含有支链淀粉的粉末及其制备方法以及用途的制作方法

专利名称：含有支链淀粉的粉末及其制备方法以及用途的制作方法
含有支链淀粉的粉末及其制备方法以及用途技术领域：
本发明涉及含有支链淀粉的粉末和其制备方法以及用途，具体而言，涉及可不经烦琐的纯化步骤而廉价地制备，并且，示优良的特性的新颖的含有支链淀粉的粉末和其制备方法、以及其用途。背景技术：
支链淀粉是,如所熟知，由属于作为真菌类之一种的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的微生物产生的无色、无臭的水溶性多糖，基本上是麦芽三糖通过α -1, 6键重复键合的直链状的α-葡聚糖。支链淀粉，通常是以水饴等的糖质或淀粉作为碳源而制备的安全、且可食性的多糖。另外，由于具备水溶性、且粘接性强，造膜性优良等的特性，作为食品、药品等的粘结剂或包被材，另外，将可食性膜、染料等的各种成分分散的片、还有，作为封入含有食品或药品领域中使用的功能性成分的颗粒的胶囊等的各种成形物，在以食品为首的，化妆品、药品等广泛的领域中使用。
例如，在特公昭59-4291号公报、特开昭59-111817号公报、及特开平5-285969号公报中公开了支链淀粉膜的制备方法；在特开昭57-155975号公报及特表2009-539719号公报中公开了支链淀粉膜的向食品包装的用途；在专利第3350823号公报中公开了以支链淀粉作为主成分的粘结剂；在特公昭52-6346号公报中公开了使用支链淀粉膜或支链淀粉皮膜的氧化防止方法；在特公昭60-16217号公报中公开了向支链淀粉膜中分散甜味料的膜状膳食甜味料；在特公平7-553号公报及特开2005-21124号公报中公开了向支链淀粉膜中分散药剂等的膜状制剂。另外，在「中村敏、“油化学”、第34卷、第10号、865-871页、1985年」中述对于支链淀粉膜的制备和其利用的概述，在「中村敏、“日本食品科学”、第25卷、第4号、61-67页、1986年」、「中村敏、“食品工业”、第30卷、第10号、株式会社光琳发行、33-39页、1987年」、「田中良直、“包装技术”、第29卷、第8号、852-859页、1991年」、「竹内叶、“ ^、 一〒y夕”、第28卷、第9号、17-19页、2000年」、及「“食的科学”、通卷277号、3月号、株式会社光琳发行、96-99页、2001」年中介绍了作为可食性膜的支链淀粉膜的制法或用途。
本申请人，首先，在特公昭51-36360号公报、特公昭51-42199号公报、及特公昭55-42635号公报中公开，通过在作为碳源含有水饴等的糖质或淀粉部分分解物的培养基中培养属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物，以工业的规模制备支链淀粉及含有支链淀粉的粉末的方法。支链淀粉在上述微生物的培养物中产生，含支链淀粉的培养物通过离心分离或过滤等除去微生物的菌体，根据需要脱色、脱盐之后，加甲醇等的有机溶剂而纯化。即，支链淀粉在甲醇中不溶，但支链淀粉以外的夹杂糖质，通常在水性甲醇中可溶，所以通过向上述培养物加甲醇等的有机溶剂而使支链淀粉沉淀，分离沉淀和上清，可除去夹杂糖质。通过重复此有机溶剂的添加和沉淀和上清的分离的操作而支链淀粉被纯化，可提高其纯度。纯化的支链淀粉经适宜的粉末化步骤而作为含有支链淀粉的粉末。在特开昭48-21739号公报、特公昭55-27099号公报、及特公昭58-50665号公报中公开了使用如上所述纯化、制备的支链淀粉的膜、包被膜、片、胶囊等的成形物的制备方法。
但是，在通过向含有支链淀粉的培养物加有机溶剂而使支链淀粉沉淀，被称为将其与上清分离的溶剂沉淀的支链淀粉的纯化步骤中，大量的有机溶剂是必要的，即便将使用的有机溶剂通过蒸馏等的手段回收，也无法无视用于回收的装置或有机溶剂中要求的费用，有制品成本升高的不适合。另外，被称为添加有机溶剂而使支链淀粉沉淀而分离的纯化操作自体也由于烦琐而耗工，结果，成为使得到的含有支链淀粉的粉末的价格升高的结果。因此，经如上述一样的纯化步骤制备的含有支链淀粉的粉末如，例如，「中村敏、“油化学”、第34卷、第10号、865-871页、1985年」、「中村敏、“日本食品科学”、第25卷、第4号、61-67页、1986年」、「中村敏、“食品工业”、第30卷、第10号、株式会社光琳发行、33-39页、1987年」、及特公昭60-49164号公报中所记载，止于“试剂用支链淀粉”、或者成分子量测定时的分子量标准的“支链 淀粉标准样品”、在药品领域中的“血浆增量剂”等的特殊用途中使用。顺便而言，作为由支链淀粉组成的分子量标志物，在专利第3012917号公报中公开通过使用酰胺键型氧化硅填充柱的顺相分配模式的高效液相层析分离、纯化的支链淀粉。
鉴于上述的事情，本申请人，在专利第3232488号公报中公开，通过调节培养条件，不经由溶剂沉淀的纯化步骤，将每固体物的支链淀粉含量提高至约50质量％以上、优选至约55 90质量％的支链淀粉高含有物和其制备方法以及用途。由于此支链淀粉高含有物不经由溶剂沉淀的烦琐的纯化步骤制备，有可简便地制备、且廉价的益处。另外，本申请人，在专利第4203322号公报中公开了通过含有α，α _海藻糖而提高对湿度变化的稳定性的支链淀粉高含有物和其用途；在特开2003-96103号公报中公开了通过均质地含以葡萄糖作为构成糖的非还原性糖质而提高对湿度变化的稳定性的含有支链淀粉的粉末；在特开2004-261132号公报中公开了使用支链淀粉分解酶分解支链淀粉而制备质量平均分子量/数平均分子量的比降低的支链淀粉的方法。
其后，本申请人再发展上述专利第3232488号公报中得到的见解，不经由溶剂沉淀的纯化步骤而开发了支链淀粉含量提高至90质量％以上的含有支链淀粉的粉末，作为在食品、药品、化妆品中广用的含有支链淀粉的粉末，将被称为“ΡΙ_20”(株式会社林原商事销售)、及“PF-20”(株式会社林原商事销售)的2种的含有支链淀粉的粉末制品化(参照「中村敏、“油化学”、第34卷、第10号、865-871页、1985年」、「中村敏、“日本食品科学”、第25卷、第4号、61-67页、1986年」、及「中村敏、“食品工业”、第30卷、第10号、株式会社光琳发行、33-39页、1987年」)。这2种含有支链淀粉的粉末，其后，统合为与“ΡΙ-20”大致是同等品的“食品添加物支链淀粉”(株式会社林原商事销售)，现在此“食品添加物支链淀粉”在市售。“食品添加物支链淀粉”的粘接力、附着力、被膜性、润滑性优良，同时安全，并且，比较廉价，因此作为广用的含有支链淀粉的粉末，作为食品用的增粘剂、粘接剂、粘着剂、被膜齐U，加工成膜状，瞬时溶于水的无地膜，或作为使用可食性墨印刷的印刷膜、将食品、香料等混合的混合膜等，在广泛的领域中使用。
但是，根据本发明人得到的其后的见解，上述“食品添加物支链淀粉”尽管有各种优良的特性，使用其制备的支 链淀粉膜，也有由于其厚度，曲折，或湾曲等而产生应力集中位置，则经时从其应力集中位置破裂或断裂，从而不适宜使用的缺点。另外，上述“食品添加物支链淀粉”尽管支链淀粉含量达90质量％以上，但支链淀粉含量或含的支链淀粉的分子量分布在每制备批中不恒定，有难得到在溶解性或粘结力等的方面品质一定的产品的缺点。即，根据本发明人所确认，在“食品添加物支链淀粉”中的支链淀粉含量尽管在90质量％以上，但通常、在每制备批中在约90 96质量％的范围内变动。伴随此变动，所含的支链淀粉以外的夹杂糖质的含量也在约4 10质量％左右的范围内变动，如果夹杂糖质的含量有2倍以上的变动幅，则当然会对含有支链淀粉的粉末的溶解性或粘结性等产生影响，就会有难得到在溶解性或粘结力等的方面品质一定的产品的问题。同样地，如果所含的支链淀粉的分子量分布有变动，则会对含有支链淀粉的粉末中含的支链淀粉自体的溶解性或粘结力产生影响，随着夹杂糖质含量的变动，含有支链淀粉的粉末的溶解性或粘结力会变动。因此，将“食品添加物支链淀粉”在以膜为首的成形物中使用之时，得到的成形物的强度、溶解性、崩解性等的性质，在极端的情况中，在“食品添加物支链淀粉”的每制备批中会不同。例如，药品要求施用之后的有效成分的吸收、分布、代谢、排泄等的在活体内的动态恒定，其中使用的药品添加物不对药品的药理作用产生影响而体内动态必需维持稳定，但在将以往的“食品添加物支链淀粉”作为药品添加物，例如作为药品的锭剂等的粘结剂使用之时，有效成分的溶出的速度在每制品不恒定，给在活体内的药物动态带来影响。如此，“食品添加物支链淀粉”，无论是作为食品用，还是作为要求强度或溶解性、粘结力等的性质恒定、且药效成分的体内动态常恒定的药品用、或者准药品用或化妆品用等的添加物，都说不上是必然充分。使支链淀粉，或含有支链淀粉的成形物的用途不停留于食品，而为了扩大到食品以外的药品、准药品、化妆品等，要求每制品无偏差的恒定、且一定的品质的制品的提供的领域，另外，即便是食品等的从以往就使用“食品添加物支链淀粉”的领域，为了再扩大到相比支链淀粉膜等的含有支链淀粉的成形物要求更高的强度的用途，解消作为广用的含有支链淀粉的粉末的“食品添加物支链淀粉”具有的上述的缺点是不可或缺的。
发明内容
本发明旨在解消以往的含有支链淀粉的粉末具有的上述的缺点，不经由溶剂沉淀等的烦琐的纯化步骤而制备，并且，在成形为膜之时示相比以往品更高的断裂强度，同时有将夹杂糖的含量稳定维持到极其少的水平的一定的组成，优选为，旨在提供所含的支链淀粉的分子量分布在一定的范围内的含有支链淀粉的粉末和其制备方法、以及那样的含有支链淀粉的粉末的用途。
本发明人在为了解决上述课题而重复锐意研究，在重复各种试行错误之中发现，在从属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物人为地创制的变异株之中，在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的选择培养基中培养之时，尽管支链淀粉的生成量与亲本株是同程度，但支链淀粉以外的糖质、即夹杂糖质的比例相比亲本株更显著地少的几种变异株。在这些的变异株之中，选择夹杂糖质的比例最少的变异株，将其在含有葡萄糖及麦芽糖作为碳源的培养基中培养，从该培养物，不经使用有机溶剂使支链淀粉沉淀的由溶剂沉淀的纯化步骤，基于常规方法制备含有支链淀粉的粉末时，尽管微少含有作为属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的代谢产物的甘露糖醇,但得到夹杂糖质含量相比上述“食品添加物支链淀粉”显著地更少的含有支链淀粉的粉末。使用此含有支链淀粉的粉末通过常规方法成形支链淀粉膜时，其断裂强度相比上述使用“食品添加物支链淀粉”得的支链淀粉膜显著地更高。再者，此含有支链淀粉的粉末，无关于制备批，夹杂糖质含量稳定地维持在极其少的水平，糖质组成大致一定，同时所含的支链淀粉的分子量分布稳定地在一定的范围内，所以不仅上述断裂强度，在对水的溶解性或将其他物质相互结合的粘结力等的方面也常可期待一定的品质，例如，在成形为膜、片、锭剂、颗粒等的药品、准药品、化妆品等中使用的成形物时，可在強度、溶解性、崩解性等的性质面维持一定的品质。从而，可得到有药品、准药品、化妆品等中要求的一定、且恒定的性质的成形物，特别是即便在药品中使用，也无由于溶解性或崩解性的偏差等给有效成分的体内动态带来影响的担忧，所以此含有支链淀粉的粉末也可作为药品添加物使用。本发明基于这些见解完成。即，本发明通过提供含有支链淀粉的粉末解决上述的课题，所述含有支链淀粉的粉末特征在于，是不经从将属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的培养基中培养而得到的培养物除去夹杂糖质的步骤而制备的含有支链淀粉的粉末，含在75容积％水性甲醇中不溶的支链淀粉级分和可溶的夹杂糖质级分，基于蒽酮-硫酸法求出的，相对于粉末全体中含的全糖质含量的夹杂糖质级分中含的夹杂糖质含量的比例是3质量％以下，同时含有甘露糖醇。本发明的含有支链淀粉的粉末，如上所述，以相对于粉末全体中含的全糖质含量的夹杂糖质级分中含的夹杂糖质含量的比例是3质量％以下而极其少作为大的特征，上述全糖质含量及上述夹杂糖质含量均基于蒽酮-硫酸法求出。蒽酮-硫酸法，如众所周知，是利用由蒽酮的呈色反应的糖质的定量方法，由该呈色反应的吸光度作为与糖质的量成比例的值得到，所以可基于该值測定糖的量。再有，在定量以葡萄糖作为构成糖的糖质时，可通过将D-葡萄糖作为标准物质使用而作为D-葡萄糖換算量求出。蒽酮-硫酸法，在“食品添加物公定书”(第8版)、日本食品添加物协会发行、2007年、572-573页(“支链淀粉”的项)中，也作为在支链淀粉的纯度试验中的“单糖类及少糖类”的測定方法被采用。上述“食品添加物公定书”记载的方法是作为在斯界中的支链淀粉纯度的測定方法广泛被认知的标准的方法，所以在本发明中，如后述的实验2 3所示，以上述“食品添加物公定书”记载的“单糖类及少糖类”的測定方法作为基准，求出相对于粉末全体中含的全糖质含量的夹杂糖质含量的比例。但是，在糖质之中，例如，如后述的甘露糖醇一祥，存在在蒽酮-硫酸法中不呈色，无法检测的糖质 ，基于蒽酮-硫酸法求出的全糖质含量及夹杂糖质含量虽然不必然对应于严格意义上的全糖质含量及夹杂糖质含量，但在本说明书中，只要未特别说明，将基于蒽酮-硫酸法求出的全糖质含量简称为“全糖质含量”、将基于蒽酮-硫酸法求出的夹杂糖质级分中的夹杂糖质含量简称为“夹杂糖质含量”。顺便而言，在含有支链淀粉的粉末中的支链淀粉含量是将在支链淀粉级分中的支链淀粉含量，以夹杂糖质含量为基准，基于蒽酮-硫酸法求出也可，但本发明的含有支链淀粉的粉末是由支链淀粉级分和夹杂糖质级分组成的粉末，所以可通过从上述全糖质含量减算上述夹杂糖质含量来更简便地求出。从而，在本发明的含有支链淀粉的粉末中，如果相对于全糖质含量的夹杂糖质含量的比例在3质量％以下，在支链淀粉级分中的支链淀粉含量成为全糖质含量的97质量％以上。再有，在此支链淀粉含量中，当然，不含在如甘露糖醇ー样的蒽酮-硫酸法中检测不到的糖质的量。如此，在本发明的含有支链淀粉的粉末中尽管含夹杂糖质，但其量最大也就是全糖质含量的3质量％，是极其少量，所以假设，即便夹杂糖质含量在从超过0质量％到3质量％的范围变动,相对于其余的97质量％以上的支链淀粉的变动比例小，作为全体，在本发明的含有支链淀粉的粉末中的全糖质组成是大致一定的。另外，本发明的含有支链淀粉的粉末，如上所述，以含有甘露糖醇作为另一大的特征。甘露糖醇虽然依赖于培养中使用的碳源的种类，但通常是作为属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的代谢产物在培养物中含的物质。但是,甘露糖醇可溶于水性甲醇，所以在培养物由使用有机溶剂的溶剂沉淀被纯化之时被除去。从而，甘露糖醇不被除去而在粉末中含有示，本发明的含有支链淀粉的粉末是不经通过使用有机溶剂的溶剂沉淀等除去夹杂糖质的步骤而制备的含有支链淀粉的粉末。在所述含有支链淀粉的粉末中通常存在以无水物换算计2质量％左右的不由蒽酮-硫酸法呈色而无法检测的糖质成分，其主成分是甘露糖醇。顺便而言，甘露糖醇的量可，例如，通过后述的实验4所示的高效液相层析(HPLC)分析求出。由上述HPLC分析的甘露糖醇的检测限界通常被认为是0.01质量％左右，所以本发明的含有支链淀粉的粉末含有甘露糖醇是指在粉末中含有以无水物换算计0.01质量％以上的甘露糖醇。另外，虽然也依赖于培养中使用的碳源的种类，但本发明的含有支链淀粉的粉末中含的甘露糖醇的含量，通常不超过以无水物换算计2质量％。再有，甘露糖醇是在75容积％水性甲醇中可溶，所以通常含在夹杂糖质级分中，如前所述，由于用蒽酮-硫酸法检测不到，所以在上述夹杂糖质含量中不含。如上所述，本发明的含有支链淀粉的粉末含有甘露糖醇，即便是不经通过使用有机溶剂的溶剂沉淀等除去夹杂糖质的步骤制备的含有支链淀粉的粉末，夹杂糖质含量是全糖质含量的3质量％以下，是极其少量。如此又含甘露糖醇,并且,夹杂糖质含量是极其少量的含有支链淀粉的粉末，据本申请人所知，在本申请申请前不存在，是新颖的含有支链淀粉的粉末。本发明的含有支链淀粉的粉末，成形含有支链淀粉的粉末而得到的厚度IOOiim的膜、更具体而言，将含有支链淀粉的粉末的20质量/容积％水溶液在平板上流延之后，于25°C干燥，再在相対湿度22%的气氛调湿而得`到的厚度100 u m的膜，在使用截面积Imm2的突刺试验用适配体进行的突刺強度试验中，显示20MPa以上的突刺断裂強度。此突刺断裂強度，如通过后述的实验示，相比使用上述“食品添加物支链淀粉”得到的支链淀粉膜更显著地高，本发明的含有支链淀粉的粉末即便是不经由溶剂沉淀等的支链淀粉的纯化步骤制备的，说起来是“广用品”，示成形为膜时，有突刺断裂強度大的优良的特性。另外，本发明通过提供含有支链淀粉的粉末的制备方法解决上述的课题，所述方法的特征在于包括将属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的培养基中培养的步骤、将得到的培养物除去菌体、脱色、脱盐、浓缩、及粉末化的步骤，不包括夹杂糖质的除去步骤。本发明的制备方法中使用的属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株只要可不经夹杂糖质的除去步骤，制备本发明的含有支链淀粉的粉末，则是何变异株均可，不特别限定，例如，作为其适宜的一例，可举出后述的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)S-2株(专利生物保藏中心保藏号FERM BP-11261)的变异株。这样的变异株，基于本说明书的公开，以S-2株作为亲本株，可通过向其适用惯用的变异方法和后述的实验中所述的筛选方法得到。即，如后述的实验I所示，将S-2株用惯用的变异方法随机地变异，对得到的变异株在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的培养基中培养之时，以培养物中含的支链淀粉以外的夹杂糖质的含量作为指标进行筛选，选择其含量相比作为亲本株的S-2株更显著地少的即可。
在如上述一祥得到的变异株之中，作为可适宜地使用的变异株之一例，可举出例如，变异株MA446株(专利生物保藏中心保藏号FERMBP-11250)。本发明的含有支链淀粉的粉末是不经溶剂沉淀等的烦琐的纯化步骤制备的廉价的含有支链淀粉的粉末，且成形为膜的时，有得到突刺断裂强度大，所以例如，作为支链淀粉膜，可在更宽的用途中使用的益处。另外，根据本发明的含有支链淀粉的粉末的制备方法，得到可不要求溶剂沉淀等的烦琐的纯化步骤，简便并且廉价地，制备具备如上述一祥的优良的益处的含有支链淀粉的粉末的益处。另外，本发明通过提供将本发明的含有支链淀粉的粉末在至少原料的一部分中使用而制备的含有支链淀粉的成形物来解决上述的课题。即，本发明的含有支链淀粉的粉末，如上所述，即便是不经由溶剂沉淀等的支链淀粉的纯化步骤制备的，说起来是“广用品”，在成形为膜之时，有突刺断裂強度大的优良的特性。而且，本发明的含有支链淀粉的粉末的夹杂糖质含量是3质量％以下，极其低，有高的支链淀粉纯度，即便制备批不同，糖质组成也维持在大致一定，同时优选为，所含的支链淀粉的分子量分布在于一定的范围内，所以断裂强度自不用说，溶解性或粘结カ等的性质也变动或偏差少，可作为药品添加物，在要求有效成分的体内动态常常一定的药品、准药品、化妆品等中使用。作为药品等中使用的形态，不仅膜，可作为用于例如，作为片、锭剂、颗粒、纤维等的成形物，或者，作为包被剂、糖衣剂、赋形齐U、粘着剂等，还有，作为液剂使用的即时溶解型的固体制剂，可得到有药品、准药品、化妆品等要求的一定、且恒定的性质的成形物。尤其是，在药品中使用之时，本发明的含有支链淀粉的粉末在溶解速度或崩解速度、断裂強度等的性质面，每制品无偏差，无由溶解性或崩解性的偏差等给有效成分的体内动态带来影响的担忧，所以可作为药品添加物使用。再有，本发明的含有支链淀粉的粉末也可通过由在药品制备中一般使用的公知的方法作为无热原的，而作为用于在注射剂等中使用的即时溶解型的固体制剂的原料使用。

图1是使本发明的含有支链淀粉的粉末的水溶液经历凝胶渗透层析而得到的溶出图。图2是使“食品添加物支链淀粉”的水溶液经历凝胶渗透层析而得到的溶出图。图3是使本发明的含有支链淀粉的粉末的75容积％水性甲醇可溶的夹杂糖质级分的水溶液经历凝胶渗透层析而得到的溶出图。图4是使“食品添加物支链淀粉”的75容积％水性甲醇可溶的夹杂糖质级分的水溶液经历凝胶渗透层析而得到的溶出图。图5成形在本发明的含有支链淀粉的粉末而得到的膜的由放射光的X射线小角散射分析中，散射角2 0的范围是0.001 0.1°的回折图。图6成形在本发明的含有支链淀粉的粉末而得到的膜的由放射光的X射线小角散射分析中，散射角20的范围是0.01 2°的回折图。实施方式本发明的含有支链淀粉的粉末，如前所述，是具有如下特征的含有支链淀粉的粉末，其为不经从将属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的培养基中培养而得到的培养物除去夹杂糖质的步骤而制备的含有支链淀粉的粉末，含在75容积％水性甲醇中不溶的支链淀粉级分和可溶的夹杂糖质级分，相对于粉末全体中含的全糖质含量的夹杂糖质含量的比例是3质量％以下，同时含有甘露糖醇。再有，75容积％水性甲醇是指将水和甲醇以容积比1:3混合的混液。属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株只要可不经从其培养物，除去夹杂糖质的步骤而制备本发明的含有支链淀粉的粉末，是何变异株都可。作为所使用的亲本株，可使用例如，作为「上田诚之助、“エ业化学杂志”、第67卷、757-760页、1964年」中记载的支链淀粉产生菌的芽霉属(Pullulariasp.)S-2株。再有，芽霉(Pullularia)属现在被分类为短梗霉(Aureobasidium)属，在短梗霉(Aureobasidium)属中，仅知出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) I种。S-2株产生支链淀粉,另外,如后所述，与出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)有极好的一致的培养性状,所以被鉴定为是属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物,在茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6所在的独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心中，于2010年6月28日，以保藏号FERMBP-11261保藏。为了得到 本发明中所使用的属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株，在上述S-2株中实施，例如，「杉山纯多等編、“新版微生物化学实验法”、株式会社讲谈公司Scientific、1999年3月20日发行、126-133页」中记载的，由紫外线照射或变异剂的药剂处理等的本领域中通常进行的突变处理而得到变异株、对于得到的变异株，以在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的培养基中培养之时培养物中含的支链淀粉以外的夹杂糖质的含量作为指标进行筛选，选择其含量相比作为亲本株的S-2株更显著地少的即可。在后述的实验I中，详述筛选的方法之一例。作为本发明中使用的变异株，在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的选择培养基中培养之时，培养物中含的支链淀粉以外的夹杂糖质的含量优选相比将作为亲本株的S-2株在同培养基中培养之时更低，更优选是成将作为亲本株的S-2株在同培养基中培养之时的50%以下。如上所述，本发明的含有支链淀粉的粉末绝对不限于由特定的变异株的培养物制备的，作为可制备本发明的含有支链淀粉的粉末的适宜的变异株的具体例，可举出对上述出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) S-2株实施突变而得到的变异株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) MA446株。变异株MA446株与作为亲本株的S-2株同样产生支链淀粉，另外，如后所述，与出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)有极良好一致的培养性状，所以被鉴定为是属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物,在茨城县筑波市东I 丁目I番地I中央第6所在的独立行政法人产业技术综合研究所、专利生物保藏中心中，于2010年4月30日以保藏号FERM BP-11250进行保藏。顺便而言，作为亲本株的S-2株及变异株MA446株的培养性状如下。〈S-2株及变异株MA446株的培养性状>在马铃薯右旋糖琼脂培养基(马铃薯浸出液末4.0g、葡萄糖20.0g、琼脂15.0g、纯化水1，000ml、pH5.6)上于27°C好氧地培育，产生暗黒色的染料。不确认到变形而移动的样子或子实体的形成。观察不到有性生殖，在菌丝中确认隔壁。在培育约4天往后，形成单性房状出芽型的分生子，从直链状的菌丝尖端或中间发生出芽型分生子。成熟的分生子作为单胞存在，无色、滑面。作为变异株的培养中使用的培养基，只要是基本上，培养后，培养基中含的夹杂糖质的含量少，可不经从培养物夹杂糖质的除去步骤，制备本发明的含有支链淀粉的粉末，就不特别限制，与为了支链淀粉产生而培养属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物中使用的培养基同样地，可使用适宜含有碳源、氮源、有机营养源、无机物质等的培养基。作为碳源，使用含有葡萄糖及麦芽糖的糖质混合物，优选为，含有葡萄糖及麦芽糖的右旋糖ー当量(以下，表示为“DE”)50 90的糖质、更优选为，使用各自以无水物换算计10质量％以上含有葡萄糖及麦芽糖的糖质。在作为碳源缺少葡萄糖或麦芽糖之任何或双方时，培养物的夹杂糖质的含量不变那么低，制备本发明的含有支链淀粉的粉末变得困难。另夕卜，在作为碳源所使用的糖质的DE不足50或超90之时，支链淀粉的生成不变少，在得到的含有支链淀粉的粉末中的支链淀粉的含量降低，相对夹杂糖质的含量増加，所以不喜好。再有，培养基中的碳源的浓度作为5 20质量/容积％是优选的。

作为氮源，使用选自铵盐、硝酸盐等的无机氮源或谷氨酸盐、胨、酵母提取物、玉米浆等的有机氮源等的I种或2种以上。此外，作为无机物质，适宜使用磷酸盐、镁盐、铁盐等。培养在通气下搅拌或振荡而好氧地进行是优选的。作为培养温度，适宜于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的培育的27°C是适宜的。作为培养时间，碳源被消费，支链淀粉的产生量变得大致最大，夹杂糖质的含量降低而至成大致一定是优选的。另外，根据需要，为了增大支链淀粉的产生量或作为所望的分子量，通过向培养基添加适宜的PH调节齐U，或间歇或连续地移出培养液而适宜供给ー补足新鲜的营养培养基来调节培养液的稀释速度下进行连续培养也可。从如上述一样得到的培养物，通过离心分离或过滤等的惯用的适宜的方法除去菌体，可得到含支链淀粉的培养上清。将得到的培养上清通过由常规方法，脱色、脱盐、浓縮、干燥、粉末化，可得到本发明的含有支链淀粉的粉末。作为脱色处理，通常进行使用粉末活性炭的过滤。另外，在脱盐处理中，通常、使用阳离子交换树脂及阴离子交换树脂。作为阳离子交换树脂，可适宜使用例如，“ DIAIONPK218”(三菱化学株式会社制备)或，“DIAION SK-1B”(三菱化学株式会社制备)等，作为阴离子交换树脂，可适宜使用“DIAION WA30”(三菱化学株式会社制备)或，“AmberliteIRA411”(有机株式会社销售)等的市售的离子交换树脂。干燥及粉末化基于常规方法进行即可，例如，干燥后，将得到的块粉碎而粉末化也可，由喷雾干燥法同时进行干燥和粉末化也可。如上述一样得到的本发明的含有支链淀粉的粉末，其相对于粉末全体中含的全糖质含量的夹杂糖质含量是3质量％以下，換言之，支链淀粉含量稳定为97质量％以上，更优选为，相对于粉末全体中含的全糖质含量的夹杂糖质含量是I质量％以下，換言之，支链淀粉含量极其稳定为99质量％以上，并且,含有甘露糖醇。顺便而言，在本发明的含有支链淀粉的粉末中，在夹杂糖质级分中的夹杂糖质中，含葡萄糖聚合度3 90的糖质。葡萄糖聚合度3 90的糖质是指，具体而言，如后述的实验4中记载，使在含有支链淀粉的粉末的75容量％水性甲醇中可溶的夹杂糖质级分经历凝胶渗透层析(以下，简称为“GPC”)之时，相当于葡萄糖聚合度3 90的分子量、S卩，考虑到在由GPC求出的平均分子量中含一定的误差，是在分子量500 15，000道尔顿的范围检测的成分。
在本发明的含有支链淀粉的粉末中，上述的葡萄糖聚合度3 90的糖质的含量在粉末全体中含的全糖质含量的2质量％以下是优选的。葡萄糖聚合度3 90的糖质的含量超2质量％，则在成形为膜之时，有得不到所期的突刺断裂強度的情况而不喜好。顺便而言，上述葡萄糖聚合度3 90的糖质，当向其作用支链淀粉酶之吋，作为主成分生成麦芽三糖和少量的麦芽四糖，所以被认为是有基本上麦芽三糖以a-1，6结合聚合的支链淀粉样的结构的糖质。但是，尽管此糖质有支链淀粉样的结构，但是在75容积％水性甲醇中可溶的低分子量的糖质。如前所述，尽管依赖于培养基中使用的碳源的种类，在属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的培养物中，通常含作为所述微生物的代谢产物的甘露糖醇。甘露糖醇在75容积％水性甲醇中可溶，只要不由溶剂沉淀等进行夹杂糖质的除去，含在从上述培养物制备的含有支链淀粉的粉末中。从而，含有支链淀粉的粉末中含甘露糖醇示，所述含有支链淀粉的粉末不经由溶剂沉淀等的夹杂糖质的除去步骤而制备。如前所述，甘露糖醇在蒽酮-硫酸法中检测不到，但含有支链淀粉的粉末中的甘露糖醇的量可例如由后述的实验4中所使用的高效液相层析(HPLC)分析求出。在本发明的含有支链淀粉的粉末中的甘露糖醇的量是以无水物换算计，通常、含有支链淀粉的粉末的0.04质量％以上，不超2质量％。作为本发明的含有支链淀粉的粉末的主成分的支链淀粉的分子量只要在成形为膜之时得到期望的突刺断裂強度，就不特别限制，但作为基于GPC分析的质量平均分子量(以下，表示为Mw)在约50,000 1，000，000道尔顿是优选的，在约50,000 500,000道尔顿是更优选的。Mw低于50，000道尔顿，则成形为膜变得困难而不喜好，另外，高于1，000, 000道尔顿，则其水溶液的粘度变得过高而有发生难处理的问题之吋。另外，从属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的培养物，经脱色、脱盐、浓缩、干燥、及粉末化步骤，在不经溶剂沉淀等的夹杂糖质的除去步骤制备的含有支链淀粉的粉末中，对成为 分子量分布的指标的支链淀粉的数平均分子量(以下，表示为Mn)的Mw的值(即Mw/Mn)通常成约10 70。在本发明的含有支链淀粉的粉末中，Mw/Mn的值只要在成形为膜之时得到期望的突刺断裂強度，就不特别限制，但100以下是适宜的，更适宜在约10 70的范围是优选的。Mw/Mn的值超100，即分子量分布更宽时，则造膜性不稳定而成形为膜之时难稳定地得到突刺断裂強度高的膜。本发明的含有支链淀粉的粉末是白色、且粉末而流动性优良，与以往的含有支链淀粉的粉末同样示对水良好的溶解性。本发明的含有支链淀粉的粉末可根据用途，其他材料、例如，选自支链淀粉以外的多糖类、增量剂、赋形剂、填充剂、增粘剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、PH调节剂、稳定剂、难燃剂、离形剂、抗菌剂、着色剂、着香剂、营养物、嗜好物、呈味物、药效物质及生理活性物质的I种或2种以上的，在食品、药品、准药品及化妆品领域一般使用的成分混合使用。另外，本发明的含有支链淀粉的粉末在作为成形物的具体例成形为膜之时突刺断裂强度优良，与以往的含有支链淀粉的粉末有同样的良好的溶解性，且作为膜的使用耐性优良，所以可作为食品、药品、及化妆品等的领域中使用的膜、片或包被的原材料有利地利用。再有，将本发明的含有支链淀粉的粉末成形为膜等之时，作为剥离剂可使用含蔗糖脂肪酸酯等的糖脂肪酸酷的表面活性剤。另外，本发明的含有支链淀粉的粉末，如上所述，共具对水的良好的溶解性和成形为膜等之时高的強度，而且，全糖质中的夹杂糖质含量是3质量％以下，且支链淀粉含量是97质量％以上，即支链淀粉纯度高，糖质组成大致一定，而且，所含的支链淀粉自体的分子量分布稳定而在一定的范围内，所以在将其在成形物中使用之时，可期待给所述成形物带来常常一定的強度或溶解速度、崩解速度。从而，本发明的含有支链淀粉的粉末可在不仅食品，作为药品添加物，要求有效成分的体内动态常常一定的药品、准药品、化妆品等中使用，膜自不必说，可作为作为片、纱布或手术丝等中使用的纤维等的成形物，或者，作为制备锭剂或颗粒剂之时的赋形剂、粘结剂或包被剂等，还有，用于作为液剂使用的即时溶解型的固体制剂。在如此得到的化妆品、药品、及准药品中，有每制品无偏差的稳定、且恒定的之一定的品质，特别在药品中，无由溶解性或崩解性的偏差等而给有效成分的体内动态带来影响的担忧。 在将本发明的含有支链淀粉的粉末在至少原料的一部分中使用而制备的成形物中，本发明的含有支链淀粉的粉末以外，可适宜配合在各自的领域中广用的各种成分。在上述成形物是化妆品或其中间制品之时，可作为包装、罩、浴用剂、口中清凉膜等的形态，可将例如，对氧基安息香酸酷、氯化苯扎铵、戊烷ニ醇等的防腐剤、熊果苷、鞣花酸、四氢类姜黄素、维生素P等的美白剂、甘草酸、甘草提取物等的抗炎症剂、乳铁蛋白、硫酸软骨素、透明质酸、感光素101号、感光素301号等的细胞赋活剂、弾性蛋白、角蛋白、尿素、神经酰胺等的保湿剂、角鲨烷、凡士林、三-2-こ基己酸鲸蜡酯等的油剂、角叉菜胶、羧甲基纤维素、豆角胶、羧基こ烯基聚合物等的水溶性高分子、1，3-丁ニ醇、聚こニ醇、丙ニ醇、山梨糖醇、麦芽糖醇等的醇类等，各自I种或2种以上、単独或适宜组合而配合。另外，在上述成形物是药品或准药品或其中间制品之时，可作为颗粒、锭剂、糖衣锭等的形态，可将例如，硫唑嘌呤、环孢菌素、环磷酰胺、甲氨喋呤、他克莫司水和物、白消安等的免疫抑制剂、卡培他滨、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、多西他赛、伊马替尼甲磺酸盐、5-氟尿嘧啶、阿那曲唑、泰素、他莫昔芬、多西他赛、羟基脲等的抗癌剂、阿巴卡韦硫酸盐、扎西他滨、去羟肌苷、泛昔洛韦、利巴韦林等的抗病毒剂、阿莫西林、酞氨西林、头孢克月亏、磺胺甲ニ唑、左氧氟沙星水和物、头孢卡品匹伏盐酸盐水和物、头孢托仑匹伏、克拉霉素等的抗生物质、醋氨酚、阿司匹林、こ水杨胺、水杨酸甲酯等的解热镇痛剂、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松等的类固醇剂、干扰素-a、、胰岛素、缩宫素、生长激素、等的蛋白或肽、BCG疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、脊髄灰质炎疫苗、痘苗、破伤风类病毒、毒蛇抗毒素、人免疫球蛋白等的生物学制剂、视黄醇、硫胺素、核黄素、吡哆素、氰基钴胺、L-抗坏血酸、类胡萝卜素、麦角留醇、生育酚、生物素、降钙素、辅酶Q、a-硫辛酸、烟酸、甲基萘醌、泛醌、吡咯并醌喹啉等的维生素剂或它们的衍生物、高丽人參提取物、芦荟提取物、蜂胶提取物、甘草提取物、桂皮提取物、獐牙菜提取物等的生药提取物等，各自I种或2种以上、单独或适宜组合而配合。可将上述的化妆品、药品、及准药品等，在各种成形物或其中间制品中，在不脱离本发明的效果的范围内，作为再改善柔软性或強度的目的，根据需要，化妆品、药品、及准药品等的领域中通常使用的其他高分子物质、适宜的塑化剂、或者赋形剂等的其他成分与本发明的含有支链淀粉的粉末联用，在以其他赋形剂作为主体的成形物中，将本发明的含有支链淀粉的粉末作为粘结剂使用也可。作为高分子物质，可举出含角叉菜胶、黄原胶、羧甲基纤维素、纤维素、半纤维素、阿拉伯胶、瓜尔胶、角叉菜胶、果胶、壳多糖、琼脂糖、糊精、直链淀粉及化工淀粉的淀粉等的多糖类或它们的衍生物、明胶或酪蛋白等的蛋白质等。作为塑化剂，可使用山梨糖醇、麦芽糖醇、海藻糖、甘油、聚こ烯基醇、聚こニ醇或丙ニ醇等的多元醇。作为赋形剂，可使用麦芽糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、蔗糖、麦芽糖、乳糖、a，a-海藻糖、a，P -海藻糖、阿拉伯胶、玉米淀粉、结晶纤维素等的糖质、氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化钡、硫酸钙、亚硫酸钙、碳酸钙、氧化硅、硅酸钙、碱基性碳酸镁、高岭土、滑石等的无机物。尤其是，a，a-海藻糖有抑制由有效成分的氧化分解等的变性，稳定保持活性的作用，所以可作为稳定化剂有利地利用。以下，通过实验详细地说明本发明。<实验1:支链淀粉产生菌的变异株的取得>向出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) S-2株的分生子实施由紫外线照射的突变处理，播种到马铃薯右旋糖琼脂平板，于27°C培养而将培育的集落作为变异株分离。将分离的变异株及作为亲本株的S-2株，各自，在含有以酸糖化水饴(DE48、以无水物换算计含有葡萄糖约27%、麦芽糖约17%、株式会社林原商事销售)作为固体分10.0质量/容积％、磷酸氢ニ钾0.2质量/容积％、胨0.2质量/容积％、氯化钠0.2质量/容积％、硫酸镁7水和物0.04质量/容积％、及硫酸亚铁7水和物0.001质量/容积％的液体选择培养基(pH7.0)中植菌,于27°C振荡培养3天。将从各自的培养物通过离心分离除去菌体而得到的培养上清用水稀释10倍。取各自的一部分，向它们加3倍量的甲醇(试剂特级、和光纯药エ业株式会社制)而作为75容积％水性甲醇，通过充分混和而将支链淀粉沉淀之后，将离心分离得到的上清再用水稀释10倍 的作为夹杂糖质测定用的试验液。再有，该试验液是培养上清被稀释400倍的。另行，将浓度0.01质量/容积％的葡萄糖水溶液作为标准液利用，水作为空白对照，对各试验液，根据“食品添加物公定书”(第8版)、日本食品添加物协会发行、2007年、572-573页(“支链淀粉”的项)中记载的方法，引起基于蒽酮-硫酸法的呈色反应，使用分光光度计测定在波长620nm的吸光度，由下述的式I，求出在培养上清中的夹杂糖质浓度(%)。另外，将上述的培养上清的10倍稀释液再用水稀释100倍的作为全糖质测定用的试验液，与上述同样地引起基于蒽酮-硫酸法的呈色反应，測定在波长620nm的吸光度，由下述的式2，求出在培养上清中的全糖质浓度(％)。通过由下述的式3，从全糖质浓度减夹杂糖质浓度来求出支链淀粉浓度(％)。式1:夹杂糖质浓度(％)= [ {(Ak-Ao) X 400} / {(As-Ao) X 100} ] X 100其中，Ak:夹杂糖质测定用的试验液的吸光度、As:标准液的吸光度、Ao:水(对照)的吸光度。式2:全糖质浓度(％)= [{ (Az-Ao) X 1000}/{(As-Ao) X 100}] XlOO其中，Az:全糖质测定用的试验液的吸光度、As、Ao与式I中的相同。式3:支链淀粉浓度(％)=全糖质浓度(％)-夹杂糖质浓度(％)另行，将菌体接种前的培养基的全糖质浓度由蒽酮-硫酸法测定而求出碳源浓度(%)，相对于培养基的碳源浓度(％)的夹杂糖质浓度(％)及支链淀粉浓度(％)，各自，基于下述的式4、5，作为夹杂糖质率(％)及支链淀粉对糖收率(％)求出。
式4:夹杂糖质率(％) ={夹杂糖质浓度(％) /培养基的碳源浓度(％) } X 100式5:支链淀粉对糖收率(％) = {支链淀粉浓度(％) /培养基的碳源浓度(％) } X 100
将如上述一样求出的夹杂糖质率作为指标,选择判断为夹杂糖质率相比亲本株更少的变异株组(分离株的大概W。选择的变异株之中，特别是夹杂糖质率低，成为亲本株之一半以下的5株示于表I。如表I所示，在这些的变异株中，尽管支链淀粉对糖收率与作为亲本株的S-2株大致同程度，但夹杂糖质率均在3.0%以下，相比作为亲本株的S-2株(夹杂糖质率6.6%)之一半更低，相对于支链淀粉对糖收率(％)的夹杂糖质率(％)的比率均在
0.05以下，此值也成在作为亲本株的S-2株中的比率(0.101)的不足一半。表I所示的这些变异株的支链淀粉对糖收率与亲本株是同程度，夹杂糖质率低，即便不经从它们的培养物由溶剂的沉淀分别等的纯化步骤制备含有支链淀粉的粉末，也相比以往的夹杂糖质少，非常可期待得到稳定的一定组成的含有支链淀粉的粉末。在其中也是，MA446株在得到的变异株之中夹杂糖质率最低，支链淀粉对糖收率与夹杂糖质率的比率也最低，所以选择此株，进行以下的实验。再有，基于上述的突变、培养、筛选的方法，将至少S-2株作为亲本株，可不要求过度的试行错误地适宜、得到可制备本发明的含有支链淀粉的粉末的变异株。表I
权利要求
1.含有支链淀粉的粉末，其特征在于， 是不经从将属于出芽短梗霉(Aureobasisium pullulans)的微生物的变异株在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的培养基中培养而得到的培养物除去夹杂糖质的步骤而制备的含有支链淀粉的粉末， 含在75容积％水性甲醇中不溶的支链淀粉级分和可溶的夹杂糖质级分， 基于蒽酮-硫酸法求出的，相对于粉末全体中含的全糖质含量的夹杂糖质级分中含的夹杂糖质含量的比例是3质量％以下，同时 含有甘露糖醇。
2.权利要求1所述的含有支链淀粉的粉末，其特征在于，甘露糖醇的含量以无水物换算计不超2质量％。
3.权利要求1或2所述的含有支链淀粉的粉末，其还具有下述(I) (3)的特征: (1)支链淀粉的质量平均分子量是约50，000 1，000,000道尔顿。
(2)支链淀粉的质量平均分子量/数平均分子量的值是约10 70。
(3)在支链淀粉分子中，相对于麦芽三糖结构，以摩尔比含I 3%麦芽四糖结构。
4.权利要求1 3之任一项所述的含有支链淀粉的粉末，其还具有下述(4)的特征: (4)成形含有支链淀粉的粉末而得到的厚度500μ m的膜，在使用放射光的X射线小角散射分析中，不显示长周期结构或密度摇摆所致的回折峰。
5.权利要求1 4之任一项所述的含有支链淀粉的粉末，其还具有下述(5)的特征: (5)成形含有支链淀粉的粉末而得到的厚度100μ m的膜，在使用截面积Imm2的突刺试验用适配体进行的突刺强度试验中，显示20MPa以上的突刺断裂强度。
6.权利要求1 5之任一项所述的含有支链淀粉的粉末，其中属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) S-2株的变异株。
7.权利要求1 6之任一项所述的含有支链淀粉的粉末的制备方法，其特征在于， 包括 将属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的培养基中培养的步骤、 将得到的培养物除去菌体、脱色、脱盐、浓缩、及粉末化的步骤， 不包括夹杂糖质的除去步 骤。
8.权利要求7所述的含有支链淀粉的粉末的制备方法，其中属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) S-2株的变异株。
9.权利要求7或8所述的含有支链淀粉的粉末的制备方法，其中属于出芽短梗霉(Aureobasidium pulIulans)的微生物的变异株是变异株MA446株(专利生物保藏中心保藏号 FERM BP-11250)。
10.含有支链淀粉的成形物，其为将权利要求1 6之任一项所述的含有支链淀粉的粉末在至少原料的一部分中使用而制备的。
11.权利要求10所述的含有支链淀粉的成形物，其中含有支链淀粉的成形物是食品、化妆品、药品、准药品、或者它们任何之中间制品。
全文摘要
本发明旨在提供不经由溶剂沉淀等的烦琐的纯化步骤而制备，并且，在成形为膜之时示相比以往品更高的断裂强度的含有支链淀粉的粉末和其制备方法以及用途。通过提供含有支链淀粉的粉末，其特征在于，是不经从将属于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)的微生物的变异株在含葡萄糖及麦芽糖作为碳源的培养基中培养而得到的培养物除去夹杂糖质的步骤而制备的含有支链淀粉的粉末，含在75容积%水性甲醇中不溶的支链淀粉级分和可溶的夹杂糖质级分，基于蒽酮-硫酸法求出的，相对于粉末全体中含的全糖质含量的夹杂糖质级分中含的夹杂糖质含量的比例是3质量%以下，同时含有甘露糖醇、及其制备方法以及用途来解决上述课题。
文档编号C08B37/00GK103140503SQ20118003481
公开日2013年6月5日 申请日期2011年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者涩谷孝, 伊泽精祐, 三宅俊雄 申请人:株式会社林原