一种新的具有抗心力衰竭作用的钠尿肽嵌合体CNAAC的制造方法与工艺

本发明涉及应用新型钠尿肽类药物防治心力衰竭的基础研究和临床研究领域。

背景技术：
心脑血管疾病是世界公认的人类健康的“第一杀手”，其中心力衰竭是众多器质性心脏病如心肌梗死、肺源性心脏病、肥厚型心肌病等几乎不可避免的结局，严重威胁人类健康。钠尿肽家族因其具有显著的利钠、利尿、舒血管和抑制增殖等多样化作用，目前已被广泛应用于心力衰竭的基础和临床研究。钠尿肽家族是一组结构相似的内源性肽的家族，其成员包括心房钠尿肽(atrialnatriureticpeptide，ANP)、脑钠尿肽(brainnatriureticpeptide，BNP)、C-型钠尿肽(C-typenatriureticpeptide，CNP)及D型钠尿肽(D-typenatriureticpeptide，DNP)等，是由氨基端、环状结构和羧基端组成的多肽结构。人工合成的ANP和BNP类似物已经在HF治疗中得到了广泛应用，但由于化学合成效率低、成本昂贵、易被机体降解等问题，其应用受到了一定限制。新出现的NPs嵌合体分子有望为以上问题提供新的解决途径。研究发现，ANP的羧基端的5个氨基酸残基在利尿方面起到重要作用，而环状结构可能与受体结合及产生舒血管等作用有关。因此我们对ANP分子进行改造：保留ANP分子的环状结构和羧基端，与CNP的氨基端进行组合，获得一种新型钠尿肽嵌合体CNAAc。改造后的钠尿肽嵌合体具有显著地舒张血管、利尿、保护心肌作用。这种新型钠尿肽嵌合体可用于学术研究，也可为临床应用钠尿肽嵌合体防治心力衰竭提供可能的新药，因此具有良好的科学研究价值和应用前景。

技术实现要素：
CNAAc的命名以其结构组成而来：即CNP的氨基端(CN)加ANP的环状结构(A)和ANP的羧基端(Ac)。CNAAc理论分子量为2837.1g/mol，氨基酸序列为GLSKGCFGGRMDRIGAQSGLGCNSFRY，两个半胱氨酸残基之间以二硫键相连(图1)。我们委托上海吉尔生化有限公司进行CNAAc的合成，合成产物呈白色粉末状。通过高效液相色谱-质谱联用检测纯度在95％以上，所测分子量与理论值相一致。为了检测CNAAc的作用，我们做了以下几方面的实验研究。详细的实验方法、步骤见具体实施方式。一、CNAAc舒血管作用的研究CNAAc舒血管效应的研究是通过分离大鼠腹主动脉后，应用离体血管环灌流实验来实现的。(一)CNAAc与ANP、CNP舒血管作用的比较首先将灌流浴槽中血管的基础张力定为1g，将去甲肾上腺素加入10ml的浴槽中，使其终浓度为10-6M，其可引起显著的血管收缩作用。将CNAAc按浓度梯度加入浴槽，使浴槽中CNAAc的终浓度依次为10-10、10-9、10-8、10-7、10-6M。实验结果表明：CNAAc可以剂量依赖性地舒张大鼠的离体腹主动脉(图2A)，且其最大舒张效应远高于其“母体”CNP或ANP(图2B)，在保留内皮和去内皮组其舒张效应没有显著性差异(图2C)。(二)CNAAc舒血管机制的研究应用钠尿肽受体A阻断剂ab14356(1∶1000)、鸟苷酸环化酶(guanylatecyclase，GC)抑制剂镁蓝(methyleneblue，MB，10-5M)可以部分阻断CNAAc的舒张作用(图3A，3B)，应用cGMP依赖性蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT5823(10-6M)可将CNAAc的舒张作用完全阻断(图3C)，说明CNAAc可能通过NPR/cGMP/PKG信号通路发挥舒张血管的作用。上述结果表明：新合成的钠尿肽嵌合体CNAAc具有显著地不依赖于内皮的舒张动脉的作用，且可能是通过NPR/cGMP/PKG信号通路发挥作用的。二、CNAAc利尿作用的研究按照图4所述步骤，Sham组大鼠在经颈静脉给予CNAAc后，尿量较基础期增加了约10倍，与Sham+NS组相比有非常显著性差异(P<0.01)；HF组给予CNAAc后，尿量较基础期增加了约5倍，与HF组给予生理盐水后尿量的增加有非常显著性差异(P<0.01)(图5)。三、CNAAc对心力衰竭大鼠心脏的保护作用CNAAc对心力衰竭大鼠心脏的保护作用的实验研究，是通过结扎大鼠的冠状动脉左前降支建立大鼠心力衰竭模型来实现的。(一)CNAAc对大鼠心肌肥厚的影响心肌肥厚是多种心血管病的共同病理过程，也是心力衰竭发生的结果。HF及HF+CNAAc组在术后4周时BW均显著性降低(P<0.01)，HF组的HW/BW、LVW/BW与对照组相比均显著增加，表明心肌肥厚的发生，经过4周的给药后，HF+CNAAc组的HW/BW、LVW/BW与HF组相比显著降低(P<0.01)(表1)。表1CNAAc对大鼠心肌肥厚指数的影响BW：体重；HW：心脏重量；LVW：左心室重量**P<0.01vs.Sham；#P<0.05，##P<0.01vs.HF.(二)CNAAc对大鼠心脏功能的影响心脏超声心动图显示HF组的左室前壁搏动幅度减弱，心室容积增大(图6A)；与对照组相比，HF组的各项指标均有非常显著性改变(P<0.01)(图6B，6C，6D，6E，6F，6G)；与HF组相比，HF+CNAAc组大鼠的EF、FS...