小麦直链淀粉和支链淀粉的纯化方法
【专利摘要】本发明提供一种小麦直链淀粉和支链淀粉的纯化方法，其是采用改进的马丁法提取小麦籽粒面粉中的淀粉，在此基础上用不同的方法处理淀粉，最后提取出高纯度的直链淀粉和支链淀粉。利用本发明方法能够快速从小麦籽粒中提取出高纯度的直链淀粉和支链淀粉，并且检测提取物的纯度。本方法制备出的小麦直链淀粉和支链淀粉标准品可以用于比色法测定小麦淀粉的含量及组成，与目前常用的马铃薯来源标准品相比，大大提高小麦淀粉组成分析的准确性，在小麦淀粉品质研究领域具有很好的应用前景。
【专利说明】小麦直链淀粉和支链淀粉的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化学领域，具体地说，涉及一种小麦直链淀粉和支链淀粉的纯化方法。
【背景技术】
[0002]籽粒淀粉是小麦籽粒最主要的组分，占籽粒重量的65% _70%。根据葡萄糖分子之间的连接方式不同小麦淀粉可分为直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉(IO3-1O4Da)与支链淀粉(IO5-1O6Da)独立存在，分别占淀粉总含量的22% -26%和74% -78%。直链淀粉和支链淀粉具有不同的理化特性，直链淀粉吸水能力较弱，而支链淀粉吸水能力较强；直链淀粉含量低的淀粉形成的凝胶强度小，回生老化慢，加工的食品质地较软、富有弹性且保质期长，直链淀粉含量高的淀粉则与之相反。籽粒淀粉含量和组成影响小麦的加工品质和最终加工用途，对小麦淀粉含量和组成进行准确测量是小麦品质研究的重要环节。
[0003]淀粉含量及组成的测定方法包括物理方法、化学方法和生物化学方法等。比色法具有简单快速、重复性高的特点，因而在实际操作中受到更多研究者的青睐。比色法的原理是基于淀粉与碘的颜色反应，可以分为单波长法、双波长法和多波长法。通过比色法测定淀粉含量及组成，需要制作高可靠性和高相关性的标准曲线。已有一些研究发现，在测定不同物种的淀粉含量时，需要利用从相应的物种中提取出直链淀粉和支链淀粉制作标准曲线，利用单一物种来源的标准品进行不同物种淀粉含量测定会造成较大误差。目前尚无商品化的小麦直链淀粉和支链淀粉标准品，前期对小麦淀粉含量及组成的研究大都采用商品化的马铃薯来源直链淀粉和支链淀粉替代。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种小麦直链淀粉和支链淀粉的纯化方法，以获得高纯度的直链淀粉和支链淀粉，从而可以用于小麦籽粒淀粉的比色法测定。
[0005]基于上述目的，本发明参考并改进已有的马铃薯和玉米淀粉研究的一些方法和技术，用不同品种的小麦籽粒作为材料，提取了这些材料中的直链淀粉和支链淀粉并检验了提取物的纯度。通过两种不同的方法处理，使淀粉悬浮液分层，分层后的上清液中分别含有直链淀粉或支链淀粉，而其他杂质则形成沉淀。此外，在后续的纯化过程中，增加了额外的纯化步骤和纯化次数，最大限度地去除了其他杂质，提高了直链淀粉和支链淀粉的纯度。
[0006] 根据不同的原理，之前报道的直链淀粉和支链淀粉纯化方法包括温水抽提法、配合剂分离法、盐析法、色谱法等。总体来说，这些方法在操作性、产量纯度、产量方面具有各自特点。但是，单独利用上述方法，难以同时获得高纯度的直链淀粉和支链淀粉，或存在产量过低的问题。本发明结合并改进不同方法，利用不同品种的小麦籽粒作为原料，从中提取出高纯度的直链淀粉和支链淀粉，通过改进的层析方法对其进行纯度检验，并与商品化的马铃薯来源标准品进行比较分析。检验结果证明，利用本方法制备的小麦直链淀粉和支链淀粉具有非常高的纯度。此外，吸收光谱显示不同小麦来源的直链淀粉和支链淀粉标准品的性质存在高度相似性，而与马铃薯来源的标准品存在巨大差异。
[0007]为了实现本发明目的，本发明的一种小麦直链淀粉和支链淀粉的纯化方法，包括以下步骤:
[0008]I)小麦籽粒淀粉的提取
[0009]将一定量的小麦籽粒用带过滤筛网的磨粉机打磨成粉并去除麸皮，称取50_200g面粉，加入面粉重量50-60%的水在和面机^OOW)中搅拌30min-45min，搅拌结束后，将面团转入干净的容器中，于室温静置30min-45min，用4-6层纱布将静置后的面团包裹，将纱布与面团置于烧杯中，分三次加入面团重量2-3倍的水揉洗面团，洗出的乳状液即为淀粉粗提液；将粗提液转入离心管中，3500-4000g离心5-10min，弃上清，并移除沉淀上方的黄色胶状层，收集管底的白色沉淀即为小麦籽粒淀粉颗粒。
[0010]2)小麦直链淀粉的提取
[0011]称取步骤I)中提取的淀粉颗粒10_20g配制成2-4w/V%的淀粉液，在磁力搅拌器上持续搅拌淀粉液并加热至65°C 土1°C，然后转入65°C 土1°C水浴锅中静置分层l_2h ;然后收集上层液体，转入离心管中3000-4000g离心15-20min，收集上清液即为小麦直链淀粉粗提取液；用滤纸过滤直链淀粉粗提取液，向滤液中添加滤液1/3体积的丁醇，搅拌l_2h，室温静置过夜后3000-4000g离心15-20min收集沉淀；将丁醇和水按1:3的体积比加入沉淀中并搅拌l_2h，室温静置4-6h后3000-4000g离心15_20min收集沉淀，用无水乙醇漂洗沉淀3-4次，冷冻真空干燥沉淀，研磨成粉，于4°C保存。
[0012]3)小麦支链淀 粉的提取
[0013]称取步骤I)中提取的淀粉颗粒10_20g配制成2-4w/V%的淀粉液，在磁力搅拌器上搅拌并煮沸淀粉液30-45min，当淀粉液温度降至50_55°C时，加入磷酸缓冲液将淀粉液pH值调至6.3 ;然后将淀粉液放入灭菌锅中121°C蒸煮2-3h，再转入沸水浴中搅拌l_2h，加入淀粉液1/3体积的丁醇，在磁力搅拌器上50-55°C搅拌30-45min，转入泡沫盒中静置过夜使直链淀粉和其他杂质自然缓慢沉淀，然后转入离心管中8000-8700g离心20-30min ;离心后溶液分为三层，收集中间层即为支链淀粉粗提取液；向支链淀粉粗提液中加入粗提液1/5体积的丁醇，沉淀残留的直链淀粉，搅拌30-60min后8000_8700g离心20_30min，收集上清液；重复丁醇沉淀直链淀粉的步骤，直至离心后无沉淀产生，然后向粗提液中加入等体积的丁醇，搅拌30-60min后8000_8700g离心20_30min，向粗提液中加入2倍体积的甲醇，摇匀，8000-8700g离心10-15min收集沉淀；然后用无水乙醇漂洗沉淀3_4次，冷冻真空干燥沉淀，研磨成粉，于4°C保存。
[0014]本发明还提供根据上述方法制备的小麦直链淀粉和支链淀粉标准品。
[0015]本发明进一步提供所述小麦直链淀粉和支链淀粉标准品在小麦淀粉的含量及组成测定中的应用。
[0016]优选地，采用比色法测定小麦淀粉的含量及组成。
[0017]基于直链淀粉和支链淀粉与碘结合显色反应以及凝胶层析方法的原理，对本发明提取的直链淀粉和支链淀粉纯度进行了检测。前期研究结果显示，高纯度的直链淀粉与碘结合呈现蓝色，支链淀粉与碘结合呈现紫红色。本发明提取的直链淀粉与支链淀粉与碘结合显色结果分别如图1和图2所示，显色结果均符合前期的报道。通过凝胶层析进一步分析了本发明提取的直链淀粉和支链淀粉的纯度，结果分别如图3和图4所示。两者的洗脱曲线均为单峰，说明样品具有非常高的纯度。此外，直链淀粉和支链淀粉的洗脱体积存在明显的差异，说明提取的样品确实是单一物质，且两者的洗脱先后顺序也符合凝胶层析的原理。
[0018]为了检测本发明提取的小麦来源直链淀粉和支链淀粉在比色法应用中的吸光特性，比较了不同品种小麦来源的直链淀粉和支链淀粉与碘结合后的吸收光谱，并进一步与商品化的马铃薯来源直链淀粉和支链淀粉标准品进行了比较。直链淀粉吸收光谱(图5)的对比分析显示，不同小麦来源的直链淀粉吸收曲线高度相似，而与马铃薯来源的直链淀粉相比具有明显的差异。支链淀粉吸收光谱(图6)的对比分析显示，不同小麦来源的支链淀粉吸收曲线也高度相似，而与马铃薯来源的直链淀粉吸收光谱相比较，两者在最大吸收值特征上存在差异。
[0019]结合所有的实验数据分析，本发明提取的直链淀粉和支链淀粉具有非常高的纯度，可以用于比色法测定小麦淀粉含量及组成。此外，从小麦与马铃薯直链淀粉、支链淀粉吸收光谱对比结果分析，用马铃薯来源的直链淀粉和支链淀粉作为标准品来测定小麦淀粉可造成较大误差。因此在利用比色法测定小麦的淀粉含量和组成时，应该使用小麦来源的直链淀粉和支链淀粉标准品。综上所述，利用本发明提供的方法，能够制备高纯度的直链淀粉和支链淀粉标准品，从而有利于大大提闻小麦杆粒淀粉研究的精确性和效率。此外，本发明提供的方法也适用于其他麦类作物直链淀粉和直链淀粉的制备和检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例2中良麦4号来源直链淀粉与碘结合显色反应结果。
[0021]图2为本发明实施例2中良麦4号来源支链淀粉与碘结合显色反应结果。
[0022]图3为本发明实施 例2中良麦4号来源直链淀粉凝胶层析洗脱曲线。
[0023]图4为本发明实施例2中良麦4号来源支链淀粉凝胶层析洗脱曲线。
[0024]图5为本发明实施例3中不同小麦来源的直链淀粉与商品化的马铃薯来源直链淀粉吸收光谱对比图。
[0025]图6为本发明实施例3中不同小麦来源的直链淀粉与商品化的马铃薯来源支链淀粉吸收光谱对比图。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0027]以下实施例中涉及的普通小麦Bobwhitel (PI520554)、Bobwhite2 (PI614034)从USDA-ARS(http://www.ars-grin.gov)获得；良麦 4 号、绵麦 37、蜀麦 375、蜀麦 482、郑麦9023，均从四川农业大学小麦研究所获得。马铃薯来源标准品购自于Sigma公司。
[0028]各试剂配方如下:
[0029]磷酸缓冲液配方为:40g/LNaH2PO4,10g/L Na2HPO4 ；
[0030]碘试剂配方为:2g/LI2, 20g/L KI ；
[0031]层析洗脱液配方为:0.02%的NaCl溶液，pH为3.6 ;
[0032]凝胶:凝胶选用Bio-rad公司的PlOOgel。
[0033]实施例1普通小麦直链淀粉和支链淀粉的纯化[0034]1、小麦籽粒淀粉的提取
[0035]根据改进的马丁法提取小麦籽粒面粉中的淀粉。将一定量的小麦籽粒用带过滤筛网的磨粉机打磨成粉并去除麸皮。称取100g的面粉，将面粉和水按2:1的重量比放入和面机(600W)中搅拌30min。搅拌结束后，将面团转入干净的容器中，于室温静置30min。用6层纱布将静置后的面团包裹，将纱布与面团置于大烧杯中，分三次加入600mL水揉洗面团，洗出的乳状液即为淀粉粗提取液。将淀粉液转入离心管中，3500 Xg离心5min，倒去上清液。最大限度地刮除沉淀最上方的黄色胶状层，管底的白色沉淀即为淀粉颗粒。
[0036]2、小麦直链淀粉的提取
[0037]称取步骤I中提取的小麦淀粉12g配制成4% (w/v)的淀粉液。在磁力搅拌器上持续搅拌淀粉液并加热直至65°C，然后转入65°C水浴锅中静置lh。缓慢倒出并收集上层液体，转入离心管中3000 Xg离心15min，弃沉淀，获得的上清液即为直链淀粉粗提取液。用滤纸过滤直链淀粉粗提取液并测量回收的溶液体积。向滤液中添加1/3体积的丁醇，搅拌lh，室温静置过夜后3000Xg离心15min收集沉淀。将丁醇和水按1:3 (v/v)的比例加入沉淀中并搅拌lh，室温静置6h后3000 Xg离心15min收集沉淀。用无水乙醇漂洗沉淀4次，冷冻真空干燥沉淀，用干净的研钵和研磨棒将沉淀研磨成粉，于4°C保存。
[0038]3、小麦支链淀粉的提取
[0039]称取步骤I中提取的小麦淀粉IOg配制成2% (w/v)的淀粉液。在磁力搅拌器上搅拌并煮沸淀粉液30min。当淀粉液温度降至55°C时，加入磷酸缓冲液将淀粉液pH值调至
6.3。将淀粉液放入灭菌锅中121°C蒸煮2h，再转入沸水浴中搅拌lh。加入淀粉液1/3体积量的丁醇，在磁力搅拌器上55°C搅拌30min，转入泡沫盒中静置过夜，然后转入离心管中8700Xg离心30min。离心后的溶液分为三层，上层为丁醇，最底层为直链淀粉和其他杂质沉淀，中间层即为支链淀粉粗提取液。收集支链淀粉粗提液，加入粗提液1/5体积量的丁醇沉淀残留的直链淀粉，搅拌30min, 8700 X g离心30min收集上清液。重复丁醇沉淀直链淀粉步骤，直至离心后管底无肉眼可见的沉淀，然后向粗提液中加入等体积的丁醇，搅拌30min，8700 X g离心30min。向粗提液中加入2倍体积量的甲醇，用手摇匀，8700 X g离心15min收集沉淀。无水乙醇漂洗沉淀4次，冷冻真空干燥沉淀，用干净的研钵和研磨棒将沉淀研磨成粉，于4°C保存。
[0040]实施例2小麦直链淀粉和支链淀粉纯度的检测
[0041]为保证本发明提取的直链淀粉和支链淀粉可以用于比色法精确测定小麦淀粉的含量和组成，有必要对两者的纯度进行检测。利用碘结合显色反应及凝胶层析法，检测了实施例I中提取的直链淀粉和支链淀粉的纯度。
[0042]分别用ImL无水乙醇分散IOOmg实施例1中提取的直链淀粉和支链淀粉，加入9mLNaOH溶液(lmol/L)后于沸水浴中加热15min，期间不时摇动直至溶液变澄清。向煮沸后的溶液中加入60mL双蒸水，用0.5M的HCl将pH调至3.6后定容至IOOmL,此溶液作为后续分析的工作液。分别取1.5mL上述直链淀粉或支链淀粉工作液，加入20 μ I碘试剂进行显色反应。直链淀粉显色结果如图1所示，直链淀粉与碘结合呈现蓝色；支链淀粉显色结果如图2所示，支链淀粉与碘结合呈现紫红色。另各取ImL直链淀粉或支链淀粉工作液加入预先处理好的凝胶层析柱，并连接入Bio-Gel层析系统进行层析，层析洗脱液为NaCl溶液(0.02%v/v,ρΗ3.6),流速为9m L/h。每个收集管收集2ml洗出液,层析结束后分别向收集管中加入20 μ I碘试剂，混匀，静置30min，在630nm和540nm处分别测定收集到的直链淀粉洗出液和支链淀粉洗出液的吸光值，并绘制洗脱曲线。以良麦4号为例，其直链淀粉层析洗脱曲线如图3所示，支链淀粉洗脱曲线如图4所示。由图3和图4可知，洗脱曲线呈现单峰，说明本发明提取的直链淀粉和支链淀粉纯度较高。此外，依据凝胶层析的原理，在层析过程中大分子量物质先于小分子量物质流出层析柱，由图3和图4可以看出，大分子量的支链淀粉的洗脱体积小于直链淀粉即支链淀粉在层析过程中先流出层析柱，结果符合凝胶层析原理。
[0043]实施例3小麦来源与马铃薯来源的直链淀粉和支链淀粉吸收光谱的比较
[0044]为保证本发明提取的直链淀粉和支链淀粉可以广泛用于比色法测定麦类籽粒淀粉含量及组成，根据实施例1提取了 PI520554、PI614034、良麦4号、绵麦37、蜀麦375、蜀麦482、郑麦9023等小麦品种的直链淀粉和支链淀粉。分别用ImL无水乙醇分散IOOmg各个小麦来源的直链淀粉和支链淀粉，加入9ml NaOH溶液(lmol/L)后于沸水浴中加热15min，期间不时摇动直至溶液变澄清，然后定容至IOOmL作为贮藏液。分别取各小麦来源的直链淀粉贮藏液4mL、支链淀粉贮藏液2.5mL,加入30mL双蒸水，用0.5M的HCl将pH调至3.6后加入500mL碘试剂,最后定容至50mL,颠倒混匀后静置30min。用紫外-可见光分光光度计在400nm-900nm波长范围对上述直链淀粉和支链淀粉的碘结合显色反应液进行吸光度的扫描。
[0045]不同来源直链淀粉吸收光谱扫描结果见图5，由图5可看出，本发明提取的不同来源小麦直链淀粉的吸收光谱在最大吸收波长，最大吸收值、波形等性质上都非常相似，而与马铃薯来源的直链淀粉吸收光谱有较大的差异。不同来源支淀粉吸收光谱扫描结果见图6，由图6可以看出，本发明提取的不同来源小麦支链淀粉的吸收光谱非常相似，与马铃薯来源的直链淀粉吸收光谱相比较，两者在最大吸收值特征上有一定的差异。由此说明，不同物种之间的直链淀粉和支链淀粉可能在多个方面都具有各自的独特性。在利用比色法测定不同物种的淀粉含量和组成时，应该使用对应物种来源的直链淀粉标准品和支链淀粉标准品以避免由标准品特性的差异造成的误差。该结果也进一步表明，利用本发明提供的方法，能够从不同小麦杆粒中提取闻纯度的直链淀粉和支链淀粉标准品，从而有利于大大提闻小麦籽粒淀粉研究的精确性和效率。
[0046] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.小麦直链淀粉和支链淀粉的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)小麦籽粒淀粉的提取 将一定量的小麦籽粒用带过滤筛网的磨粉机打磨成粉并去除麸皮，称取50-200g面粉，加入面粉重量50-60%的水在功率为600W的和面机中搅拌30min-45min，搅拌结束后，将面团转入干净的容器中，于室温静置30min-45min，用4_6层纱布将静置后的面团包裹，将纱布与面团置于烧杯中，分三次加入面团重量2-3倍的水揉洗面团，洗出的乳状液即为淀粉粗提液；将粗提液转入离心管中，3500-4000g离心5-10min，弃上清，并移除沉淀上方的黄色胶状层，收集管底的白色沉淀即为小麦籽粒淀粉颗粒； 2)小麦直链淀粉的提取 称取步骤1)中提取的淀粉颗粒10-20g配制成2-4w/V%的淀粉液，在磁力搅拌器上持续搅拌淀粉液并加热至65°C 土1°C，然后转入65°C 土1°C水浴锅中静置分层l_2h ;然后收集上层液体，转入离心管中3000-4000g离心15-20min，收集上清液即为小麦直链淀粉粗提取液；用滤纸过滤直链淀粉粗提取液，向滤液中添加滤液1/3体积的丁醇，搅拌l_2h，室温静置过夜后3000-4000g离心15-20min收集沉淀；将丁醇和水按1:3的体积比加入沉淀中并搅拌l_2h，室温静置4-6h后3000-4000g离心15_20min收集沉淀，用无水乙醇漂洗沉淀3-4次，冷冻真空干燥沉淀，研磨成粉，于4°C保存； 3)小麦支链淀粉的提取 称取步骤I)中提取的淀粉颗粒10-20g配制成2-4w/V%的淀粉液，在磁力搅拌器上搅拌并煮沸淀粉液30-45min，当淀粉液温度降至50_55°C时，加入磷酸缓冲液将淀粉液pH值调至6.3 ;然后将淀粉液放入灭菌锅中121°C蒸煮2-3h，再转入沸水浴中搅拌1-2h，加入淀粉液1/3体积的丁醇，在磁力搅拌器上50-55°C搅拌30-45min，转入泡沫盒中静置过夜使直链淀粉和其他杂质自然沉淀，然后转入离心管中8000-8700g离心20-30min ;离心后溶液分为三层，收集中间层即为支链淀粉粗提取液；向支链淀粉粗提液中加入粗提液1/5体积的丁醇，沉淀残留的直链淀粉，搅拌30-60min后8000_8700g离心20_30min，收集上清液；重复丁醇沉淀直链淀粉的步骤，直至离心后无沉淀产生，然后向粗提液中加入等体积的丁醇，搅拌30-60min后8000_8700g离心20_30min，向粗提液中加入2倍体积的甲醇，摇匀，8000-8700g离心10-15min收集沉淀；然后用无水乙醇漂洗沉淀3_4次，冷冻真空干燥沉淀，研磨成粉，于4°C保存。
2.根据权利要求1所述方法制备的小麦直链淀粉和支链淀粉标准品。
3.权利要求2所述小麦直链淀粉和支链淀粉标准品在小麦淀粉的含量及组成测定中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用比色法测定小麦淀粉的含量及组成。
【文档编号】C08B30/20GK103936872SQ201410177594
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】江千涛, 张晓伟, 王际睿, 陈国跃, 祁鹏飞, 刘亚西, 蒲至恩, 李伟, 魏育明, 郑有良 申请人:四川农业大学