，[R-(R*,R*)]-。
许多用作免疫抑制剂的抗体试剂已批准用于临床。先进的杂交瘤技术允许从连续培养的细胞大量生产这类抗体，从而产生高纯度和特异性的抗体制剂，这些制剂可用作标准化药物试剂。这类抗体试剂包括抗胸腺细胞球蛋白；鼠单克隆抗体-CD3单克隆抗体；和Rh0(D)免疫球蛋白。已开发用于治疗免疫缺损状态的蛋白质免疫刺激剂包括免疫球蛋白。
细胞因子是一组由白细胞和相关细胞产生并具有各种免疫调节作用的多样蛋白。目前公认的主要细胞因子由干扰素，集落刺激因子和白介素组成。这些种类的细胞因子的具体实例包括α-干扰素；干扰素-γ(IFN-γ)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；和白介素-1(IL-1)至白介素-12(IL-12)。
造血生长因子是一组与调节成熟血细胞不断被替换的过程有关的激素样糖蛋白。这些蛋白质的临床应用包括治疗原发性血液疾病和在严重感染的治疗以及对经受化疗或骨髓移植的病人的处理中用作佐剂。这类生长因子的具体实例包括红细胞生成素(EPO)；干细胞生长因子(SCF)；白介素(IL-1-12)；单核细胞/巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,CSF-1)；P1XY321(GM-CSF/IL-3融合蛋白)；和血小板生成素。
溶栓药物可用于溶解病理性血栓和血管损伤部位的血纤蛋白沉积物，它们包括象链激酶；组织纤溶酶原激活物(t-PA)；和尿激酶这样的蛋白质。
垂体前叶激素和调节它们的使用的下丘脑因子是具有治疗用途的蛋白质。垂体前叶激素可分成三类(a)促生长激素，包括生长激素(GH)，催乳素(Pr1)和胎盘催乳激素(PL)；(b)糖蛋白激素，包括促黄体素(LH)，促滤泡激素(FSH)和促甲状腺素(TSH)；和(c)POMC衍生激素，包括促肾上腺皮质素(ACTH)，α-促黑激素(α-MSH)，β-促黑激素(β-MSH)，β-促脂解素(β-LPH)和γ-促脂解素(γ-LPH)。调节所述激素释放的下丘脑因子包括生长激素释放激素(GHRH)，促黄体素释放激素(LHRH)，胰岛素样生长因子(IGF-1和IFG-2)，促生长素抑制素和促性腺素释放激素(GnRH)。
生长激素在生长激素缺陷的儿童中用作替代疗法。促生长素抑制素是一种抑制生长激素释放的下丘脑物质，但它只有很短的半寿期。已在上面描述过的其合成类似物-奥曲肽，可用于治疗因生长激素过度分泌而导致的肢端肥大症。促性腺激素包括LH,FSH和绒毛膜促性腺激素(GC)，它们可用于诊断。CG可用于检测是否怀孕，而LH和FSH可用于诊断几种生殖疾病。这些蛋白质促性腺激素也在医疗上用于治疗不育(孕)症。例如，尿促卵泡素是一种人绝经期促性腺素(hMG)或已除去了大多数LH而得到的尿促性素制剂，因此是主要的FSH。尿促卵泡素可用于诱导排卵。戈那瑞林是一种用于治疗性地刺激促性腺激素分泌的合成人GnRH制剂。另一方面，合成GnRH兴奋剂，例如亮丙瑞林，组氨瑞林，那法瑞林和戈舍瑞林，可用于治疗各种对性类固醇减少敏感的内分泌疾病。
甲状腺功能是由促甲状腺素(TSH)调节的，这是一种糖蛋白，其分泌受促甲状腺素释放激素(TRH)的控制。TSH的治疗应用是用于甲状腺机能减退患者的激素替代疗法和非毒性甲状腺肿患者或对甲状腺癌进行了治疗后的患者的TSH抑制疗法。
蛋白质胰岛素是用于治疗事实上所有胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)患者和许多非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)患者的支柱性药物。也可以使用能从皮下部位更迅速吸收的胰岛素的合成类似物。而且，还设计了可持续数天或数周缓慢释放胰岛素的可植入颗粒。胰高血糖素是一种在葡萄糖和酮体代谢的调节中具有显著生理学作用的蛋白质，它可用于治疗严重低血糖，也可由放射学家使用其对胃肠道的抑制作用。已在前面提到过的促生长素抑制素是一种具有较短生物半寿期的激素，这种较短的半寿期限制其主要用于阻断分泌内分泌物的肿瘤(包括胰岛瘤，胰高血糖素瘤，血管活性肠多肽肿瘤，类癌肿瘤和生长激素瘤)中的激素释放。其合成类似物-奥曲肽是更长效的，因此更经常用于治疗用途。
降钙素(CT)是一种特定作用于破骨细胞以抑制骨吸收的激素，它可用于处理高钙血。CT在增加的骨骼重建疾病如佩吉特病中也是有效的。蛋白质甲状旁腺素(PTH)在脊柱性骨质疏松症患者的治疗中有潜在价值。
除了上述各类蛋白质治疗剂以外，以下列举的各种蛋白质组分也已批准用于人。
阿地白介素，125-L-丝氨酸-2-133-白介素2，用作抗肿瘤剂和免疫刺激剂。
阿糖苷酶是一种497个氨基酸的单体糖蛋白，是人胎盘组织β-葡糖脑苷脂酶的修饰型，可用作葡糖脑苷脂酶的补充剂。
丙赖促皮质肽是一种合成的促肾上腺皮质素类似物，1-β-Ala-17[L-2,6-二氨基-N-(4-氨基丁基)己酰胺]-α1-17-促肾上腺皮质素。
阿克伐司是一种527个氨基酸的丝氨酸蛋白酶，其序列与血管壁中内皮细胞产生的天然蛋白酶的序列相同，它用作纤溶酶原激活物。
阿韦舒托是利用基因工程使CD4的细胞外结构域的头178个氨基酸经两个接头残基与假单胞菌属外毒素A的氨基酸1-3和253-613相连而得到的一种合成嵌合蛋白，它用作抗病毒剂。
amlintide是一种37个氨基酸的蛋白质，用作抗糖尿病剂。
阿莫胃泌素是N-羧基-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-3-苯基-L-丙氨酸酰胺。
anakinra是N2-L-Met-白介素1受体拮抗剂，用作非类固醇抗炎药和用于治疗炎性肠病的抑制剂。
醋酸阿那立肽是心房肽激素-21(鼠)，N-L-Arg-8-L-Met-21a-L-Phe-21b-L-Arg-21c-L-Tyr-，醋酸盐，它用作抗高血压剂和利尿剂。
血管紧张素酰胺是血管紧张素Ⅱ，1-L-Asn-5-L-Val-，用作血管收缩药。
抑肽酶是一种有58个氨基酸的胰腺胰蛋白酶抑制剂，用作酶抑制剂(蛋白酶)。
阿法拉新是1-琥珀酰胺酸-5-L-Val-8-(L-2-苯基甘氨酸)血管紧张素Ⅱ，用作抗高血压药。
鞣酸精氨加压素是加压素，8-L-Arg-，鞣酸盐，用作抗利尿剂。
门冬托星是一种由浅灰链霉菌生产的抗生素，它是催产素，4-L-Asn-。
阿托西班是催产素，1-(3-巯基丙酸)-2-(0-乙基-D-Tyr)-4-L-Thr-8-L-Orn-，用作催产素拮抗剂。
阿伏帕星是从纯白链霉菌得到的一种糖肽类抗生素。
basifungin是一种抗真菌剂，结构为N-[(2R,3R)-2-羟基-3-MeVal]-N-L-MeVal-L-Phe-N-L-MePhe-L-Pro-L-别-Ile-N-L-MeVal-L-Leu-3-羟基-N-L-MeValα1-内酯。
becaplermin是重组人血小板衍生生长因子B，它是一种在氨基酸组成和生物活性方面与内源性人PDGF-BB同型二聚体类似的由遗传工程化酿酒酵母生产的重组蛋白，用于通过促进间充质衍生细胞的增殖来治疗慢性皮肤溃疡。
bivalirudin是一种具有20个氨基酸的抗凝剂，抗血栓形成剂。
卡贝缩宫素是1-丁酸-2-[3-(对甲氧苯基)-L-Ala]缩宫素。
卡古缩宫素是1-丁酸-6-(L-2-氨基丁酸)-7-甘氨酸缩宫素。
蓝肽是一种结构为5-O-L-Pro-L-Gln-L-α-Asp-L-O-硫代-L-Tyr-L-Thr-L-Gly-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-L-Phe-酰胺的胃液分泌刺激剂。
cetermin是具有112个氨基酸的转化人生长因子β2。
cilmostim是1-233-集落刺激因子1(人克隆p3ACSF-69蛋白部分)，环(7→90),(48→139),(102→146)-三(二硫化物)二聚体，用作生血剂(巨噬细胞集落刺激因子)。
多粘菌素E甲磺酸钠是一种用作抗细菌剂的粘菌素A组分。
可的瑞林Ovine Triflutate是促肾上腺皮质素释放因子(绵羊)，三氟乙酸盐，它用作肾上腺皮质缺乏症和库欣综合征的诊断助剂，和用作一种促肾上腺皮质素释放激素。
替可克肽是醋酸二十四肽促皮质素，α1-24-促肾上腺皮质素，用作促肾上腺皮质激素。
环孢菌素是一种含有11个氨基酸和在6位上的3-羟基-4-甲基-2-(甲氨基)-6-辛烯酰部分的环蛋白，用作免疫抑制剂。
dacliximab(Ro-24-7375)是一种由四个经二硫键连接的亚单位组成的、分子量约为150kD的人源化抗TAC单克隆抗体，用作免疫抑制剂。类似的免疫抑制剂蛋白是daclizumab。
达托霉素是一种蛋白质抗细菌剂。
地西卢定是包含63个氨基酸的来自医用水蛭的63-脱磺基水蛭素，用作抗凝剂。
地洛瑞林是包含9个氨基酸的促黄体素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂。
醋酸去氨加压素是加压素，1-(3-巯基丙酸)-8-D-Arg-，一醋酸盐，三水合物，包含9个氨基酸，用作抗利尿剂。
醋酸地肽利司包含10个氨基酸，用作LHRH拮抗剂。
度莫瑞林是27-L-Leu-44a-Gly生长激素释放因子(人)。
依降钙素是1-丁酸-7-(L-2-氨基丁酸)-26-L-Asp-27-L-Val-29-L-Ala降钙素(鲑)。
emoctakin是包含有两个Cys桥的72个氨基酸的白介素8(人)。
依泊丁α是一种调节红细胞生成的165个氨基酸的糖蛋白，由已插入了人红细胞生成素基因的中国仓鼠卵巢细胞生产。它用作抗贫血剂和补血剂。
厄索夫明是包含157个氨基酸的重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，是一种从人胎盘分离并在大肠杆菌中克隆和表达的非糖基化蛋白。它用作伤口愈合剂。
苯赖加压素是包含9个氨基酸的加压素，2-L-Phe-8-L-Lys，用作血管收缩药。
非尔司亭是一种175个氨基酸的单链多肽，它是非糖基化的，由大肠杆菌表达，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂。
高血糖素是一种29个氨基酸的单链蛋白质，用作抗糖尿病药。
醋酸戈那瑞林是包含10个氨基酸的促黄体激素释放因子的二醋酸盐，用作性腺刺激物质。
戈舍瑞林是包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂。
组氨瑞林是包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂。
imiglucerase是495-L-组氨酸葡糖基神经酰胺酶胎盘同工酶蛋白，用作葡糖脑苷脂酶的酶补充剂。
去丙氨酸的胰岛素是一种通过除去胰岛素B链C-末端的丙氨酸而制得的胰岛素衍生物，用作抗糖尿病药。
干扰素α-2a是包含165个氨基酸的干扰素αA(人白细胞蛋白质部分来源的)，用作抗肿瘤剂和生物应答调节剂。干扰素α-2b是包含165个氨基酸的干扰素α2b(人白细胞克隆Hif-SN206蛋白质部分来源的)，也用作抗肿瘤剂和生物应答调节剂。干扰素β-1a是一种从含有工程化的人干扰素β基因的培养中国仓鼠卵巢细胞生产的、由166个氨基酸残基组成的糖基化多肽，它也用作抗肿瘤剂和生物应答调节剂。干扰素β-1b是一种从大肠杆菌生产的、由165个氨基酸残基组成的非糖基化多肽，也用作免疫调节剂。干扰素γ-1b是1-139干扰素γ(人淋巴细胞蛋白质部分来源的)，N2-L-Met，它用作抗肿瘤剂和免疫调节剂。
iroplact是包含具有两个Cys桥的71个氨基酸残基的N-甲硫氨酰血小板因子4(人亚单位)。
lanoteplase是一种通过缺失纤连蛋白样和EGF样结构域并使Asn117突变为Gln117而从人t-PA衍生得到的组织纤溶酶原激活物蛋白。该蛋白通过在编码肽序列的DNA序列的哺乳动物宿主细胞中表达而生产，该蛋白用作纤溶酶原激活物和溶栓剂。
醋酸兰瑞肽包含8个氨基酸和一个二硫键。该蛋白用作抗肿瘤剂。
来诺拉提是一种通过表达来自于人口腔鳞状上皮细胞系-mRNA的人粒细胞集落刺激因子-cDNA而在中国仓鼠卵巢细胞中产生的、由174个氨基酸残基组成的糖蛋白。该蛋白用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂。
醋酸黄体瑞林是一种包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂。
莫拉司亭是一种包含127个氨基酸的集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白质部分来源的)，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂。
莫罗德明是一种表皮生长因子(鼠唾液腺)。
醋酸那法瑞林是包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂。
nagrestipen是包含69个氨基酸并具有两个二硫键的26-L-丙氨酸淋巴因子MiP1α(人克隆pAT 464炎症巨噬细胞)。
胃酶抑制剂是N-(3-甲基-1-氧丁基)-L-Val-L-Val-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酰-L-Ala-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，它用作胃蛋白酶抑制剂。
pramlintide是一种包含37个氨基酸和有一个二硫键的蛋白质，用作抗糖尿病药。
人胰岛素原是包含86个氨基酸残基并有三个二硫键的胰岛素原(猪)，用作抗糖尿病药。
沙莫司亭是集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白质部分)，23-L-Leu-，一种从酿酒酵母表达的、127个氨基酸残基的单链糖基化多肽，它用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂。
牛瑞生长素是促生长素(牛来源的)，1-[N2-L-Met-L-α-Asp-L-谷酰胺]-，包含191个氨基酸，用作催乳剂，尤其是用于兽医。
猪丙氨生长素是促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-丙氨酰-生长激素，总共包含191个氨基酸，用作激素(生长，猪)。
人蛋氨生长素是促生长素(人)，N-L-Met-，包含具有两个二硫键的191个氨基酸，用作生长激素。
促生长素，有时也称之为腺垂体生长激素，GH，垂体生长激素，垂体前叶生长激素，垂体生长激素和促生长的生长激素，是一种促进身体生长、刺激蛋白质合成和调节糖和脂质代谢的特异性合成代谢蛋白物质。促生长素是在下丘脑激素促生长素释放素和促生长素抑制素的调节下由垂体前叶分泌的。来自不同物质的促生长素生长激素，其氨基酸序列、抗原性、等电点、和它们可以产生生物应答的动物的范围是不同的。
对于人，促生长素是一种具有从人垂体前叶得到的主要生长刺激激素的正常结构的、包含191个氨基酸的单链多肽，它用作生长激素。促生长素也可以以重组形式获得。本文中所用的术语“促生长素”意欲包括天然产生的和合成的，包括重组衍生的人和动物促生长素(生长激素)，尤其是牛和猪促生长素。甲硫氨酰人生长激素C995H1537N263O301S8是用重组DNA在细菌中产生的，它含有天然激素的完全氨基酸序列再加上一个N-末端甲硫氨酸(methione)。
牛促生长素有四种天然产生的分子变体，其中之一叫做牛亮氨生长素。有几种变体已利用重组DNA技术生产，包括牛瑞生长素，C987H1550N268O291S9；牛蛋氨生长素，C978H1537N265O286S9；和牛度生长素，C1020H1596N274O302S9。
利用重组DNA技术已生产了天然猪促生长素的几种变体，包括猪丙氨生长素，C977H1527N265O287S7；猪诺生长素，C938H1469N255O275S7；猪蛋氨生长素，C979H1527N265O287S8；和塞泊生长素，C938H1465N257O278S6。
牛亮氨生长素是促生长素(牛)，127-L-Leu-，它是牛垂体促生长素中的四个天然分子变体之一，用作催乳剂。
猪诺生长素是促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190个氨基酸，用作猪生长激素。
牛蛋氨生长素是促生长素(牛)，1-L-Met-127-L-Leu-，包含191个氨基酸，用作兽用生长刺激剂。
猪蛋氨生长素是一种重组猪促生长素，C979H1527N265O287S8。
塞泊生长素是一种重组猪促生长素，C938H1465N257O278S6。
牛度生长素是一种重组牛促生长素，C1020H1596N274O302S9，它用作兽用生长刺激剂。
替普罗肽是缓激肽增效剂B，2-L-Trp-3-去-L-Leu-4-去-L-Pro-8-L-谷酰胺-，包含9个氨基酸，用作血管紧张素转化酶抑制剂。
特立帕肽是一种包含34个氨基酸的蛋白质，用作骨吸收抑制剂和骨质疏松症治疗佐剂。
thymalfasin是包含28个氨基酸的胸腺素α1(牛)，用作抗肿瘤剂，用于治疗肝炎和传染病，以及用作疫苗增强剂。
胸腺喷丁是一种用作免疫调节剂的五肽。
曲普瑞林是促黄体激素释放因子(猪)，6-D-Trp，包含10个氨基酸，用作抗肿瘤剂。
伐普肽包含具有一个二硫键的8个氨基酸，用作抗肿瘤剂。
8-L-Arg-或8-L-Lys-型加压素包含具有一个二硫键的9个氨基酸，用作抗利尿激素。
生物技术产业的不断扩展和生物技术研究工具及方法的使用使得更多不同类型的基于蛋白质的治疗剂进入了临床试验并最终投放市场。例如，考虑以下蛋白质制剂肌红蛋白；血红蛋白；β-乳球蛋白；免疫球蛋白-G(IgG)；抗血友病因子(因子Ⅷ)；溶菌酶；遍在蛋白；血小板活化因子(PAF)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；肿瘤坏死因子-β(TNF-β)；巨噬细胞炎性蛋白(MIP)；肝素；和嗜伊红性粒细胞阳离子蛋白(ECP)。另外，最近已批准的基于蛋白质的药物包括血小板生长因子，重组因子Ⅸ，非何杰金氏B细胞淋巴瘤的单克隆抗体，用于治疗丙型肝炎的改良干扰素α，和用于治疗创伤和烧伤的成纤维细胞衍生的人造皮肤。
上面已详细描述了用于本发明制备方法(包括其中所涉及的上述缩合方法)的起始反应物的组成，下面的段落将详细描述本发明制备方法本身。
本发明的制备方法提供了如本文中所定义的新的改良席夫碱缩合加合终产物。所述方法包括首先产生一个包含蛋白质和芳族邻羟基醛起始反应物的反应混合物。该反应混合物是通过使蛋白质组分反应物和芳族邻羟基醛组分反应物在一个含水环境中彼此充分接触而制备的。
本文中所用的词语“起始反应物”、“组分反应物”和“反应物”是指反应形成席夫碱缩合加合物的蛋白质和芳族邻羟基醛实体。
短语“在一个含水环境中”表示反应混合物的溶剂是水，并表示这是反应发生的介质。因此，在该反应过程中形成的缩合的水也成为该“含水环境”的一个不可分的部分。
当起始反应物混合在一起形成反应混合物后，本发明的制备方法立即继续进行席夫碱缩合反应。本文中所用的词语“席夫碱缩合反应”是指有机化学和有机化合物合成领域内的技术人员所熟知的反应。基本的席夫碱缩合反应可以用图解表示如下
其中 =以片段形式显示的蛋白质，因其至少一个氨基酸具有伯氨基，该伯氨基显示与该蛋白质片段相连。重要的是要注意，席夫碱加合物的形成是一个平衡反应，该反应也可能导致加合物分离为它的构成组分，并且这种分解反应的速度可能与一开始导致缩合加合物形成的基本反应的速度同样迅速。
本发明制备方法的缩合过程实质上被推动完成。本文中所用的词语“实质上完成”的意思是，该反应是一个定量的，即，完全进行完或几乎完全进行完的反应。本发明制备方法的缩合反应是通过除去已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水而定量进行的，除去水的同时符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并可确保向所述缩合加合终产物的转化速率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
本文中所用的与本发明的方法实施方案相联系的术语“制备方法”的含义包括席夫碱缩合反应，以及为了推动所述反应完成而采取的工艺步骤。整个方法的后一部分是通过实质上除去反应混合物的含水环境中的所有的水而实现的。
对于本文中所述的制备方法，能有效地推动所述缩合反应实质完成的条件包括能将存在的水从液相改变为气相或固相，由此将其从所述缩合反应的即时环境中除去的那些。在本发明的方法中，所述条件还必须具有可量测性的特征，即，容易且有效地适应大规模工业生产的能力，还必须有再现性，即，最终结果没有实质偏差地连续进行的能力。既然存在于其含水溶剂中的反应混合物是在室温或低于水的沸点的高温下制成的，存在的水自然将是液相的。为了推动该反应完成，必须从反应混合物的即时环境中完全而又快速地除去水。这一点不能简单地通过将缩合加合终产物与含水溶剂分离并弃去后者而达到。反应是处于平衡的，并且没有沉淀产物形成，这些事实都对这种方法造成了障碍。
在本发明的制备方法中采取了两种手段。一种，是将水转化为蒸汽或气体并除去，例如通过喷雾干燥，本发明的这种实施方式被看作是在0℃以上的温度下发生。另一种手段是，将水转化为固体并除去，例如通过冷冻干燥，本发明的这种实施方式被看作是在0℃或0℃以下的温度下发生。
本发明的制备方法中采取的第一种手段是通过将水从液相转变为气相或蒸汽相而将其除去。这样一个步骤通常非常迅速地完成。当水从液相转变为气相或蒸汽相时，会涉及到水的蒸发。于是，需要向该过程中输入能量以满足水的蒸发潜热(LHE)，LHE就是水从液态转化为汽态时每单位重量的水吸收的热能的量。所需能量可以从等式LHE=0.02T2/E进行计算，该等式中，T是水的热力学标度沸点，E是溶液的分子沸点升高值。一个相关的数值是比汽化潜热(SLHV)，它是在不改变温度的条件下将1克物质从液体转化为蒸汽所需的焦耳数。对于在100℃下的水，该值为2257J。
本发明制备方法进行的条件是使必需输入该方法的能量优化以最有效地将发生缩合反应的含水环境中的水(包括由所述缩合反应本身产生的水)和起始反应物以及缩合加合终产物分离开的那些。
本文中所用的短语“输入该方法的能量”是指单独或集合输入的所有形式的能量，也指它们在本发明制备方法中的应用，这种应用使得含水环境中的水从液相转变为汽相或固相。其中包括首先是原子热，它是使1克水从0℃升高至1℃所需的热能的量。一个相关的概念是分子热，它是使1摩尔水升高1℃所需的热能的量，即，比热X分子量。这种热能的输入将使反应混合物及其含水环境升高至所需温度。
其次输入的热能是满足蒸发热所需的热能，它已在上面的讨论中详细描述过了。之后，必须向存在于其含水环境中的反应混合物施加机械能以进行喷雾干燥步骤，在该步骤中水被完全蒸发。因此，在0℃以上的温度下，优化输入该方法的能量的条件包括(a)按照保持蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地进行所述制备方法(包括所述缩合反应)的要求，将在所述含水环境中的所述反应混合物加热至最高温度。
本文中所用的与可以使用的温度的上限有关的表述蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性”的意思实质是，起始物和/或产物的蛋白质组分在进行了这样的加热后没有受到任何明显的降解，所述加热即，将使生物活性产生任何损失的变性作用，或将干扰终产物(例如作为固体颗粒的皮下或胃肠外储存体的终产物)从其给药部位的释放、尤其是持续释放的变性作用。
根据进行本发明的制备方法(包括缩合反应)而说的“效率和经济最佳地”的意思是，当选择反应混合物的温度和本文中所述的大量其它工艺参数时，必须对进行所述方法的条件加以适当的考虑，目的是得到最有效的可能的方法，以及在满足其它选择的同时以最低的成本得到终产物的方法。因此，如果该方法的其它效能在品质上是相称的，并且只要所得方法是一个与“最好地获得”相一致的经济的方法，就应该坚持选择能提供最高收率终产物的工艺参数。本领域技术人员正好能平衡这些要求，以使该方法的各方面达到最佳。
因此，考虑到上述所有因素的影响，所述反应混合物一般加热至温度为25℃-125℃，优选为40℃-120℃，更优选为50℃-115℃，仍更优选为60℃-110℃，首选为75℃-105℃，同时通过在需要时应用抬高的压力而使该含水环境保持为液相。可以通过使用抬高的压力使温度达到水的环境沸点、即100℃以上，同时又使该含水环境仍为液相。
在0℃以上的温度下，该制备方法的下一个步骤包括(b)按照保持蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法(包括所述缩合反应)的要求，将在所述含水环境中的所述反应混合物细分成最小液滴。
在上述步骤的上下文中，保持蛋白质的完整性某种程度上将取决于该蛋白质的大小。因此，非常大的蛋白质可能使在该步骤中有用的液滴的平均直径变大。不过，在所述含水环境中的反应混合物一般分成平均直径为1.0μm-5.0mm的液滴，优选为10μm-1.0mm，更优选为100μm-900μm，仍更优选为200μm-800μm，首选为300μm-700μm。
本发明的制备方法包括这样一种实施方式，其中所述起始反应物以液滴形式彼此完全接触，即，所述缩合加合终产物的形成就发生在所述终产物以液滴形式分散之前或与其基本同时发生。所述起始反应物以液滴形式完全混合是通过足以使所述起始反应物彼此完全接触、同时又不会使所述缩合加合物的蛋白质组分机械降解的机械作用实现的。根据本文中所述的必须考虑的各种参数，本领域技术人员将能对特定的机械混合设备作出选择。
最重要的因素之一是有关蛋白质组分的性质和该蛋白质的结构完整性经历降解之前它在水溶液中能承受的剪切应力的量。这可以使用常规的结构完整性试验来确定，诸如，利用电泳来测量所选用的机械混合设备对将要使用的蛋白质的所述完整性的作用(如果有的话)。由于较大的肽能经受可赋予结构稳定性的各种因素的多种重叠效应的能力，使得所给蛋白质对水溶液中的机械剪切应力的抗性大体上不能得到完全预示，因此这类常规试验可能是必需进行的。另一方面，通过选择具有温和作用的机械混合设备可以从一开始就避免这些问题。考虑到要避免溶液中产生显著水平的剪切应力后再来选择设备，经常将避免对上述任何试验的需要。
熟练技术人员将容易地想到许多适宜的机械混合设备。例如，混合容器可以是固定的并利用转动或其它运动形式的元件如搅拌棒、搅拌桨或其它类型搅拌器通过轻柔搅拌来进行混合。当希望连续进行缩合过程时，可以采用一个料槽形式的混合装置，其中起始反应物从一端加入，而反应混合物和缩合加合终产物从另一端出来。在这样的装置中可以使用一个在溶液中缓慢转动的螺杆来进行搅拌，并使终产物升高从而离开正在加热的表面，由此使其通过溶液分布并使其通过料槽缓慢运输。整个料槽的摇摆也可以与挡板联合使用，以增加溶液在料槽中的停留时间。这两种类型的混合设备的特点都是具有低的传热系数，通过使用套管式装置可以达到更迅速的热交换，在该套管式装置中，反应混合物装在中心管中，同时两个管子之间的环隙中有逆向流动的加热介质。在这种类型的装置中，经常通过使用一个在中心管中旋转并带有刮擦热传递表面的叶片的轴来进行搅拌，叶片刮擦热传递表面可以得到高传热系数。
混合设备在设计上可以是更被动的，并且不利用热传递，诸如一种搅拌反应容器。对于大规模生产，可以使用排管进行加热，而下降管必须足够大以适应反应混合物的流动，并且下降管中通常安装有叶轮，通过强制循环增加向反应混合物的热传递。其中重要的是对终产物进行严格控制的连续方法可以使用浓缩反应混合物的混合设备进行。在一个真空反应器中，一般将把热的浓缩反应混合物加入保持在低压下的搅拌反应室中。可以使该反应混合物沸腾并绝热冷却至相当于该容器操作压力的沸点。
适用于本发明方法的另一种混合设备类型是利用反应混合物的物流，这种物流是通过例如液压泵产生的，该液压泵使所述物流中产生足够的湍流来确保各组分的完全混合。所选用的机械作用还可以采取单独喷洒每种起始反应物的形式，以这种方式，所述液滴达到彼此最大程度地混合、碰撞和接触。在该方法中可以使用包括足以传递将含有所述起始反应物的水流分成在上述大小范围内的液滴所需的能量的简单的机械或液压泵装置的喷洒器械，液滴的这种大小范围是要去除已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水所必需的，同时符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并可确保向所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
上述泵装置可以与一个喷嘴装置联合使用，由此将机械剪切力施加于含有起始反应物的水溶液的物流，结果，所述物流被不断分成更小的液滴，直到达到所需液滴大小为止。
在本发明的制备方法中也可以使用包含气流发生器和用于分散其中的所述起始反应物的所述水流以使其成为具有所需液滴大小的液滴形式的装置的喷洒器械。特别是，所述气体实质上对于所述起始反应物和所述缩合加合终产物来说是惰性的。所述气体由空气、氮气或氦气组成，其中，该气体已被压缩至一定压力，该压力足够高，以得到具有夹带所述起始反应物的所述液滴和确保其最大程度地混合、接触和碰撞所需的体积和速度的气流，所述液滴的产生及其最大程度的混合、接触与碰撞足以去除已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水，同时也符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并且足以确保转化为所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
适合用于本发明方法的喷洒器械包括上述气流发生器和有关的分散装置与上面所述的机械或液压泵装置和有关的喷嘴装置的任何适当的组合。当包括反应混合物的含水环境的温度要保持在水的正常沸点、即100℃以上时，这可以通过将该系统保持在抬高的压力下来实现，将其保持在抬高的压力下将以可预测方式抬高水在该系统中的沸点。还应当理解，一旦反应混合物和含水系统已作为小液滴通过喷洒器械射出，所述液滴的温度就将立即显著下降。例如，通过使用抬高的压力有可能使反应混合物和含水环境在喷洒器械的入口部分保持115℃的温度，而一旦该反应混合物和含水系统已离开该喷洒器械的喷嘴装置，就会观察到它们的温度已下降至80℃。
在本发明的另一个实施方案中，所述起始反应物以液滴形式完全混合是通过旋转的圆盘形式的机械作用实现的，包含所述每一种起始反应物的水流指向该圆盘的上方。可以对每种起始反应物使用一个单独的圆盘，或者使用一个已制成能适应所述两种起始反应物水流的单个圆盘。所述每种水流以从所述圆盘的边缘以液滴形式推进的方式通过所述圆盘；所述旋转圆盘的速率可以变化，以传递足够的能量将所述每种水流分成具有能使所述液滴最大程度地混合、碰撞和接触的大小和速率的液滴。
所述起始反应物的混合发生在已就温度、湿度和压力进行了调节的条件下，以去除已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水，同时也符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并且能确保转化为所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。例如，温度一般将落在上述范围内，其中所述反应混合物一般加热至25℃-125℃，优选为40℃-120℃，更优选为50℃-115℃，仍更优选为60℃-110℃，首选为75℃-105℃，同时在需要时通过应用降低的压力使该含水环境保持为液相。
也可以在一个器械中安装旋转圆盘，其中有可能通过使用例如真空泵装置维持降低的压力，尽管这不是一种典型的布置方式。如上所述，这种抬高的压力可以用于提高反应混合物和含水系统的沸点。这类旋转圆盘式喷雾器的一个例子是可从丹麦的Niro Atomizer得到的Niro移动式喷雾干燥器。该设备有一个柱高为600mm、直径为800mm的室，其有一个锥度为60°角的锥形底板。当其在大气压下运转时，圆盘的速率范围将是35,000-40,000rpm，干燥空气的流速将为80kg/小时。
上述加热反应混合物和含水环境与在其分离成小液滴的过程中向其中输入的机械能结合在一起，将有效地激励其中的水分子，使它们变为气体或汽相。为了进一步促进水从反应混合物及含水环境中的去除，优选另外使用空气流来带走汽化的水。从运动的空气流直接输入能量增强了水的汽化作用，且一般空气流的速度越高，对汽化作用的增强效果越大。汽化作用的增强通过使用具有高温(例如75℃-150℃，优选为90℃-110℃)的空气流可进一步得到提高。加热的空气给汽化过程提供了另外的能量。水的汽化还可以通过使用加热的干燥(即湿度低的)空气流进一步加强，干燥可以提高该热气流包含更多水蒸气的能力。该热空气流的湿度优选为1％-20％相对湿度，优选为2％-10％相对湿度。
因此，本发明制备方法的最后一个步骤如下(c)给由此形成的所述液滴提供关于它们所从中通过的惰性气体的最高比速，这符合保持蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法(包括所述缩合反应)的要求。
针对反应混合物和含水环境的液滴以及形成的缩合加合终产物的液滴而提到的“它们所从中通过的惰性气体”的意思是指对所述终产物来说为惰性的任何气体。可以使用象氮气和氦气这类普通气体，它们容易获得并且在这些情况下是惰性的。不过，在实践中，通常将难以找到一个比环境气体更适宜的惰性气体。空气也最有可能符合效率和经济最佳地完成本发明制备方法的要求。
所述液滴经受的比速为0.1m/秒-5.0m/秒，优选为0.2m/秒-4.0m/秒，更优选为0.3m/秒-3.0m/秒，仍更优选为0.4m/秒-2.0m/秒，首选为0.5m/秒-1.0m/秒。这个速度考虑了可能与所述液滴的物流一起、相对、交叉或成任何角度流动的惰性气流的相对速度。
完成了上述过程后，在所述含水环境中的反应混合物有可能分成平均直径为1.0μm-5.0mm的液滴，优选为10μm-1.0mm，更优选为100μm-900μm，仍更优选为200μm-800μm，首选为300μm-700μm。不言而喻，液滴越小，水的汽化和从反应混合物及含水环境中的去除越有效。这主要是因为水分子的表面积大大膨胀，使得它们可以从液相转变为汽相，并且被周围的惰性气流带走。
在减少水分以加快水的去除速率的条件下也可能完成这些缩合过程。这将有助于推动该缩合反应完成，并符合在缩合加合终产物中存在的水分的量为3.0％-0.001％重量(以该终产物的重量计)、优选为2.0％-3.0％重量(以所述终产物的重量计)的要求。不过，也可能进一步除去更多量的水分以提供一个更为干燥的不会结块并具有改善的稳定性和其它加工性能的终产物。因此，该缩合加合终产物中存在的水分的量可低至0.1％-0.001％重量，或0.05％-0.005％重量，或者甚至低至0.03％-0.01％重量，以终产物的重量计。另一方面，必须注意，如果终产物完全脱水的话，许多蛋白质会显示出不稳定性，因此可能必需在终产物中存在实质更高量的水分。与保持终产物完整性的目标一致，终产物中存在的水分的量可以在3.0％-20.0％重量范围内，优选为5.0％-15.0％重量，更优选为8.0％-12.0％重量，以终产物的重量计。
如上所述，在本发明的制备方法中采取了两种手段。在上述第一种手段中，水被转化为蒸汽或气体并除去，例如通过喷雾干燥，本发明的这种实施方式被看作是在0℃以上的温度下发生的。在以下段落中描述的第二种手段中，水被转化为固体并除去，例如通过冷冻干燥，本发明的这种实施方式被看作是在0℃或0℃以下的温度下发生的。
本发明制备方法中采取的第二种手段是通过将水从液相转变为固相而将其除去。这样一个步骤通常不是象转化为汽相的步骤那样迅速完成的。当水从液相转变为固相时，牵涉到水的冻结，这本质上需要从反应混合物的含水环境中除去能量。但是，为了从所述含水环境中除去能量，即，将其温度降低并最终使其变为固相，就必需在本发明的制备方法中使用能量。例如，这将涉及到使用一个致冷系统或快速热交换系统并让其与含水环境接触。结果，就需要向该制备过程中输入能量，以除去足够的有关单位重量的水的热能，从而降低其温度并最终使其变为固相。
实现上述从所述制备方法的含水环境中除去热能的一个方法是通过冷冻干燥或冻干所述含水环境(包括反应混合物)。按照本发明，这样一种冷冻干燥过程进行的方式是，使所述反应混合物冷却至温度为-110℃至0℃，优选为-45℃至-5℃，更优选为-40℃至-10℃，仍更优选为-35℃至-15℃，首选为-30℃至-20℃，同时保持该含水环境为固相，即冻结的。这个干燥过程本质上是这样一个过程，即首先使含水溶剂冻结，然后通过在真空环境中升华将其除去，由此除去该含水溶剂。
为了提高水的去除速率，在含水环境中的冷却的反应混合物经受的降低的压力为5.0mmHg绝对压力-0.0001mmHg绝对压力，优选为1.0mmHg绝对压力-0.0005mmHg绝对压力，更优选为0.5mmHg绝对压力-0.001mmHg绝对压力，仍更优选为0.2mmHg绝对压力-0.005mmHg绝对压力，首选为0.1mmHg绝对压力-0.01mmHg绝对压力。这种降低的压力可以使用各种容量和已知构造的真空泵得到。
在进行本文中所关注类型的冷冻干燥过程的常规方式中，将反应混合物水溶液填充到适宜的容器如小瓶中，然后将其置于一个温度受控的环境如大干燥室中。有关的缩合加合终产物最后将被用于治疗人和动物的疾病和病况。因此，有效的是以小批量收集方式诸如小瓶加工这类产物，因为这些将各自为完成冷冻干燥过程提供适宜的体积表面积比，并且可以一次加工大量小瓶。
然后将干燥室中的温度调节并保持在大约-40℃，之后反应混合物水溶液迅速变成由冰和固体溶质组成的固体，即，缩合加合终产物。根据有关终产物的不同和所进行的冷冻干燥过程的性质，冰结晶，而溶质或者结晶或者变为玻璃状溶质。然后利用真空泵将干燥室抽空，干燥室中的温度升高至冷冻干燥过程中的冰开始升华为蒸汽的阶段，通常称之为初级干燥步骤。升华产生的水蒸气通过部分干燥的缩合加合物随同它一起传输到一个冷凝室中，该冷凝室装备有保持在甚至约-60℃的低温下的表面，在此，蒸汽冷凝而得以除去。随着缩合加合产物温度的提高，初级干燥的速率也提高，但必须注意不得超过保持产物完整性所允许的最高温度。
初级干燥步骤除去了开始的缩合加合产物中的所有的冰。但是，在产物非晶部分中以溶解状态包含的产物中的水分的量仍有相当数量，根据所述产物的组成，数值大约为20％-50％重量。这些残留水的去除在第二干燥阶段中完成，该阶段一般在抬高的产物温度下进行。不过，这些温度不会高至本文中所述的本发明喷雾干燥方法中使用的温度。正常地，优选使用冷冻干燥方法而不是本发明的喷雾干燥方法，因为前者是在低温下进行的，这更有可能不对含蛋白质的终产物产生任何破坏作用。冷冻干燥方法还具有更容易防止微生物和颗粒污染物的优点。另一方面，生产时，冷冻干燥方法与喷雾干燥方法相比，有涉及更高的设备资本成本和更高的能源消耗成本的缺点。不过，对于这两种类型的方法，终产物的蛋白质性质都对保持该终产物的构象稳定性提出了实质的挑战。
上面所提到的缩合加合物的非晶形相包含未结晶的产物溶质和未结晶的水。在实践中，水在平衡点时不会结晶成冰，而且在其将成核和结晶之前，必须比该点过冷10-15°。所需的过冷的量取决于溶质的组成和温度和在干燥室中的存留时间，以及容器瓶的大小和原料组成和在缩合加合水溶液中存在的可为冰的形成提供异相成核位点的任何颗粒物质。在这点上，与最有可能由缩合加合产物组成的用于动物和人的治疗剂的生成有关的无菌、无颗粒的生产场所环境会对扩大生产造成问题。这类环境限制了颗粒成核位点的机会，导致需要使加合产物更大程度地过冷，这又会控制所形成的冰晶体的大小。冰的晶体大小是重要的，因为它会控制升华过程中在冰晶体中造成的孔洞或通道的大小，从而影响在升华过程中可得到的这些孔洞的表面积。
最后，这些因素会显著影响升华的速率以及第二干燥过程的速率。过冷提高10℃可导致初级干燥时间提高一个数量级。过冷的程度应限制在10-15℃，并且在整个干燥室中和对于每个小瓶应是均一的。
当目的是得到均匀的过冷度和冷冻行为时，为得到最佳结果而选择的干燥室温度和存留时间参数包括首先将所有缩合加合产物冷却至0℃以下的温度，但高于引起成核作用和结晶作用的温度，大约是-5℃至-10℃。随后，干燥室温度降低至中等水平，以诱导所有容器瓶中的冰结晶，这大约是-20℃至-30℃。这之后，干燥室温度充分降低到最低低共熔温度以下，此时溶质结晶；或者降低到玻璃化转变温度以下，此时溶质为非晶形的，这大约是-40℃。一旦该低共熔系统已结晶，它就完全成为固体，然后就可进行初级干燥。
当溶质系统趋向保持非晶形时，可以采用一个回火或退火方法，其中将缩合加合产物的温度升高，使其至少比玻璃化转变温度高几度，维持数小时，目的是允许溶质结晶，之后在开始初级干燥之前再次降低干燥室的温度。还必须注意，在此过程中，冰的形成导致所有溶质浓缩，这将包括溶解的盐，例如，包括当缩合加合产物溶解于弱盐溶液中时。结果将是NaCl的浓度升高，这最终可能导致所述产物降解。
为了防止产物降解，初级干燥阶段在最大允许温度下进行而不是在可能的最高温度下进行。此温度将是溶质是晶体时的低共熔温度和溶质为非晶形时的崩溃温度或低共熔熔化温度。在最大允许温度以上进行干燥会导致没有确切几何特性的无法接受的产物。最大允许温度可以容易地利用热分析法、电阻测量法或产物对温度的显微分析来确定，它可以在非常大的范围内变化，且必需作为确立冷冻干燥方法参数的第一个步骤加以确定。
上述制备方法也可以在减少水分的条件下进行，由此加快水的去除速率和提高所去除的总量。这与通过除去已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水来推动缩合反应完成的目标相一致，同时也符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并且可确保转化为所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
与该目标一致，缩合加合终产物中存在的水分的量将相应地是该终产物重量的3.0％-0.001％，优选为2.0％-3.0％重量，以所述终产物的重量计。不过，缩合反应完成后，也可能在需要时从终产物中进一步除去更多量的水分，以防止结块，提高稳定性，改善加工或出于技术人员显而易见的其它目的。因此，该缩合加合终产物中存在的水分的量可低至0.1％-0.001％重量，或0.05％-0.005％重量，或者甚至低至0.03％-0.01％重量，以终产物的重量计。
不过，根据缩合加合终产物的性质，尤其是其蛋白质组分的性质，可能必需在终产物中存在实质更高量的水分，因为如果除去终产物中的所有水的话，许多蛋白质将是不稳定的。因此，与保持终产物的完整性相一致，可能希望终产物中存在的水分的量在3.0％-20.0％重量范围内，优选为5.0％-15.0％重量，更优选为8.0％-12.0％重量，以终产物的重量计。
优选实施方案的描述以下实施例是为了进一步阐述本发明的新方法和产品，但不以任何方式限制本发明。
实施例1利用冷冻干燥制备Met-pST和其它醛的缩合加合物将76.1mg邻香草醛溶解于200ml蒸馏水，从而制得2.50mM邻香草醛溶液。完全溶解醛需要最小的加热和声处理。以类似方式制备香草醛、水杨醛和苯甲醛的水溶液(均为2.50mM)。在室温下将干燥、冻干的met-pST(21.9mg,21858g/m,1.00μmole)溶于2.00ml的每种醛溶液。用稀氢氧化钠溶液将pH调节至8.0(如果需要将pH值调低，就使用稀醋酸)。终溶液含有1.00μmole蛋白质和5.00μmole醛。使该溶液在室温下放置1小时，然后置于20mL冷冻干燥烧瓶中并在冰箱中在-28℃下冷冻16小时。接着将冻结的样品放置在一个歧管冷冻干燥器中，将烧瓶排空。压力保持＜1.0mm，持续24小时。然后将烧瓶拿回至大气压下，测定回收物质的重量。在每种情况下，测得的重量都在关于醛和蛋白质起始物总重的试验误差内。在这一反应规模下都不能测得醛的任何损失。反相HPLC分析仅显示有met-pST单体和适宜醛的峰值，单体的回收大于95％。还对每种样品进行了电喷射质谱分析。借助声处理将电喷射样品溶于0.1％三氟乙酸的2-甲氧基乙醇溶液(～0.1mg/ml)。在进行分析前5分钟内配制样品，因为对照试验表明，如果使溶液放置更长的时间，将会有部分物质发生水解。
上述制备既提供了落在本发明范围内的席夫碱缩合加合终产物，也提供了不在本发明范围内的加合物，因为它们不是用芳族邻羟基醛制备的。下表1-A中总结了每种测试样品的制备。表1-B显示了所述每种样品的分析结果，包括用于完全形成席夫碱加合物的醛与蛋白的预计当量数的指示。在上述基础上确定每种样品的百分收率。冷冻干燥过程的重量百分收率总是定量在所有醛和蛋白质起始物的试验误差内，因为原料的损失仅来自升华醛，且这仅在使用非邻羟基醛的时候才发生，在这种情况下损失小到甚至无法测量。席夫碱的百分收率相当于终产物的质量(由于刚才所提到的原因，它总是理论的100％)X转化率。于是，利用电喷射质谱法测得醛的实际平均当量数，将其除以理论基础上预测的当量数，就可得到转化率，将结果乘以100，从而将转化率表示为百分数。由此得到的数值是使用本发明制备方法得到的席夫碱转化效率的另一个指示。
最后，在进行有关的试验操作之前，先测定每种样品的pH值，以论证保持pH为7.0或更高对获得高收率的重要性。
表1-A
表1-B
*对于非邻羟基醛加合物来说，这是唯一一个收率在70％以上的例子。
**对于邻羟基醛加合物来说，这些是仅有的几个收率低于90％的例子。
以下实施例说明了在0℃以上的温度下进行的本发明的制备方法。
实施例2利用喷雾干燥制备Met-pST和邻香草醛的缩合加合物将干燥、冻干的met-pST(45.7μmole)的1.00gm样品溶于100.0ml蒸馏水。向该溶液中加入邻香草醛(34.8mg,228.Smmole,5.00当量)。通过在40℃下搅拌1小时使邻香草醛溶解。然后用0.1N氢氧化钠溶液将pH调节至7.50。以2.0ml/分钟的速度将该样品加入Buchi 190型小型喷雾干燥器中。将吸气器设定在-25mbar，样品入口温度为110℃，样品出口温度为75℃。产物收集在旋风收集器中，利用反相HPLC和电喷射质谱法进行分析。
上述制备提供了落在本发明范围内的席夫碱缩合加合终产物，因为它们都是用邻香草醛(一种芳族邻羟基醛)制备的。对于其他醛使用类似的条件。下表2-A中总结了每种测试样品的制备。表2-B显示了每种测试样品的分析结果，包括用于完全形成席夫碱加合物的醛与蛋白的预计当量数的指示。该喷雾干燥过程的重量百分收率总是定量在所有醛和蛋白质起始物的试验误差内，因为原料的损失仅来自升华醛，且这仅在使用非邻羟基醛的时候才发生，甚至在这种情况下损失小到无法测量。席夫碱的百分收率相当于终产物的质量(由于刚刚所解释的原因，它总是理论的100％)X转化率。接着，利用电喷射质谱法测得醛的实际平均当量数，将其除以理论基础上预测的当量数，就可得到转化率，将结果乘以100，从而将转化率表示为百分数。
由此得到的数值是使用本发明制备方法得到的席夫碱转化效率的另一个指示。上述喷雾干燥方法的质量产率较低，这是所述方法以缩小的规模进行的直接结果。大量终产物最后是附着在干燥器械上而没有被回收。因此，上述的产物转化率是说明本发明方法的相对优越性的更为准确的基础。
最后，在进行有关的试验操作之前，先测定每种样品的pH值，以论证保持pH为7.0或更高对获得高收率的重要性。
表2-A
表2-B
在上面的数据表中，收率值(％)精确至所给数的5-10％以内。应注意到，对于所有使用了芳族邻羟基醛且pH≥7.0的制剂来说，收率≥90％。在上面列出的相关表中指出了关于这个观察结果的几个例外。与此相反，当使用芳族非邻羟基醛时，虽然pH与邻羟基醛样品同样都≥7.0，但收率均≤70％。在上面列出的相关表中指出了关于这个观察结果的唯一一个例外。
上面列出的表1-B中有关样品1y至1dd的数值说明了保持pH值≥7.0对获得高收率的极其重要性。如果pH都保持≥7.0的话，所有使用芳族邻羟基醛的这些样品的收率就可能都≥90％。不过，将pH确立为是从最低3.31开始逐渐升高至最高8.52这一范围内不同的值。收率百分数显示出相应的升高，从最低33％开始有规律地升高至最高93％。
权利要求
1.一种用于制备组分包括对动物具有有益活性的蛋白质和芳族邻羟基醛的席夫碱缩合加合终产物的改良方法，该方法包含使上述组分一起混合在pH7.0或更高pH值下的含水环境中而形成一种反应混合物，反应发生在能通过除去已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水来有效地推动所述缩合反应实质完成的条件下，同时符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并可确保向所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
2.按照权利要求1的方法，其中所述芳族邻羟基醛包含一个或多个下式化合物 其中R1和R4独立地选自氢；羟基；卤素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)环烷基；(C2-C6)链烯基；-C(=O)OR7；-OC(=O)R7；-S(=O)2-S(=O)2N(R7)(R9)；-S(=O)2R7；-S(=O)2OR7；-C(=O)NR7R9；-C(=O)R9和-N(R7)(R9)，其中R7是氢或(C1-C4)烷基，R9是(C1-C4)烷基；其中定义R1和R4的所述烷基、环烷基和链烯基可选地被选自以下成员的一个或两个取代基独立地取代卤素；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺酰基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；X和Y独立地分别是N,CHR2或CHR3，其中R2和R3独立地选自氢；羟基；卤素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)环烷基；(C2-C6)链烯基；-C(=O)OR11；-OC(=O)R11；-S(=O)2；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11是氢或(C1-C4)烷基，R13是(C1-C4)烷基；并且其中定义R2和R3的所述烷基、环烷基和链烯基可选地被选自以下成员的一个或两个取代基独立地取代卤素；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺酰基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
3.按照权利要求2的方法，其中所述芳族邻羟基醛包括邻香草醛；水杨醛；2,3-二羟基苯甲醛；2,6-二羟基苯甲醛；2-羟基-3-乙氧基苯甲醛；或吡哆醛。
4.按照权利要求1的方法，其中所述对动物具有有益活性的蛋白质包括选自以下成员的一种或多种内源性的和合成的蛋白质阿片样止痛剂和拮抗剂，包括脑啡肽、内啡肽和强啡肽，它们是μ、κ和δ阿片样物质受体亚型的选择性和非选择性兴奋剂和拮抗剂，包括[Leu5]和[Met5]脑啡肽；强啡肽A和B；α-和β-新内啡肽；[D-Ala2,MePhe4,-Gly(ol)5]脑啡肽(DAMGO)；[D-Pen2,D-Pen5]脑啡肽(DPDPE)；[D-Ser2,Leu5]脑啡肽-Thr6(DSLET)；[D-Ala2,D-Leu5]脑啡肽(DADL)；D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2(CTOP)；[D-Ala2,N-MePhe4,Met(O)5-ol]脑啡肽(FK-33824)；Tyr-D-Ala-Phe-Asp-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2]δ啡肽Ⅰ；Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH2([D-Ala2,Glu4]δ啡肽Ⅱ；Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2(morphiceptin)；Tyr-Pro-MePhe-D-Pro-NH2(PL-017)；和[D-Ala2,Leu5,Cys6]脑啡肽；内分泌物，包括为响应选自组织损害、病毒感染和变态反应的炎症事件而由蛋白水解反应产生的缓激肽和胰激肽，其中所述蛋白质局部见效而导致疼痛、血管舒张、血管通透性增加和前列腺素合成，其中所述蛋白质具有兴奋剂和拮抗剂活性，可用于治疗男性不育，用于癌症化疗剂越过血脑屏障释放，和用于治疗疼痛、哮喘和其它慢性炎症疾病，包括Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(缓激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脱-Arg9-缓激肽)；Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe(脱-Arg10-胰激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu(脱-Arg9-[Leu8]-缓激肽)；Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-[D-Phe]-Phe-Arg([D-Phe7]-缓激肽)；和[D-Arg]-Arg-Pro-Hyp-Gly-Thi-Ser-Tic-Oic-Arg(HOE 140)，其中Hyp是反式-4-羟基-Pro；Thi是β-(2-噻吩基)-Ala；Tic是[D]-1,2,3,4-四氢喹啉-3-基-羰基；Oic是(3as,7as)-八氢吲哚-2-基-羰基；对分别介导加压应答和抗利尿应答的加压素受体亚型V1和V2有效的蛋白质，包括在充血性心力衰竭、高血压、手术后肠梗阻和腹部膨胀的治疗中有益的V1拮抗剂，用于通过控制多尿和烦渴来治疗中枢性尿崩症的V2兴奋剂，以及用于治疗出血性疾病包括威勒布兰特病的V2兴奋剂，包括特异性天然产生的加压素样肽下式表示的精氨酸加压素(AVP) 和赖氨酸加压素([Lys8]-AVP)；合成加压素肽V1a-选择性兴奋剂[Phe2,Ile2,Orn8]AVP；V1b-选择性兴奋剂脱氨基[D-3-(3’-吡啶基)-Ala2]AVP；V2-选择性兴奋剂去氨加压素(dDAVP)和脱氨基[Val4,D-Arg8]AVP；以及肽拮抗剂，包括下式表示的V1a-选择性拮抗剂d(CH2)5[Tyr(Me)2]AVP 和V1b-选择性拮抗剂dp[Tyr(Me)2]AVP；以及V2-选择性拮抗剂脱Gly-NH29-d(CH2)5[D-Ile2,Ile4]AVP和d(CH2)5[D-Ile2,Ile4,Ala-NH29]AVP；用作胃液分泌的一种指示剂的五肽胃泌素，化学式为N-叔丁氧羰基-β-Ala-Trp-Met-Asp-Phe-NH2；用于治疗胃肠道肿瘤的症状、其它疗法难以治疗的腹泻、能动性障碍和胃肠出血的奥曲肽，化学式为L-半胱氨酸酰胺-D-Phe-L-Cys-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-N-[2-羟基-1-(羟甲基)丙基]-，环(2→7)-二硫化物，[R-(R*,R*)]-；用作免疫抑制剂的抗体试剂，包括抗胸腺细胞球蛋白；鼠单克隆抗体-CD3单克隆抗体；和Rh0(D)免疫球蛋白；以及用于治疗免疫缺损状态的蛋白质免疫刺激剂，包括免疫球蛋白；由白细胞产生并具有各种各样免疫调节作用的细胞因子，包括干扰素，集落刺激因子和白介素，特别是α-干扰素；干扰素-γ(IFN-γ)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；和白介素-1(IL-1)至白介素-12(IL-12)；涉及调节成熟血细胞不断被替换的过程的造血生长因子，它们可用于治疗原发性血液疾病，并可在严重感染的治疗和对经受化疗或骨髓移植的病人的处理中用作佐剂，具体包括生长因子，包括红细胞生成素(EPO)；干细胞生长因子(SCF)；白介素(IL-1-12)；单核细胞/巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF,CSF-1)；P1XY32l(GM-CSF/IL-3融合蛋白)；和血小板生成素；用于溶解病理性血栓和血管损伤部位的血纤蛋白沉积物的溶栓蛋白，包括链激酶；组织纤溶酶原激活物(t-PA)；和尿激酶；垂体前叶激素和调节它们的使用的下丘脑因子，包含(a)促生长激素，包括生长激素(GH)，促乳素(Prl)和胎盘催乳激素(PL)；(b)糖蛋白激素，包括促黄体素(LH)，促滤泡激素(FSH)和促甲状腺素(TSH)；和(c)POMC衍生激素，包括促肾上腺皮质素(ACTH)，α-促黑激素(α-MSH)，β-促黑激素(β-MSH)，β-促脂解素(β-LPH)和γ-促脂解素(γ-LPH)；调节所述激素释放的下丘脑因子，包括生长激素释放激素(GHRH)，促黄体素释放激素(LHRH)，胰岛素样生长因子(IGF-1和IGF-2)，促生长素抑制素和促性腺素释放激素(GnRH)；用作生长激素缺陷儿童的替代疗法的生长激素，包括促生长素抑制素，促生长素抑制素的合成类似物，奥曲肽；用于生殖疾病的诊断和不育症治疗的促性腺激素，包括LH,FSH和绒毛膜促性腺激素(GC)，包括尿促卵泡素，一种用于诱导排卵的基本上已除去了大多数LH的人绝经期促性腺激素(hMG)，和戈那瑞林，一种用于刺激促性腺激素分泌的合成人GnRH；合成GnRH兴奋剂，包括用于治疗对性类固醇减少敏感的内分泌紊乱的亮丙瑞林，组氨瑞林，那法瑞林和戈舍瑞林；促甲状腺素(TSH)，其分泌受促甲状腺素释放激素(TRH)的控制，用于甲状腺机能减退患者的激素替代疗法和非中毒性甲状腺肿患者或对甲状腺癌进行了治疗后的患者的TSH抑制疗法；用于治疗胰岛素依赖性糖尿病患者和非胰岛素依赖性糖尿病患者的胰岛素；在葡萄糖和酮体代谢的调节中具有生理学作用的胰高血糖素，它可用于治疗严重低血糖，也可由放射学家用于抑制胃肠道；用于阻断分泌内分泌物的肿瘤中的激素释放的促生长素抑制素，及其合成类似物-奥曲肽，所述肿瘤包括胰岛瘤，胰高血糖素瘤，血管活性肠多肽肿瘤，类癌肿瘤和生长激素瘤；降钙素，一种特定作用于破骨细胞以抑制骨吸收的激素，它可用于处理高钙血和增加的骨骼重建疾病，包括佩吉特病；用于治疗脊柱性骨质疏松症患者的甲状旁腺素；阿地白介素，125-L-丝氨酸-2-133-白介素2，用作抗肿瘤剂和免疫刺激剂；阿糖苷酶，一种497个氨基酸的单体糖蛋白和人胎盘组织β-葡糖脑苷脂酶的修饰型，可用作葡糖脑苷脂酶的补充剂；丙赖促皮质肽，一种合成的促肾上腺皮质素类似物1-β-Ala-17[L-2,6-二氨基-N-(4-氨基丁基)己酰胺]-α1-17-促肾上腺皮质素；阿克伐司，一种527个氨基酸的丝氨酸蛋白酶，其序列与血管壁中内皮细胞产生的天然的蛋白酶的序列相同，可用作纤溶酶原激活物；阿韦舒托，一种通过基因工程使CD4的细胞外结构域的头178个氨基酸经两个接头残基与假单胞菌属外毒素A的氨基酸1-3和253-613相连而得到的合成嵌合蛋白，可用作抗病毒剂；amlintide，一种37个氨基酸的蛋白质，可用作抗糖尿病剂；阿莫胃泌素N-羧基-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-3-苯基-L-丙氨酸酰胺；anakinraN2-L-Met-白介素1受体拮抗剂，可用作治疗炎性肠病的非甾族抗炎药和抑制剂；醋酸阿那立肽，心房肽激素-21(鼠)，N-L-Arg-8-L-Met-21a-L-Phe-21b-L-Arg-21c-L-Tyr-，醋酸盐，用作抗高血压剂和利尿剂；血管紧张素胺，血管紧张素Ⅱ，1-L-Asn-5-L-Val-，用作血管收缩药；抑肽酶，一种有58个氨基酸的胰腺胰蛋白酶抑制剂，用作酶抑制剂(蛋白酶)；阿法拉新，1-琥珀酰胺酸-5-L-Val-8-(L-2-苯基甘氨酸)血管紧张素Ⅱ，用作抗高血压药；鞣酸精氨加压素，加压素，8-L-Arg-，鞣酸盐，用作抗利尿剂；门冬托星，催产素，4-L-Asn-，用作抗生素，由浅灰链霉菌产生；阿托西班，催产素，1-(3-巯基丙酸)-2-(0-乙基-D-Tyr)-4-L-Thr-8-L-Orn-，用作一种催产素拮抗剂；阿伏帕星，一种从纯白链霉菌得到的糖肽类抗生素；basifungin,N-[(2R,3R)-2-羟基-3-MeVal]-N-L-MeVal-L-Phe-N-L-MePhe-L-Pro-L-别-Ile-N-L-MeVal-L-Leu-3-羟基-N-L-MeValα1-内酯，用作抗真菌剂；becaplermin，重组人血小板衍生生长因子B，一种在氨基酸组成和生物活性方面与内源性人PDGF-BB同型二聚体类似的由基因工程酿酒酵母产生的重组蛋白，用于通过促进间充质衍生细胞的增殖来治疗慢性皮肤溃疡；bivalirudin，一种具有20个氨基酸的抗凝剂，抗血栓形成剂；卡贝缩宫素，1-丁酸-2-[3-(对甲氧苯基)-L-Ala]催产素；卡古缩宫素，1-丁酸-6-(L-2-氨基丁酸)-7-甘氨酸催产素；蓝肽，5-O-L-Pro-L-Gln-L-α-Asp-L-O-硫代-L-Tyr-L-Thr-L-Gly-L-Trp-L-Met-L-α-Asp-L-Phe-酰胺，用作胃液分泌刺激剂；cetermin，具有112个氨基酸的转化人生长因子β2；cilmostim,1-233-集落刺激因子1(人克隆p3ACSF-69蛋白部分)，环(7→90),(48→139),(102→146)-三(二硫化物)二聚体，用作生血剂(巨噬细胞集落刺激因子)；多粘菌素E甲磺酸钠，一种用作抗细菌剂的粘菌素A组分；可的瑞林，ovine triflutate，促肾上腺皮质素释放因子(绵羊)，三氟乙酸盐，用作肾上腺皮质缺乏和库欣综合征的诊断助剂，和用作一种促肾上腺皮质素释放激素；替可克肽，醋酸二十四肽促皮质素，α1-24-促肾上腺皮质素，用作促肾上腺皮质激素；环孢菌素，一种含有11个氨基酸和在6位上的3-羟基-4-甲基-2-(甲氨基)-6-辛烯酰部分的环蛋白，用作免疫抑制剂；dacliximab(Ro-24-7375)，一种由四个经二硫键连接的亚单位组成的、分子量约为150kD的人源化抗TAC单克隆抗体，用作免疫抑制剂；daclizumab；达托霉素，一种蛋白质抗细菌剂；地西卢定，包含63个氨基酸的来自医用水蛭的63-脱磺基水蛭素，用作抗凝剂；地洛瑞林，包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；醋酸去氨加压素，加压素，1-(3-巯基丙酸)-8-D-Arg-，一醋酸盐，三水合物，包含9个氨基酸，用作抗利尿剂；包含10个氨基酸的醋酸地肽利司，用作LHRH拮抗剂；度莫瑞林，27-L-Leu-44a-Gly生长激素释放因子(人)；依降钙素，1-丁酸-7-(L-2-氨基丁酸)-26-L-Asp-27-L-Val-29-L-Ala降钙素(鲑)；emoctakin，有两个Cys桥的包含72个氨基酸的白介素8(人)；依泊丁α，一种调节红细胞生成的165个氨基酸的糖蛋白，由已插入了人促红细胞生成素基因的中国仓鼠卵巢细胞产生，用作抗贫血和补血剂；厄索夫明，包含157个氨基酸的重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，是一种从人胎盘分离并在大肠杆菌中克隆和表达的非糖基化蛋白，用作伤口愈合剂；苯赖加压素是包含9个氨基酸的加压素，2-L-Phe-8-L-Lys，用作血管收缩药；非尔司亭，一种175个氨基酸的单链多肽，非糖基化的，由大肠杆菌表达，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂；高血糖素，一种29个氨基酸的单链蛋白质，用作抗糖尿病药；醋酸戈那瑞林，包含10个氨基酸的促黄体激素释放因子醋酸酯的二醋酸盐，用作性腺促进物质；戈舍瑞林，包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；组氨瑞林，包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；imiglucerase,495-L-组氨酸葡糖神经酰胺酶胎盘同工酶蛋白，用作葡糖脑苷脂酶的酶补充剂；胰岛素，去丙氨酸的，是一种通过除去胰岛素B链C-末端的丙氨酸而制得的胰岛素衍生物，用作抗糖尿病药；干扰素α-2a，包含165个氨基酸的干扰素αA(人白细胞蛋白质部分来源的)，用作抗肿瘤剂和生物应答调节剂；干扰素α-2b，包含165个氨基酸的干扰素α2b(人白细胞克隆Hif-SN206蛋白质部分来源的)，也用作抗肿瘤剂和生物应答调节剂；干扰素β-1a，一种从含有人干扰素β的人工改造基因的培养中国仓鼠卵巢细胞生产的、由166个氨基酸残基组成的糖基化多肽，也用作抗肿瘤剂和生物应答调节剂；干扰素β-1b，一种从大肠杆菌生产的、由165个氨基酸残基组成的非糖基化多肽，也用作免疫调节剂；干扰素γ-1b,1-139干扰素γ(人淋巴细胞蛋白质部分来源的)，N2-L-Met，用作抗肿瘤剂和免疫调节剂；iroplact，包含71个氨基酸残基、有两个Cys桥的N-甲硫氨酰血小板因子4(人亚单位)；lanoteplase，一种通过缺失纤连蛋白样和EGF样结构域并使Asn117突变为Gln117而从人t-PA衍生得到的组织纤溶酶原激活物蛋白，通过在哺乳动物宿主细胞中编码肽序列的DNA序列的表达而制得，用作纤溶酶原激活物和溶栓剂；包含8个氨基酸和一个二硫键的醋酸兰瑞肽，用作抗肿瘤剂；来诺拉提，一种通过表达来自于人口腔鳞状上皮细胞系-mRNA的人粒细胞集落刺激因子-cDNA而在中国仓鼠卵巢细胞中产生的、由174个氨基酸残基组成的糖蛋白，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂；醋酸黄体瑞林，一种包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；莫拉司亭，一种包含127个氨基酸的集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白质部分来源的)，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂；莫罗德明，一种表皮生长因子(鼠唾液腺)；醋酸那法瑞林，包含9个氨基酸的促黄体激素释放因子(猪)，用作LHRH兴奋剂；nagrestipen，包含69个氨基酸、有两个二硫键的26-L-丙氨酸淋巴因子MiP 1α(人克隆pAT 464炎症巨噬细胞)；胃酶抑制剂，N-(3-甲基-1-氧丁基)-L-Val-L-Val-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酰-L-Ala-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，用作胃蛋白酶抑制剂；pramlintide，一种包含37个氨基酸和有一个二硫键的蛋白质，用作抗糖尿病药；人胰岛素原，包含86个氨基酸残基、有三个二硫键的胰岛素原(猪)，用作抗糖尿病药；沙莫司亭，集落刺激因子2(人克隆pHG25蛋白质部分)，23-L-Leu，一种从酿酒酵母表达的、127个氨基酸残基的单链糖基化多肽，用作抗中性白细胞减少剂和生血刺激剂；天然产生的和合成的、包括重组衍生的人和动物促生长素(生长激素)，尤其是牛和猪促生长素；牛瑞生长素，促生长素(牛来源的)，1-[N2-L-Met-L-α-Asp-L-谷氨酰胺]-，包含191个氨基酸，用作催乳剂，尤其是兽医应用；猪丙氨生长素，促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-丙氨酰-生长激素，总共包含191个氨基酸，用作激素(生长，猪)；人蛋氨生长素，促生长素(人)，N-L-Met-，包含具有两个二硫键的191个氨基酸，用作生长激素；促生长素，一种具有从人脑垂体前叶得到的主要生长刺激激素的正常结构的、包含191个氨基酸的单链多肽，用作生长激素；促生长素，可以以重组形式获得；牛亮氨生长素，促生长素(牛)，127-L-Leu-，牛垂体促生长素中的四个天然产生的分子变体之一，用作催乳剂；猪诺生长素，促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190个氨基酸，用作猪生长激素；牛蛋氨生长素，促生长素(牛)，1-L-Met-127-L-Leu-，包含191个氨基酸，用作兽医生长刺激剂；猪蛋氨生长素，促生长素(猪重组体)C979H1527N265O287S8；塞泊生长素，促生长素(猪重组体)C938H1465N257O278S6；牛度生长素，促生长素(牛重组体)C1020H1596N274O302S9；替普罗肽，缓激肽增效剂B,2-L-Trp-3-去-L-Leu-4-去-L-Pro-8-L-谷氨酰胺-，包含9个氨基酸，用作血管紧张肽转化酶抑制剂；特立帕肽，一种包含34个氨基酸的蛋白质，用作骨吸收抑制剂和骨质疏松症治疗佐剂；thymalfasin，包含28个氨基酸的胸腺素α1(牛)，用作抗肿瘤剂，用于治疗肝炎和传染病，以及用作疫苗增强剂；胸腺喷丁，一种用作免疫调节剂的五肽；曲普瑞林，促黄体激素释放因子(猪)，6-D-Trp，包含10个氨基酸，用作抗肿瘤剂；包含具有一个二硫键的8个氨基酸的伐普肽，用作抗肿瘤剂；包含具有一个二硫键的9个氨基酸的、8-L-Arg-或8-L-Lys-型加压素，用作抗利尿激素；肌红蛋白；血红蛋白；β-乳球蛋白；免疫球蛋白-G(IgG)；抗血友病因子(因子Ⅷ)；溶菌酶；遍在蛋白；血小板活化因子(PAF)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；肿瘤坏死因子-β(TNF-β)；巨噬细胞炎性蛋白(MIP)；肝素；嗜伊红性粒细胞阳离子蛋白(ECP)；重组因子Ⅸ；非何杰金氏B细胞淋巴瘤的单克隆抗体；干扰素α，用于治疗丙型肝炎；和用于治疗创伤和烧伤的成纤维细胞衍生的人造皮肤。
5.按照权利要求1的方法，其中所述能有效推动所述缩合反应实质完成的条件包括(a)能使存在的任何水从液相变为气相或固相由此将所述水从所述缩合反应的所述含水环境除去的那些条件；和(b)能使必需输入所述方法中的能量优化以最有效地将发生缩合反应的所述含水环境中的水，包括所述缩合反应本身产生的水，和起始反应物以及缩合加合终产物分离开的那些条件。
6.按照权利要求5的方法，其中在0℃以上的温度下，所述能使存在的任何水从液相变为气相并能优化输入所述方法的能量的条件包括(a)按照保持所述蛋白质起始反应物和所述缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法包括所述缩合反应的要求，将在所述含水环境中的所述反应混合物加热至最高温度；(b)按照保持所述蛋白质起始反应物和所述缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法包括所述缩合反应的要求，将在所述含水环境中的所述反应混合物细分成最小液滴；和(c)给由此形成的所述液滴提供关于它们所从中通过的惰性气体的最高比速，同时符合保持所述蛋白质起始反应物和所述缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法包括所述缩合反应的要求。
7.按照权利要求6的方法，其中所述将反应混合物细分成液滴是使用一种喷洒器械完成的，该器械包括高压气流发生器和有关的分散装置与高压液压泵装置和有关的喷嘴装置的任何适当的组合。
8.按照权利要求6的方法，其中所述将反应混合物细分成液滴是利用快速旋转的圆盘形式的机械作用实现的，其中，包含所述每一种起始反应物的水流指向该转盘表面的上方，并且所述水流以从所述圆盘的边缘以液滴形式推进的方式通过所述圆盘，这发生在对温度、湿度和压力进行了调节的条件下，以去除已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水，同时也符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并能确保转化为所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
9.按照权利要求5的方法，其中在0℃和0℃以下的温度下，所述能使存在的任何水从液相变为固相并能优化输入所述方法的能量的条件包括(a)将在所述含水环境中的所述反应混合物冷却至温度低到足以使所述含水环境中存在的所有非结合液态水实质冻结的程度，所述温度符合保持蛋白质起始反应物和缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法包括所述缩合反应的要求；(b)使所述由此冷却后的在所述冻结的含水环境中的反应混合物在通入惰性气体的条件下经受降低的压力，同时这符合保持所述蛋白质起始反应物和所述缩合加合终产物的完整性、以及效率和经济最佳地完成所述制备方法包括所述缩合反应的要求。
10.一种包含蛋白质和芳族邻羟基醛的席夫碱缩合加合终产物，它是在能有效地除去已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0％-约99.9％重量、优选约98.0％-约99.0％重量的水的条件下制备的，该制备条件同时符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求，并可确保向所述缩合加合终产物的转化率，即，所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5％重量，优选等于或大于约99.5％重量，以反应物的重量计。
11.按照权利要求10的产物，其中所述芳族邻羟基醛包含一个或多个下式化合物 其中R1和R4独立地选自氢；羟基；卤素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)环烷基；(C2-C6)链烯基；-C(=O)OR7；-OC(=O)R7；-S(=O)2-S(=O)2N(R7)(R9)；-S(=O)2R7；-S(=O)2OR7；-C(=O)NR7R9；-C(=O)R9和-N(R7)(R9)，其中R7是氢或(C1-C4)烷基，R9是(C1-C4)烷基；其中定义R1和R4的所述烷基、环烷基和链烯基可选地被选自以下成员的一个或两个取代基独立地取代卤素；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺酰基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基；X和Y独立地分别是N,CHR2或CHR3，其中R2和R3独立地选自氢；羟基；卤素；硝基；氰基；三氟甲基；(C1-C6)烷基；(C1-C6)烷氧基；(C3-C6)环烷基；(C2-C6)链烯基；-C(=O)OR11；-OC(=O)R11；-S(=O)2；-S(=O)2N(R11)(R13)；和-N(R11)(R13)，其中R11是氢或(C1-C4)烷基，R13是(C1-C4)烷基；并且其中定义R2和R3的所述烷基、环烷基和链烯基可选地被选自以下成员的一个或两个取代基独立地取代卤素；羟基；(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧基；(C1-C2)烷氧基-(C1-C2)烷基；(C1-C2)烷氧羰基；羧基；(C1-C2)烷基羰氧基；硝基；氰基；被(C1-C2)烷基二取代的氨基；磺酰基；和被(C1-C2)烷基二取代的磺酰氨基。
12.按照权利要求11的产物，其中所述芳族邻羟基醛包括邻香草醛；水杨醛；2,3-二羟基苯甲醛；2,6-二羟基苯甲醛；2-羟基-3-乙氧基苯甲醛；或吡哆醛。
13.按照权利要求11的产物，其中所述对动物具有有益活性的蛋白质包括选自上述权利要求4所定义的组中的一个或多个成员。
14.按照权利要求4的方法，其中所述对动物具有有益活性的蛋白质包括从以下成员中选择的一种物质天然产生的猪促生长素；猪丙氨生长素，促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-丙氨酰-生长激素，总共包含191个氨基酸；猪诺生长素，促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190个氨基酸；促生长素(猪重组体)C979H1527N265O287S8；和塞泊生长素，促生长素(猪重组体)C938H1465N257O278S6。
15.按照权利要求13的产物，其中所述对动物具有有益活性的蛋白质包括从以下成员中选择的一种物质天然产生的猪促生长素；猪丙氨生长素，促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-丙氨酰-生长激素，总共包含191个氨基酸；猪诺生长素，促生长素(猪克隆pPGH-1来源的)，N-L-Ala-32-去-L-Glu-33-去-L-Arg-34-去-L-Ala-35-去-L-Tyr-36-去-L-Ile-37-去-L-Pro-38-去-L-Glu-，包含190个氨基酸；促生长素(猪重组体)C979H1527N265O287S8；和塞泊生长素，促生长素(猪重组体)C938H1465N257O278S6。
全文摘要
本发明描述了一种用于制备组分包括对动物具有有益活性的蛋白质和芳族邻羟基醛的席夫碱缩合加合终产物的改良方法,该方法包含使上述组分一起混合在pH7.0或更高pH值下的含水环境中而形成一个反应混合物,反应发生在能通过除去已存在的或在所述缩合反应过程中产生的约97.0%－约99.9%重量、优选约98.0%－约99.0%重量的水来有效地推动所述缩合反应实质完成的条件下,同时符合保持缩合反应物和加合终产物的完整性的要求,并可确保向所述缩合加合终产物的转化率,即,所述缩合加合终产物的收率等于或大于约98.5%重量,优选等于或大于约99.5%重量,以反应物的重量计。优选的芳族邻羟基醛包括邻香草醛;水杨醛;2,3－二羟基苯甲醛;2,6－二羟基苯甲醛;2－羟基－3－乙氧基苯甲醛;或吡哆醛。可以使用的蛋白质种类非常多。该改良方法提供了90%以上的收率,和醛与蛋白质向缩合加合物的基本定量的转化。
文档编号C07K1/107GK1305490SQ99807518
公开日2001年7月25日 申请日期1999年6月2日 优先权日1998年6月26日
发明者B·A·海, M·T·科拉克 申请人:辉瑞产品公司