专利名称：调节植物直链和支链淀粉含量的方法
调节植物直链和支链淀粉含量的方法技术领域
本发明属于植物学以及分子生物学领域；更具体地，本发明涉及调节植物直链和支链淀粉含量的方法。
背景技术：
淀粉(starch)是高等植物、藻类和一些微生物细胞的忙藏物质，是无色无臭的白色粉末，广泛存在于各种植物中。淀粉的性质与其结构有着密切的关系，不同直链淀粉含量的淀粉在性质上有着巨大的差异，直接影响着其在工业上的应用。在淀粉的分布上，尤以植物种子(如米、麦、玉米)和块根块茎(如木薯、甘薯、马铃薯)含量丰富，可作为工业上制取淀粉的原料，例如可由玉米、甘薯、马铃薯、野生橡子、葛根等含淀粉的物质中提取而得。淀粉除食用外，工业上用于制糊精、麦芽糖、葡萄糖，也用于调制印花浆、纺织品的上浆、纸张的上胶、药物片剂的压制等。
淀粉是由许多葡萄糖分子缩合而成的多糖，有直链和支链两种。直链淀粉由α -1,4糖苷键连接的葡萄糖分子组成，呈线状链；支链淀粉在分支处有α-1，6糖苷键连接，其直链部分也是α -1，4连接。一般的淀粉为直链及支链淀粉的混合物，直链淀粉和支链淀粉在淀粉中所占的比例随植物的种类而异，在多数含有淀粉的植物中，通常含有20 30%直链淀粉、70 80%支链淀粉。在哺乳动物的消化道中，淀粉经淀粉酶、麦芽糖酶等作用，水解为葡萄糖，被吸收利用。粮食作物食用品质的优劣在很大程度上与作物中淀粉的组成，即直链淀粉与支链淀粉的比例有关。
目前，以植物块根(如薯类植物块根)为原料的淀粉加工业处于发展阶段，但各种产品的加工对原材料的淀粉品质(·如直链淀粉和支链淀粉的含量比例)提出了多样化的需求。依靠传统育种来改变淀粉品质，耗时长，需要大量人力物力，难以满足淀粉加工业的急切需求。
本领域人员已经尝试通过调节淀粉合成的主要基因来调节植物中淀粉的组成和含量，然而与淀粉合成相关的蛋白有许许多多，包括:右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase,EC:2.4.1.5)、β -1，3-葡聚糖合成酶(I, 3-beta-glucan synthase, EC:2.4.1.34)、内切- β-1,3-葡聚糖酶(glucan endo-1, 3-beta-D-glucosidase, EC:3.2.1.39)和夕卜切-β -1，3-葡聚糖酶(glucan I, 3-beta-D-glucosidase, EC:3.2.1.58)、鹿糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase, SPS, EC:2.4.1.14)、鹿糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy, EC:2.4.1.13)和外切型纤维素水解酶(Cellulose 1，4-beta-cellobiosidase，EC:3.2.1.91)、外切型纤维素水解酶(Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase, EC:3.2.1.91)、葡萄糖 _1_ 憐酸胞卩密唳转移酶(glucose-1-phosphate cy tidy Iy I transferase, EC:2.7.7.33)、外切多聚半乳糖醒酸酶(galacturan 1,4-alpha-galacturonidase, exo-PG,EC:3.2.1.67)、淀粉分支酶(1,4-alpha-glucan branching enzyme, SBE, EC:2.4.1.18)和β-淀粉酶(beta-amylase, EC:3.2.1.2)等等。因此,找到适于基因工程操作的蛋白成为本领域发展的瓶颈。
综上，通过基因工程手段培育直链淀粉和支链淀粉的比例各不相同的植物对于淀粉工业化生产是迫切需要的。因此，如何找到合适的靶基因是值得深入研究的课题；如何找到合适的方法来调节相关基因也是值得深入研究的。发明内容
本发明的目的在于提供调节植物直链和支链淀粉含量的方法。
本发明的另一目的在于提供调节植物直链和支链淀粉含量的构建物。
在本发明的第一方面，提供一种调节植物中直链淀粉含量的方法，所述方法包括:抑制颗粒结合型淀粉合成酶I (Granule-Bound Starch Synthase I，GBSSI)、淀粉分支酶I (SBEI)和/或淀粉分支酶II (SBE II )的表达。
在一个优选例中，所述的方法为提高植物中直链淀粉含量(即降低植物中支链淀粉含量)，包括:抑制淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达。
在另一优选例中，所述的方法为降低植物中直链淀粉含量(即提高植物中支链淀粉含量)，包括:抑制颗粒结合型淀粉合成酶I的表达。
在另一优选例中，以颗粒结合型淀粉合成酶1、淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II多核苷酸序列中的保守性区域为靶点抑制颗粒结合型淀粉合成酶1、淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达。
在另一优选例中，所述的保守性区域包含:
颗粒结合型淀粉合成酶I中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
淀粉分支酶I中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
淀粉分支酶II中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或
淀粉分支酶I中SEQ ID NO:6中第1_165位所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，将构建物或含有该构建物的载体转染到植物中；所述的构建物含有式(I)所示的结构:
Seq 正向-X-Seq 反向式(I)，
式⑴中，
具有SE Q ID NO:5所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列
Seq反向具有与Seq正向互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，在Seqil^之前,还包含一启动子,所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。
在另一优选例中，该启动子为CaMV 35S启动子或p54/l.0启动子。
在另一优选例中，所述的Seqtt具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；或
所述的启动子是ρ54/1.0启动子。
在另一优选例中，所述的具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，或具有SEQID NO:10所示的核苷酸序列。
更佳地，所述的Seqtt具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述方法包括:
(I)提供携带所述的构建物或含有该构建物的载体的农杆菌；
(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使所述构建物转入植物细胞；并整合到植物细胞的染色体上；和
(3)选择转入了构建物的植物细胞、组织或器官，再生成植株。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，选自:
具有SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列的多核苷酸；
具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的多核苷酸；
具有SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的多核苷酸；
具有SEQ ID NO:6中第1_165位所示核苷酸序列的多核苷酸；
具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸；或
具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自:具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸或具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的多核苷酸。基于所述的多核苷酸制备的构建物或载体被导入植物后，可使得植物中直链淀粉含量超过50%更佳地超过65%，70%，更佳地超过75% ;85%，90%，95%，更佳地接近100%。
在另一优选例中，所述的多核苷酸不包括编码全长的GBSS1、SBEI或SBEII基因的多核苷酸或基因组基因。
在本发明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制备调节植物中直链淀粉含量的构建物或干扰分子。
在本发明的另一方面，提供一种的构建物，含有式(I)所示的结构:
Seq正向-X-Seq反向式⑴，
式⑴中，
具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；
Seqg具有与Seqtt互补的核苷酸序列；
X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。
在另一优选例中，式(I)所示的结构在转入植物细胞转录后，形成式(II)所示的二级结构:
权利要求
1.一种调节植物中直链淀粉含量的方法，所述方法包括:抑制颗粒结合型淀粉合成酶1、淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为提高植物中直链淀粉含量，包括:抑制淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为降低植物中直链淀粉含量，包括:抑制颗粒结合型淀粉合成酶I的表达。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以颗粒结合型淀粉合成酶1、淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II核苷酸序列中的保守性区域为靶点抑制颗粒结合型淀粉合成酶1、淀粉分支酶I和/或淀粉分支酶II的表达。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的保守性区域包含: 颗粒结合型淀粉合成酶I中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； 淀粉分支酶I中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列； 淀粉分支酶II中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或 淀粉分支酶I中SEQ ID NO:6中第1-165位所示的核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将构建物或含有该构建物的载体转染到植物中；所述的构建物含有式(I)所示的结构: Seq正向_x_Seq反向式(I)， 式⑴中， 具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列具有与Seq1^1互补的核苷酸序列； X为位于Seqtt和Seq&^^间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt和Seqg不互补。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,在Seqil^之前,还包含一启动子,所述启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该启动子为CaMV35S启动子或p54/1.0启动子。
9.如权利要 求6所述的方法，其特征在于，所述的Seqtt具有SEQID NO:6和SEQ IDNO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；或 所述的启动子是p54/l.0启动子。
10.如权利要求6-9任一所述的方法,其特征在于,所述方法包括: (1)提供携带所述的构建物或含有该构建物的载体的农杆菌； (2)将植物细胞、组织或器官与步骤(I)中的农杆菌接触，从而使所述构建物转入植物细胞；并整合到植物细胞的染色体上；和 (3)选择转入了构建物的植物细胞、组织或器官，再生成植株。
11.一种分离的多核苷酸，选自: 具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的多核苷酸；具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的多核苷酸； 具有SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的多核苷酸； 具有SEQ ID NO:6中第1-165位所示核苷酸序列的多核苷酸； 具有SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸；或 具有SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的多核苷酸。
12.权利要求11所述的多核苷酸的用途，用于制备调节植物中直链淀粉含量的构建物或干扰分子。
13.一种的构建物，含有式(I)所示的结构: Seq正向_x_Seq反向式(I)， 式⑴中， 具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列，具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列； 具有与Seq1^1互补的核苷酸序列； X为位于Seqtt和Seq&^^间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt和Seqg不互补。
14.如权利要求13所述的构建物，其特征在于，在之前，还包含与之操作性连接的启动子，该启动子为CaMV 35S启动子或p54/l.0启动子。
15.如权利要求13或14所述的构建物，其特征在于，所述的Seqtt具有SEQID NO:6和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列，或具有SEQ ID NO:6中第1-165位和SEQ ID NO:7串联而成的核苷酸序列；或 所述的启动子是p54/l.0启动子。
16.—种载体，所述的载体含有权利要求13-15任一所述的构建物。
17.权利要求13-15任一所述的构建物或权利要求16所述的载体的用途，用于导入到植物中，从而调节植物中直链淀粉的含量。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述的构建物或载体还用于: 调节植物中的淀粉糊化特性； 调节植物中的淀粉粘度特性； 改变植物中淀粉颗粒的形态。
全文摘要
本发明涉及调节植物直链和支链淀粉含量的方法。本发明提供了淀粉合成途径中适合进行基因工程操作并显著改变植物中淀粉组成的酶，它们是颗粒结合型淀粉合成酶I(GBSS I)、淀粉分支酶I(SBEⅠ)和/或淀粉分支酶II(SBEⅡ)。本发明还提供了一种可良好地调节植物中淀粉组成的新方法，包括降低上述酶的表达，获得了直链淀粉和支链淀粉含量比例各不相同的一系列转基因植物。本发明还提供了用于调节植物中淀粉组成的构建物或载体。
文档编号C12N15/113GK103146756SQ20111040123
公开日2013年6月12日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者张鹏, 杨俊 , 赵姗姗 申请人:中国科学院上海生命科学研究院