专利名称：生理学活性肽的液体制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物利用率提高的生理学活性肽或生理学活性蛋白的液体制剂，以及一种用于提高生理学活性肽或生理学活性蛋白的生物利用率的方法。
背景技术：
目前，市场上有多种生理学活性肽或生理学活性蛋白的药物制剂销售。这类生理学活性肽或生理学活性蛋白是胰岛素、生长激素、心房钠尿肽、降钙素、LHRH类似物、甲状旁腺激素、促肾上腺皮质激素衍生物。因为这些化合物在胃肠道中，由于蛋白酶的作用而被灭活，因此很少以口服制剂的方式给药；最常将其配制为非肠道制剂如注射剂临床使用。
通过注射对疾病进行持续的长期治疗要求患者前往医院或诊所接受治疗，从而给患者造成很大负担。因此，需要患者可自行施用的皮下注射剂。然而，通过皮下注射给药的药物，在皮下吸收过程中被蛋白酶分解，因此与通过静脉内注射相比，其生物利用率通常较低。
与静脉内给药相比，为了补偿药物的低生物利用率，目前使用的皮下注射剂含有更高剂量的药物或要求频繁给药。因此，皮下注射剂仍然对患者造成压力。此处所用术语“生物利用率(BA)”是指所给予的药物有多少到达血液循环(也称作生物利用率的程度(EBA))。
生长素释放肽，一种结合生长激素促分泌剂受体(GHS-R)的内源性生长激素促分泌剂(GHS)，是1999年首先从大鼠胃里分离出来的一种生理学活性肽(非-专利文献1)。其后，从包括人、小鼠、猪、小鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、蛙、虹鳟鱼和狗在内的其它脊椎动物中也分离出、或通过cDNA分析证实了具有类似一级结构的生长素释放肽。它们的一级结构如表1所示。此外，从猫和山羊中也分离出了生长素释放肽。
(表1) (表1中，氨基酸残基由IUPAC/IUC单字母代码表示)
在这些动物中发现的内源性生长素释放肽是一种具有独特疏水修饰结构的肽，其中第3位的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)残基被辛酸和癸酸等脂肪酸酰化。生长素释放肽结合生长激素促分泌剂受体，以增加钙离子的胞内水平。研究已经揭示了生长素释放肽是一种有效的调节生长激素分泌的生长激素促分泌剂。因此，生长素释放肽的生理学作用和潜在的药物应用得到广泛地关注(专利文献1)。本发明中所有类型的天然存在的生长素释放肽统称为″生长素释放肽″。
将天然动物生长素释放肽的部分缺失或置换获得的生长素释放肽衍生物或类似物应用于各种疾病的治疗引起人们广泛地关注(专利文献3)。
在生长素释放肽衍生物中，疏水修饰结构不像天然生长素释放肽那样含有辛酰基(C8)生长素释放肽，但其含有不同的修饰结构，如含具有2-20，优选4-12个碳原子的脂肪酸，例如，己酰基(C6)，癸酰基(C10)和十二烷酰基(C12)；或其中含有脂肪酸支链或不饱和衍生物；或含芳香环，如苯丙酰基；或含有金刚烷主链。当天然动物生长素释放肽的疏水修饰结构与肽主链经由酯键结合时，该键可由生长素释放肽衍生物中的酯、醚、硫醚、酰胺、或二硫键提供(专利文献1)。
尽管对生长素释放肽，生长素释放肽衍生物以及生长素释放肽类似物在药物产品中的应用有很高的预期，但是仍然没有设计出有效的药物组合物，并且关于化合物的药动学仍然未知。
关于使用生长素释放肽类的药物组合物，专利文献2描述了pH对生长素释放肽类水溶液的作用，以及一种防止生长素释放肽类的疏水修饰结构分解的方法。根据专利文献2，生长素释放肽类在pH2-7的范围的水溶液中是稳定的。可利用pH调节剂和缓冲液调节溶液的pH。缓冲液用于使水溶液pH的改变在贮存过程中达到最小。专利文献2描述的缓冲液有甘氨酸-盐酸缓冲液，醋酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，乳酸缓冲液，磷酸缓冲液，柠檬酸-磷酸缓冲液，磷酸-醋酸-硼酸缓冲液和邻苯二甲酸缓冲液(专利文献2，p.11，5-14行)。
在专利文献2描述的实施例中，在McIlvaine缓冲液(柠檬酸水溶液和磷酸氢二钠水溶液的混合物)，Britton-Robinson缓冲液(磷酸/醋酸/硼酸水溶液和氢氧化钠水溶液的混合物)，柠檬酸缓冲液，甘氨酸-盐酸缓冲液和醋酸缓冲液中实验了生长素释放肽的稳定性。而专利文献2描述了备溶液中生长素释放肽类的稳定性是通过维持溶液的pH在2-7的范围之内加以保证的，而没有提及有关给予患者时，化合物的动力学。
在设计含有肽或蛋白的药物组合物时，重要的是确保肽或蛋白在给药前的稳定性，这是因为肽和蛋白通常在水溶液中是不稳定的。然而，更重要的是设计一种能够有效引发所给予化合物的活性的制剂。
专利文献1WO01/07475号公报
专利文献2WO03/097083号公报
专利文献3特表2004-514651号公报
专利文献4特公昭63-40166号公报
专利文献5特许第2643426号
专利文献6特表2004-522803号公报
专利文献7特公平2-19092号公报
专利文献8特公平5-24129号公报
专利文献9特许第3120987号
非专利文献1Kojima等人，Nature，vol.402，656-660页，1999
非专利文献2Tokihiro等人，J.Pharm.Pharmacol.，vol.52，911-917页，2000
发明内容
本发明所要解决的问题
生长素释放肽类是生理学活性肽，其易于被蛋白酶消化，因此优选通过非肠道途径，特别是，通过注射给药。甚至在通过注射，以皮下给药方式给予生长素释放肽时，仍然需要确保所注射的生长素释放肽自注射部位被吸收并到达血液循环。然而，通常，皮下注射肽的低BA使得难以设计有效的注射剂。
目前正在以药物的给药量与所获得的药理学作用作为指标进行研究，以确定获得特定药理学作用的生长素释放肽类的有效剂量。为了有效且安全地施用药物，必需控制药物的血液水平，并确立制剂技术以增加药物吸收。
皮下注射的肽的BA通常为约20％-40％，其低于其它药物的BA。我们检测了在大鼠和猴中皮下注射的生长素释放肽的BA并发现生长素释放肽的BA显著低于其它皮下注射的肽在大鼠中至多为5％且在猴中至多为3％。先前的研究没有报道过这个事实。
影响给定药物BA率变化的可能因素是药物从应用部位向附近外周血转移的效率和速率。这些因素取决于药物的性质和应用部位，包括分子量，pKa和脂肪溶解度以及决定药物在体液和组织中的扩散性和药物通过生物膜的渗透性的其它生理学性质，和应用部位的组织形态学和生理学性质。
给定药物的低BA必须通过增加给药剂量和频率来补偿，从而达到有效的药物血浆水平。因为这样做给患者带来很大的负担，因此需要制剂技术来增加药物的BA。
本发明的目的是确保作为药物施用的、包括生长素释放肽类在内的生理学活性肽或蛋白的高BA，提供所述肽或蛋白的有效液体制剂。本发明另一目的是提供一种用于提高以水溶液形式皮下注射的、包括生长素释放肽类在内的生理学活性肽或蛋白的BA的方法。解决问题的手段
为了达到上述目的，本发明人检测了通过注射给药后，生长素释放肽类的血液水平。
具体而言，我们给予生长素释放肽以及用于注射剂中的不同助剂并监测其BA。所用助剂包括作为等渗剂的甘露糖醇，作为加溶剂的脲和醋酸钠缓冲液(pH4.0)。将这些试剂与生长素释放肽混合并皮下注射到大鼠中。结果醋酸钠缓冲液(pH4.0)使BA明显增加至35.3％。而所实验的其它试剂没有观察到BA显著增加最大的增加为脲所致的3.4％。
然后我们给予生长素释放肽以及不同的酸性溶液并监测其BA。结果，所实验各溶液的BA均增加了。
因此，我们证实了通过将生长素释放肽与酸性溶液一起皮下注射可显著增加生长素释放肽的BA。
我们还证实了可通过改变酸性溶液的类型、浓度和pH控制生长素释放肽的BA。我们还发现根据酸性溶液类型的不同，生长素释放肽的BA可被提高至不同的程度。这表明除了生长素释放肽制剂或生长素释放肽溶液的类型和pH之外的因素也与生长素释放肽的BA的提高有关。
我们还发现将生长素释放肽与极性有机液体一起进行皮下注射，也可使生长素释放肽的BA显著提高。
我们还发现当把生长素释放肽与酸性溶液和极性有机液体共同施用，较之将生长素释放肽与所述两者中的一种一起施用而言，生长素释放肽的BA的增加更显著。
我们还发现通过将生长素释放肽与酸性溶液和糖，或生长素释放肽与极性有机液体和糖共同皮下注射可显著增加生长素释放肽的BA。
我们还发现不仅相对于生长素释放肽，相对于用作药物的其它生理学活性肽或蛋白也观察到酸性溶液和/或极性有机液体和/或糖有促进BA的能力。
因此，本发明的具体实施方案包括下列 (1)一种液体制剂，其含有作为活性成分的生理学活性肽或生理学活性蛋白以及酸性溶液； (2)根据上面(1)所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液包含选自醋酸，乳酸，磷酸，甘氨酸，柠檬酸，盐酸，丙酸，丁酸，苯甲酸及其盐中的一种、两种或多种的组合； (3)根据上面(1)所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液包含选自醋酸，乳酸，丙酸，丁酸和/或磷酸，及其盐中的一种或两种或多种的组合； (4)根据上面(1)或(2)所述的液体制剂，具有3.0-7.0的pH； (5)根据上面(1)-(3)任意一项所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液的浓度为1-1000mM； (6)根据上面(1)-(3)任意一项所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液的浓度为10-500mM；和 (7)根据上面(1)-(6)任意一项所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液是具有3.0-7.0pH的酸缓冲液。
本发明的其它实施方案包括下列 (8)一种液体制剂，其含有作为活性成分的生理学活性肽或生理学活性蛋白以及极性有机液体； (9)根据上面(1)-(7)任意一项所述的液体制剂，其含有作为活性成分的生理学活性肽或生理学活性蛋白以及极性有机液体； (10)根据上面(8)或(9)所述的液体制剂，其中所述的极性有机液体是选自醇和/或N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二甲亚砜和羟苯甲酸甲酯中的一种或两种或多种的组合； (11)根据上面(8)或(9)所述的液体制剂，其中所述的极性有机液体是选自苯甲醇，乙醇，苯酚，叔-丁醇，氯丁醇，N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或两种或多种的组合； (12)根据上面(8)-(11)任意一项所述的液体制剂，其中所述的极性有机液体的浓度为0.001-80％(w/v)； (13)根据上面(8)-(11)任意一项所述的液体制剂，其中所述的极性有机液体的浓度为0.1-10％(w/v)； (14)根据上面(1)-(7)任意一项所述的液体制剂，还含有糖； (15)根据上面(8)-(12)任意一项所述的液体制剂，还含有糖； (16)根据上面(1)-(7)任意一项所述的液体制剂，还含有极性有机液体和糖； (17)根据上面(14)-(16)任意一项所述的液体制剂，其中所述的糖是选自甘露糖醇，蔗糖，葡萄糖和环糊精中的一种或两种或多种的组合； (18)根据上面(14)-(17)任意一项所述的液体制剂，其中所述的糖是环糊精；和 (19)根据上面(14)-(17)任意一项所述的液体制剂，其中所述的糖的浓度为0.1-20％(w/v)。
本发明更具体的实施方案包括下列 (20)根据上面(1)-(19)任意一项所述的液体制剂，其中所述的生理学活性肽或生理学活性蛋白是选自生长素释放肽类，人高血糖素-样肽-1(hGLP-1)，人心房钠尿肽(hANP)，人髓质素，人甲状旁腺激素(hPTH(1-34))和人胰岛素中的一种； (21)根据上面(1)-(19)任意一项所述的液体制剂，其中所述的生理学活性肽或生理学活性蛋白是生长素释放肽类； (22)根据上面(1)-(19)任意一项所述的液体制剂，其中生长素释放肽类是生长素释放肽； (23)根据上面(1)-(19)所述的液体制剂，其中生长素释放肽是人生长素释放肽； (24)根据上面(1)-(19)任意一项所述的液体制剂，其中生长素释放肽类的浓度为0.03nmol/mL-15μmol/mL； (25)根据上面(1)-(24)任意一项所述的液体制剂，用作注射剂；和 (26)根据(25)所述的液体制剂，用作皮下注射剂或肌内注射剂。
本发明甚至更具体的实施方案包括下列 (27)一种液体制剂，包含作为活性成分的生长素释放肽类；选自醋酸，乳酸，丙酸，丁酸和/或磷酸中的一种或两种或多种的组合的酸溶液；和选自苯甲醇，乙醇，苯酚，叔-丁醇，N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或两种或多种的组合的极性有机液体，其中所述的液体制剂具有3.0-7.0的pH；和 (28)一种用于提高生长素释放肽的生物利用率的方法，包括向生长素释放肽的水溶液中加入酸性溶液和极性有机液体。
发明的效果
根据本发明，提供一种有效的液体制剂，其可使作为药物施用的、包括生长素释放肽类在内的生理学活性肽或蛋白实现较高的生物利用率(BA)。
还提供一种用于提高以水溶液的形式皮下注射的、包括生长素释放肽类在内的生理学活性肽或蛋白的BA的方法。
因此，本发明能够维持皮下注射的、包括生长素释放肽类在内的生理学活性肽或蛋白的血液水平。迄今为止，人们都认为很难维持皮下注射的肽和蛋白的治疗有效的血浆水平。因此，本发明在医药学方面是极为重要的。
实现本发明的最佳方式
下面详细描述包含作为活性成分的生长素释放肽类等生理学活性肽或蛋白的本发明的液体制剂，以及用于提高生理学活性肽或蛋白的BA的方法。
用于本发明中的生长素释放肽类是内源性生长激素促分泌剂(GHS)它们是可增加钙离子胞内水平并诱导生长激素分泌的肽。此处所用术语″生长素释放肽″包括源于动物中天然存在的生长素释放肽以及在天然存在的生长素释放肽主链氨基酸序列中插入、缺失、置换和/或添加一部分氨基酸，但仍具有与天然生长素释放肽等同的生理学活性的所有生长素释放肽衍生物。
用于本发明中的天然生长素释放肽类优选来源于人、大鼠、猪、小鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、蛙、虹鳟鱼和狗的天然生长素释放肽。适用于本发明的生长素释放肽衍生物包括其中第3位的丝氨酸残基被具有4-12个碳原子的脂肪酸、但非辛酰基酰化的那些，或第3位的丝氨酸残基上没有辛酰基修饰的脱-辛酰基生长素释放肽。
当该液体制剂用于给予人类患者时，优选使用人生长素释放肽。
生长素释放肽可以以游离肽或盐的形式提供。游离肽形式和盐形式的生长素释放肽可通过常规技术彼此转化。游离肽可通过使其与无机酸或有机酸反应而转化为药学可接受的盐。药学可接受的盐的例子包括与无机酸形成的盐，如碳酸盐、碳酸氢盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐和硼酸盐，和与有机酸形成的盐，如琥珀酸盐、醋酸盐、丙酸盐和三氟醋酸盐。
该肽还可与无机碱，包括碱金属如钠和钾和碱土金属如钙和镁，或与有机碱包括有机胺如三乙胺，和碱性氨基酸如精氨酸形成盐。该肽还可形成金属络合物(如铜络合物和锌络合物)。
用于本发明中的生长素释放肽可以是任意来源可从天然原料中分离它，或可通过常规技术如化学合成、化学半合成、基因重组或这些技术的组合获得。可选择性地，可从活的生物中提取它。这种技术的其中一个例子在专利文献1中描述。
生长素释放肽可以以适用于药物产品的任意浓度用于本发明的液体制剂中。具体而言，生长素释放肽的最低浓度被定义为它可提供药物产品所需作用的浓度，而最高浓度被定义为它可完全溶于水溶液中的浓度。优选通常所用的液体制剂中生长素释放肽浓度的范围是约0.03nmol/mL-约15μmol/mL，且更优选约0.03nmol/mL-约6μmol/mL。
用于本发明液体制剂中的酸性溶液是含羧基化合物的溶液。酸性溶液的例子包括醋酸，乳酸，柠檬酸，盐酸，丙酸，丁酸，苯甲酸，硫酸，硝酸，硼酸，碳酸，重碳酸，葡糖酸，琥珀酸，富马酸，马来酸，甲磺酸，苹果酸，三氟醋酸及其盐。该酸性溶液可含有选自这些酸的盐中的一种或两种或多种的组合。优选该酸性溶液含有选自醋酸，乳酸，磷酸，甘氨酸，柠檬酸，盐酸，丙酸，丁酸，苯甲酸及其盐中的一种或两种或多种的组合。更优选该酸性溶液含有选自醋酸，乳酸，丙酸，丁酸和/或磷酸，及其盐中的一种或两种或多种的组合。
该酸性溶液的浓度可以是可增加生长素释放肽的BA的任意浓度优选1mM-1000mM且更优选10mM-500mM。
优选使水溶液pH的变化尽可能的小，以便保证生长素释放肽在贮存过程中的稳定性。最后，可使用缓冲液。缓冲液优选具有3.0-7.0的pH。虽然加入缓冲液之后液体制剂的pH是稳定的，但由于所用缓冲液的浓度或在某些特定条件下，pH也可能发生约0.1-约0.2的变化。这种变化也包括在本发明的范围内。
用于本发明中的缓冲液的具体例子包括醋酸缓冲液(包括醋酸钠缓冲液和醋酸铵缓冲液)，乳酸缓冲液，磷酸缓冲液(包括磷酸钠缓冲液)，甘氨酸盐酸缓冲液，柠檬酸缓冲液(包括柠檬酸钠缓冲液)，柠檬酸-磷酸缓冲液(包括Mcilvaine缓冲液)，磷酸-醋酸-硼酸缓冲液(包括Britton-Robinson缓冲液)，邻苯二甲酸缓冲液和丙酸缓冲液。这些缓冲液可单独或组合使用。醋酸缓冲液，丁酸缓冲液，丙酸缓冲液，乳酸缓冲液和/或磷酸缓冲液特别适用于本发明。
该液体制剂优选具有3.0-7.0且优选4.0-7.0的pH。虽然具有低于pH3.0的制剂可增加生长素释放肽的BA，但它可引起疼痛，特别是当用作注射剂时，因此是不好的。
除了上述缓冲液外，pH调节剂可用于调节本发明液体制剂的pH。pH调节剂的例子包括盐酸，硫酸，硝酸，硼酸，碳酸，重碳酸，葡糖酸，氢氧化钠，氢氧化钾，氨水，柠檬酸，一乙醇胺，乳酸，醋酸，琥珀酸，富马酸，马来酸，磷酸，甲磺酸，苹果酸，丙酸，三氟醋酸及其盐。
除了pH调节剂外，极性有机液体可用于本发明中。加入极性有机液体可较之单独使用酸性溶液而言，可进一步增加皮下注射的生长素释放肽的BA。我们发现向本发明的液体制剂中加入极性有机液体，如醇可增加生长素释放肽的BA或调节生长素释放肽的吸收模式。
注射剂必须是无菌的。可将防腐剂或灭菌剂加入到注射剂中，特别是分次使用该注射剂时。用于该目的的添加剂的例子包括苯甲醇，氯丁醇，苯酚和对氧苯甲酸酯。
因为注射剂的给药常常伴有疼痛，因此注射剂可含有疼痛-缓解剂以减轻疼痛。用于该目的的添加剂的例子包括苯甲醇，氯丁醇，苯酚和局部麻醉剂如普鲁卡因和盐酸利多卡因。
专利文献4描述了除了活性成分外，还含有作为疼痛-缓解剂的苯甲醇或其类似物和环糊精的注射剂。苯甲醇用于减少与注射有关的疼痛。苯甲醇或其类似物用于预防苯甲醇引起的溶血。
醇常常用作防腐剂、灭菌剂或疼痛-缓解剂。本发明人发现醇和其它极性有机液体可提高酸性溶液增加液体制剂中生长素释放肽的BA的能力。没有先前的研究报道过该独特的现象。
用于本发明中的醇的例子包括苯甲醇，氯丁醇，苯酚，甲醇，乙醇，丙醇，丁醇，异丙醇，2-丁醇，异丁醇，甲酚，间-甲酚，氯甲酚，对氧苯甲酸酯(如羟苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯)，肌醇，丙二醇，丁二醇，鲸蜡醇，硬脂醇，己基癸醇，己三醇，二十二醇，月桂醇，羊毛脂醇，丙三醇(甘油)，乙二醇，二甘醇，二甘醇一丁醚，二甘醇一甲醚，薄荷醇，莰醇，麦芽糖醇，乙基麦芽糖醇，丁子香酚，香叶醇，麝香草酚，二异丙醇胺，二乙醇胺和氨丁三醇。苯甲醇，乙醇，苯酚，叔-丁醇和氯丁醇特别适用于本发明。
除了醇外，某些极性有机液体，如N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二甲亚砜和羟苯甲酸甲酯也可增加生长素释放肽的BA。
这些极性有机液体可单独或组合使用。该极性有机溶剂可以以能够发挥其作用，但不会在本发明药物的生产和长期贮存的过程中造成任何问题的用量使用。极性有机液体的用量是当液体制剂形成用于给药的溶液时，溶液中极性有机液体的浓度为0.001-80％(w/v)且优选0.1-20％(w/v)。
还可将其它添加剂加入到本发明的液体制剂中，这取决于所需目的。这些添加剂是等渗剂，如氯化钠和甘露糖醇；灭菌剂如苯甲酸钠；抗氧剂如亚硫酸氢钠，焦亚硫酸钠和抗坏血酸以及疼痛-缓解剂，如盐酸利多卡因和盐酸丙酯卡因。
正如所述，本发明提供含有作为活性成分的、包括生长素释放肽类的生理学活性肽或蛋白，并确保高BA的液体制剂。可将添加剂加入到液体制剂中以提供各制剂所需的性质。例如，可将某些添加剂加入到注射剂中，从而提供最佳渗透压、最佳溶解性、低刺激性、高灭菌效果并防止吸附。
本发明的液体制剂用于非肠道给药。具体而言，它用于注射、输注和鼻给药。本发明可用于不同的注射类型，包括静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌内注射和静脉内滴注，皮下注射和肌内注射时，BA的增加最显著。
本发明的液体制剂可通过药物产品的生产中常用的方法生产。在其中一个示例性的方法中，将包括生长素释放肽类的生理学活性肽或蛋白冻干产品溶于纯化水中，从而形成药物溶液。同时，将缓冲液和其它添加剂溶于纯化水中形成添加剂溶液。将药物溶液和添加剂溶液共同混合，并根据需要加工该混合物(例如，灭菌和过滤)。将该加工过的混合物密封在安瓿或小瓶中，从而获得生长素释放肽制剂的终产品。
注射剂常常以使用时形成溶液的制剂形式提供。当很难维持溶液形式的活性成分的稳定性时需要该类型的制剂。本发明还包括“用前溶解(dissolved-upon-use)”的制剂，其可形成含有作为活性成分的生理学活性肽或蛋白，包括生长素释放肽的液体制剂。该用前溶解的制剂可通过下列两种过程中的任一种生产将适当选择的上述添加剂并以所需用量加入到固体生长素释放肽产品，如粉末状生长素释放肽中，以形成固体组合物，或适当选择上述添加剂并以所需用量加入到生长素释放肽的水溶液中，以形成液体组合物，其反过来可制备固体组合物。使用时，将这些固体组合物溶于溶剂如水中，形成液体制剂。除了水外的溶剂，如乙醇和2-丙醇，也可以药学可接受的用量使用。
当以固体组合物的形式提供包括生长素释放肽的生理学活性肽或蛋白时，可将糖加入到本发明的制剂中。我们已经发现，当与酸性溶液和/或极性有机液体联合使用时，该糖可进一步增加包括生长素释放肽的生理学活性肽或蛋白的BA。
用于本发明中的糖的例子包括单糖，如甘露糖醇，葡萄糖，果糖，肌醇，山梨糖醇和木糖醇；二糖如白糖(蔗糖)，乳糖，麦芽糖和海藻糖；多糖，如淀粉、葡聚糖、普鲁分支葡萄糖、海藻酸、透明质酸、果胶酸、植酸、植酸钙镁、壳多糖和脱乙酰壳多糖；糊精，如α-环糊精，β-环糊精，γ-环糊精，糊精，羟丙基淀粉和羟乙基淀粉；和纤维素，如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素钠。这些糖可单独或组合使用。
这些糖中，甘露糖醇，蔗糖，葡萄糖和环糊精特别优选用于本发明中，还糊精是最优选的。
已经报道过，不同的环糊精中，磺丁基醚β-环糊精衍生物(β-CyDs)可增加皮下注射到大鼠中的胰岛素的BA(非-专利文献2)。
当加入到药物产品中时，环糊精可提高溶解性较低化合物的溶解性和药物产品的贮存稳定性是公知的。
专利文献6描述了含有干扰素多肽和磺烷基醚环糊精的制剂。在该制剂中，磺烷基醚环糊精衍生物可作为组合物的稳定剂发挥作用并帮助维持干扰素多肽的生物活性。
专利文献7描述了含有生理学活性多肽和环糊精的鼻用制剂，而专利文献8描述了含有生理学活性多肽和还糊精的阴道用制剂。该鼻用制剂和阴道用制剂是分别作为非-注射制剂研制的，可促进生理学活性多肽的胃肠道吸收，否则其被胃肠道腔或壁中存在的酶水解。在这些制剂中，环糊精可促进生理学活性多肽的吸收。
专利文献9描述了一种在β-和γ-环糊精的帮助下，使干扰素和其它蛋白溶解和稳定的方法。然而，这些文献均没有暗示或公开如何增加皮下注射的生理学活性肽或蛋白的BA。
这些糖可单独使用或组合使用。该糖的量可以是使其发挥所需作用的浓度，且其不会在该药物的生产和长期贮存过程中造成任何问题，也不会在提供具有适宜粘度的液体制剂时，在液体制剂的生产和给药过程中造成任何问题。例如，该糖的用量是在液体制剂形成用于给药的溶液时，溶液中糖的浓度为0.1-20％(w/v)。
正如所述，本发明证实了向含有生理学活性肽或蛋白的液体制剂中加入酸性溶液、极性有机液体或糖可显著增加该肽或蛋白的BA，甚至是在皮下注射该制剂时也是如此。用于本发明中的生理学活性肽或蛋白的例子包括生长素释放肽及其衍生物和类似物，人高血糖素-样肽-1(hGLP-1)，人心房钠尿肽(hANP)，人髓质素，人甲状旁腺激素(hPTH(1-34))和人胰岛素。本发明提供一种皮下给予的生理学活性肽或蛋白，如生长素释放肽类的新方式，所述的生理活性肽或蛋白以其它方式不能通过皮下给药达到药学有效的血浆水平。
实施例
下面参考实施例进一步详细说明本发明，但所述实施例不以任何方式限制本发明的范围。
下列实施例中所用的缩写词具有下述含义。除非另有说明，在实验中使用下列方法和仪器。
[所用仪器] (A)pH测量 仪器CASTANY LAB pH计量器F-22，Horiba Ltd. (B)放射免疫测定(RIA) 仪器γ-计数器COBRA-II，Packard Instruments Co.，Ltd. (C)酶-联免疫溶剂测定(ELISA) 仪器微量培养板读板器，Molecular Devices Corp.
比较实施例1含有人生长素释放肽的制剂的制备(1) 依如下表2所示的不同浓度将人生长素释放肽溶于5％(w/v)甘露糖醇水溶液，生理盐水或10％(w/v)蔗糖水溶液中，从而制备No.1-5和No.34及35的制剂。
(表2)
实施例1含有人生长素释放肽的制剂的制备(2) 依如下所述制备下列缓冲液0.5M醋酸钠缓冲液，0.5M醋酸铵缓冲液，0.5M醋酸缓冲液，0.5M磷酸钠缓冲液，0.5M柠檬酸缓冲液，0.5M甘氨酸盐酸缓冲液，1M乳酸缓冲液，0.06M丙酸缓冲液和0.06M正-丁酸缓冲液。各缓冲液的pH在圆括号中给出。
(1)0.5M醋酸钠缓冲液(pH7.0) 将纯化水加入到8.20 g醋酸钠(MW＝82.03)中至100mL的体积。向该溶液中加入1M盐酸至pH 7.0。进一步加入纯化水至200mL终体积。
(2)0.5M醋酸钠缓冲液(pH4.0) 将纯化水加入到8.20g醋酸钠(MW＝82.03)中至100mL的体积。向该溶液中加入1M盐酸至pH4.0。进一步加入纯化水至200mL终体积。
(3)0.5M醋酸钠缓冲液(pH5.0) 将纯化水加入到8.20g醋酸钠(MW＝82.03)中至100mL的体积。向该溶液中加入1M盐酸至pH5.0。进一步加入纯化水至200mL终体积。
(4)0.5M醋酸钠缓冲液(pH6.0) 将纯化水加入到8.20g醋酸钠(MW＝82.03)中至100mL的体积。向该溶液中加入1M盐酸至pH6.0。进一步加入纯化水至200mL终体积。
(5)0.5M醋酸铵缓冲液(pH4.0) 将纯化水加入到7.71g醋酸铵(MW＝77.08)中至100mL的体积。向该溶液中加入1M盐酸至pH4.0。进一步加入纯化水至200mL终体积。
(6)0.5M醋酸缓冲液(pH4.0) 将纯化水加入到6.01g醋酸(MW＝60.05)中至100mL的体积。向该溶液中加入1M氢氧化钠至pH4.0。进一步加入纯化水至200mL终体积。
(7)0.5M磷酸钠缓冲液(pH4.0) 将纯化水加入到15.60g磷酸二氢钠二水合物(MW＝156.01)中至100mL的体积。向该溶液中加入1M盐酸至pH4.0。进一步加入纯化水至200mL终体积。
(8)0.5M磷酸钠缓冲液(pH5.0) 将纯化水加入到15.60g磷酸二氢钠二水合物(MW＝156.01)中至100mL的体积。向该溶液中加入1M氢氧化钠至pH5.0。进一步加入纯化水至200mL终体积。
(9)0.5M柠檬酸缓冲液(pH4.0) 将纯化水加入到10.51g柠檬酸一水合物(MW＝210.14)中制备100mL柠檬酸水溶液。同时，将纯化水加入到14.71g柠檬酸三钠(MW＝294.10)中制备100mL柠檬酸三钠水溶液。将柠檬酸水溶液与柠檬酸三钠水溶液共同混合，获得所需具有pH4.0的缓冲液。
(10)0.5M甘氨酸盐酸缓冲液(pH4.0) 将纯化水加入到7.51g甘氨酸(MW＝75.07)中至100mL的体积。向该溶液中加入1M盐酸至pH4.0。进一步加入纯化水至200mL终体积。
(11)1M乳酸缓冲液(pH4.0) 将纯化水加入到45.04g乳酸(MW＝90.08)中至250mL的体积。向该溶液中加入1M氢氧化钠至pH4.0。进一步加入纯化水至500mL终体积。
(12)0.06M丙酸缓冲液(pH4.0) 纯化水加入到2.22g丙酸(MW＝74.08)中至250mL的体积。向该溶液中加入1M氢氧化钠至pH4.0。进一步加入纯化水至500mL终体积。
(13)0.06M正-丁酸缓冲液(pH4.0) 将纯化水加入到2.64g丁酸(MW＝88.11)中至250mL的体积。向该溶液中加入1M氢氧化钠至pH4.0。进一步加入纯化水至500mL终体积。
将这些缓冲液或通过稀释该缓冲液获得的溶液用作酸性溶液。将酸性溶液、人生长素释放肽和任选的添加剂共同混合制备No.6-33，No.51-59，No.73，和No.81-97的制剂，其中所含人生长素释放肽的浓度在表3中给出。
(表3.1)
(表3.2)
(表3.3)
将上述缓冲液或通过稀释该缓冲液获得的溶液用作酸性溶液。将酸性溶液、不同的肽和任选的添加剂共同混合制备No.36-50和No.98-107的制剂，其中所含肽的浓度在表4中给出。
(表4.1)
(表4.2)
在不加入酸性溶液的条件下，将人生长素释放肽与添加剂混合在一起，制备No.60-68，No.70-72，No.74，No.76，和No.78-No.80的制剂。
(表5)
上述制剂中所用的一些药物添加剂在日本药局方中列出。所有这些添加剂均满足日本药局方中说明的标准。
比较实施例2在大鼠中静脉内和皮下注射生长素释放肽的药动学 静脉内和皮下给予大鼠比较实施例1中获得的No.2和No.3制剂并测量生长素释放肽的血浆水平。
使用7-周龄，雄性SD大鼠(Charles River Laboratories JapanInc.)。每组三只大鼠用于实验。静脉内给药时，向每只均具有插入到股动脉中的聚乙烯试管(PE-50，Clay Adams Co.，Ltd.)的三只动物给药。使用注射器和26G针(各自购自Terumo Co.，Ltd.)，以0.5mL/kg剂量通过尾部静脉给予No.2的制剂。在给药前和给药后1，3，5，10，20，30，60，和90分钟，从股动脉中的聚乙烯试管采集血液样品。
同样，使用注射器和26G针，以1mL/kg的剂量在背部皮肤中皮下给予每只均具有插入到股动脉中的聚乙烯试管的三只动物No.3的制剂。在给药前和给药后5，10，20，和30分钟采集股动脉中聚乙烯试管的血液样品。
采集样品后，立即向各样品中加入1/100的EDTA 2Na 2H2O溶液和1/50的AEBSF溶液。然后使样品离心以分离血浆，立即向其中加入1/10的1N盐酸。混合样品并在-80℃贮存，直到进行分析。
然后使用抗-生长素释放肽抗体，通过放射免疫测定(RIA)分析血浆样品的生长素释放肽水平。具体而言，将抗-生长素释放肽抗体，然后是[125I-Tyr29]生长素释放肽加入到各血浆样品中用于竞争。随后，加入第二种抗体使抗体-生长素释放肽复合物沉淀。分离上清液并通过γ-计数器(Packard Instruments Co.，Ltd.)分析放射性。因为用于测定的抗-生长素释放肽抗体可特异性识别生长素释放肽，而不识别脱-酰基生长素释放肽(没有辛酰基的生长素释放肽的非活性形式)，因此该测定可特异性检测活性的生长素释放肽。
图1表示血浆生长素释放肽随时间的变化。图1所示结果用于测定备注射途径的下列药动学参数最大血浆生长素释放肽浓度(Cmax)和在达到最大血浆浓度之前它所花费的时间(Tmax)。推断0时间点静脉内给药的浓度(C0)。使用该梯形方法，计算各注射途径的浓度曲线下的面积(AUC)。然后，AUC用于测定生长素释放肽的生物利用率(BA)。结果在表6中给出。这些值是每组三只大鼠获得的数据的平均值。
表6使用5％甘露糖醇水溶液静脉内或皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数
(表6)
正如从表6的结果所观察到的，经测定以10μg/kg剂量静脉内给药的AUC为205.98ng min/mL，而以50μg/kg剂量皮下给药的No.3制剂的AUC为25.72ng min/mL。因此，经测定溶于5％甘露糖醇水溶液中的人生长素释放肽的BA为2.5％.
实施例2醋酸钠缓冲液对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.34，No.6和No.7的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。结果在图2中表示。药动学参数在表7中给出。
表7皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(醋酸钠缓冲液的作用)
(表7)
正如从表7的结果所观察到的，No.6和No.7制剂获得的BA分别为22.9％和35.3％。与含有生理盐水(5.0％)的No.34制剂的BA和含有5％(w/v)甘露糖醇水溶液(2.5％)制剂的BA相比，这些制剂的BA出人意料的高与0.5M醋酸钠缓冲液的pH无关，加入醋酸钠缓冲液可显著增加生长素释放肽的BA。使用醋酸钠缓冲液的BA较之5％(w/v)甘露糖醇水溶液获得的BA高9-14倍。
实施例3酸溶液的类型对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.7，No.8，No.9，No.10和No.11的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表8中给出。
表8皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(酸溶液类型的作用)
(表8)
No.7，No.8，No.9，No.10和No.11制剂获得的BA分别为35.3％，20.9％，7.0％，8.9％和16.3％。因此，与5％(w/v)甘露糖醇水溶液相比，具有pH4.0的任一酸性缓冲液的生长素释放肽的BA均显著增加。
实施例4酸溶液对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.12，No.13，No.14和No.15的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。
药动学参数在下面的表9中给出。
表9皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(酸溶液浓度的作用)
(表9)
No.12，No.13，No.14和No.15制剂获得的BA分别为34.0％，28.1％，13.8％和4.8％。因此，与5％(w/v)甘露糖醇水溶液的BA相比，任一酸性溶液(pH4.0)和0.01M-0.5M浓度醋酸钠的生长素释放肽的BA均显著增加。
实施例5液体制剂的pH对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.13，No.16和No.17的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表10中给出。
表10皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(液体制剂的pH的作用)
(表10)
No.13，No.16和No.17制剂获得的BA分别为28.1％，16.6％和9.1％。因此，与5％(w/v)甘露糖醇水溶液的BA相比，使用作为酸性溶液的0.01M醋酸钠配制并具有4.0-6.0的pH的任一液体制剂生长素释放肽的BA均显著增加。
实施例6磷酸缓冲液的浓度和pH对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量给予No.18，No.19，No.20，No.21，No.22和No.23的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。
药动学参数在下面的表11中给出。
表11皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(磷酸缓冲液的浓度和pH的作用)
(表11)
No.18，No.19，No.20，No.21，No.22和No.23制剂获得的BA分别为17.7％，8.0％，5.3％，15.0％，10.6％和5.4％。因此，使用磷酸缓冲液(pH4.0-5.0)配制的任一液体制剂与5％(w/v)甘露糖醇水溶液的BA相比，生长素释放肽的BA显著增加。
实施例7醇的类型和浓度对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.14，No.30，No.81，No.82和No.86的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。
药动学参数在下面的表12中给出。
表12皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(醇的类型和浓度的作用)
(表12)
No.14，No.30，No.81，No.82和No.86制剂获得的BA分别为13.8％，25.2％，25.8％，13.8％和22.5％。No.14制剂含有酸性溶液和糖，但不含任何醇。No.30制剂含有与No.14制剂相同的酸性溶液和糖，且还含有苯甲醇。No.30制剂生长素释放肽的BA高达没有醇的No.14制剂的2倍。还证实了醇的存在导致生长素释放肽的BA增加，而与醇的类型和浓度无关。
实施例8蔗糖浓度对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.24，No.13和No.25的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。结果在图3中表示，药动学参数在下面的表13中给出。
表13皮下给予大鼠的生长素释放肽的药动学参数(蔗糖浓度的作用)
(表13)
No.24，No.13和No.25制剂获得的BA分别为38.2％，28.1％和19.4％。因此，含有作为酸性溶液的醋酸钠缓冲液和0，10或20％(w/v)蔗糖的任一液体制剂的生长素释放肽的BA较之5％(w/v)甘露糖醇水溶液明显更高。蔗糖的存在导致No.13和No.25制剂较之没有蔗糖的No.24制剂的生长素释放肽的BA增加更多。蔗糖的存在还导致T1/2增加。
实施例9糖类型对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.35，No.53，No.84和No.85的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表14中给出。
表14皮下给予大鼠的生长素释放肽的药动学参数(糖类型的作用)
(表14)
No.35，No.53，No.84和No.85制剂获得的BA分别为3.0％，22.4％，21.3％和8.7％。虽然仅含蔗糖的No.35制剂中生长素释放肽的BA增加，但该增加相对较小(3.0％)。证实了与5％(w/v)甘露糖醇水溶液的BA相比，含有相同酸性溶液和相同的醇，但含有不同糖的任一液体制剂中的生长素释放肽的BA均显著增加。蔗糖和葡萄糖的BA的增加高于葡聚糖70。
实施例10环糊精对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.87-No.97的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。
药动学参数在下面的表15中给出。
表15皮下给予大鼠的生长素释放肽的药动学参数(作为糖的环糊精的作用)
(表15)
No.87-No.97任一制剂的BA均显著增加。No.53的含蔗糖制剂和No.84的含葡萄糖制剂的BA分别为22.4％和21.3％。使用环糊精的任一液体制剂中生长素释放肽的BA都较高。
实施例11生长素释放肽剂量对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.26，No.13，No.27和No.28的制剂。这些液体制剂递送的生长素释放肽的剂量分别为10，50，250和2,000μg/kg。按照与实施例2相同的方式采集血液样品并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。结果在图4和5中给出。药动学参数在下面的表16中给出。
表16皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(生长素释放肽剂量的作用)
(表16)
No.26，No.13，No.27和No.28制剂的AUC分别为49.28ng·min/mL，289.90ng·min/mL，1580.28ng·min/mL和15050.59ng·min/mL。这些制剂的生长素释放肽的BA分别为23.9％，28.1％，30.7％和36.5％。该观察结果表明生长素释放肽的吸收没有达到包合并随着生长素释放肽的剂量保持增加，从10μg/kg增加到2,000μg/kg。
实施例12苯甲醇对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量给予No.13，No.14，No.29和No.30的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表17中给出。
表17皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(苯甲醇的作用)
(表17)
No.13，No.14，No.29和No.30制剂获得的BA分别为28.1％，13.8％，39.3％和25.2％。因此，1％(w/v)苯甲醇的存在导致含有0.1M或0.03M醋酸钠缓冲液作为酸性溶液的各液体制剂与它们没有苯甲醇的相应物比，生长素释放肽的BA显著增加。这表明了苯甲醇可使生长素释放肽的BA增加的能力。
实施例13生长素释放肽的浓度对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，皮下给予No.30和No.31的制剂。以1mL/kg的体积给予No.30的制剂，并以50μL/kg的体积给予No.31的制剂(微量注射器(SGE.Co.，Ltd.)用于给予50μL/kg)，以通过两种制剂递送相同剂量50μg/kg的生长素释放肽。按照与比较实施例2相同的方式采集血液样品并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表18中给出。
表18皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(生长素释放肽浓度的作用)
(表18)
No.30制剂生长素释放肽的BA(25.2％)与No.31的制剂(23.2％)一样高。这表明醋酸钠缓冲液和苯甲醇的存在可增加生长素释放肽的吸收，而与生长素释放肽的浓度和剂量无关。
实施例14醋酸缓冲液的制备方法对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 以50μL/kg的剂量皮下给予No.31和No.32的制剂，以由两种制剂递送相同剂量的生长素释放肽(50μg/kg)。按照与比较实施例2相同的方式采集血液样品，并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表19中给出。
表19皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(醋酸缓冲液的制备方法的作用)
(表19)
No.31和No.32制剂获得的BA分别为23.2％和43.2％。No.31制剂中所用的酸性缓冲液是通过向醋酸钠水溶液中加入盐酸至4.0的pH而制备的，No.32制剂中所用的酸性缓冲液是通过向醋酸中加入氢氧化钠水溶液至4.0的pH而制备的。与5％(w/v)甘露糖醇水溶液获得的BA相比，所述两种液体制剂的每一种中，生长素释放肽的BA均显著增加。这表明酸性缓冲液的存在可使生长素释放肽的BA增加，而与酸性溶液的组成无关。
实施例15醋酸缓冲液对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.32，No.51，No.52和No.53的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表20中给出。
表20皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(醋酸缓冲液的浓度和pH的作用)
(表20)
No.32，No.51，No.52和No.53制剂获得的BA分别为23.2％，22.8％，18.0％和22.4％。No.32和No.51-No.53的制剂各自含有苯甲醇，可使生长素释放肽的BA增加的醇和蔗糖，以及用作酸性溶液的醋酸缓冲液。这些液体制剂各自达到较之含有苯甲醇和蔗糖，但不含醋酸缓冲液的No.79(14.2％)制剂更高的BA。这表明含有酸性溶液、醇和糖的液体生长素释放肽制剂可使生长素释放肽达到较高的BA。
实施例16其它酸性溶液对在大鼠中皮下注射生长素释放肽的药动学参数的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.54-No.59的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表21中给出。
表21皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(酸性溶液的作用)
(表21)
No.54-No.59和No.73制剂获得的BA分别为19.9％，17.3％，22.3％，19.8％，26.6％，23.2％和14.3％。No.54-59的制剂各自含有苯甲醇，一种可使生长素释放肽的BA增加的醇和蔗糖，以及酸性溶液。这些液体制剂各自达到较之含有苯甲醇和蔗糖，但不含酸性溶液的No.79(14.2％)制剂更高的BA。这表明含有酸性缓冲液、醇和糖的液体生长素释放肽制剂可使生长素释放肽达到较高的BA。酸性溶液的存在导致生长素释放肽的BA增加，与酸性溶液的组成无关。
实施例17在没有酸性溶液存在的条件下，醇和糖对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予，No.78-No.80的制剂，并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表22中给出。
表22皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(在没有酸性溶液存在的条件下，醇和糖的作用)
(表22)
No.78-No.80的制剂获得的BA分别为8.3％，14.2％和16.9％。仅含蔗糖的No.35制剂中生长素释放肽的BA为3.0，这证实了即使在没有酸性溶液存在的条件下，加入醇也可使生长素释放肽的BA增加。
实施例18在没有酸性溶液存在的条件下，醇对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.60-No.63，No.71和No.72的制剂，并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表23中给出。
表23皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(在没有酸性溶液存在的条件下，醇的作用)
(表23)
No.60-No.63，No.71和No.72制剂的BA大大高于使用生理盐水的No.34(5.0％)的制剂，和使用10％(w/v)蔗糖水溶液的No.35(3.0％)的制剂。这些结果表明即使在没有酸性溶液存在的条件下，醇单独存在也可使生长素释放肽的BA增加。
实施例19在没有酸性溶液存在的条件下，非-醇极性有机液体对在大鼠中皮下注射的生长素释放肽的药动学的作用 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.64-No.68，No.70，和No.74-No.76的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表24中给出。
表24皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(在没有酸性溶液存在的条件下，非-醇极性有机液体的作用)
(表24)
No.64-No.68，No.70，No.74和No.76制剂的BA大大高于使用生理盐水的No.34(5.0％)制剂，和使用10％(w/v)蔗糖水溶液的No.35(3.0％)的制剂。这些结果表明即使在没有酸性溶液存在的条件下，单独的极性有机液体的存在也可增加生长素释放肽的BA。N-甲基-2-吡咯烷酮所致BA的增加最显著。
实施例20N-甲基-2-吡咯烷酮对皮下注射到大鼠中的生长素释放肽的药动学的作用 与在比较实施例2中一样，以1mL/kg的剂量皮下给予No.83和No.65的制剂并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表25中给出。
表25皮下给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(N-甲基-2-吡咯烷酮的作用)
(表25)
No.83和No.65的制剂分别达到65.7％和57.4％的非常高的BA。含有酸性溶液的No.83制剂中生长素释放肽的BA要高于不含酸性溶液的No.65的制剂。这表明尽管N-甲基-2-吡咯烷酮本身即具有使BA增加的能力，但仍可通过加入酸性溶液使该能力进一步提高。
实施例21在大鼠中肌内注射的生长素释放肽的药动学 按照皮下给药的实施例，使用注射器和26G针，以1mL/kg的剂量给每只均具有插入到股动脉中的聚乙烯试管的三只大鼠肌内给予No.3和No.13的制剂。按照与比较实施例2相同的方式采集血液样品，并通过RIA方法测量血浆生长素释放肽水平。结果在图6中给出。药动学参数在下面的表26中给出。
表26肌内给予大鼠的生长素释放肽制剂的药动学参数(醋酸钠缓冲液的作用)
(表26)
相对于静脉内给予它们的例子，肌内给药的No.3和No.13制剂获得的BA分别为10.9％和28.5％。因此，在有醋酸钠缓冲液存在条件下的生长素释放肽的BA较之5％(w/v)甘露糖醇水溶液获得的生长素释放肽的BA高2.6倍。这表明醋酸钠缓冲液可像皮下给药一样有效增加肌内给药的生长素释放肽的吸收。
实施例22短尾猴(cynomolgus monkey)中生长素释放肽的药动学 皮下给予No.5和No.33的制剂以区分短尾猴组并测量血浆生长素释放肽水平。此外，将No.1的制剂静脉内给予另外一组短尾猴。测量血浆生长素释放肽水平。
各组由3只4-6岁大的雄性猴子(从中国进口)组成。使用注射器和26G针(各自购自Terumo Co.，Ltd.)，以0.2mL/肌体的剂量在背部皮肤中皮下注射No.5和No.33的制剂。
使用注射器和26G针(各自购自Terumo Co.，Ltd.)，以2mL/kg剂量将No.1的制剂静脉内注射到前臂脑静脉(vascular cephalica)中。
在各情况中，在给药之前和给药之后5，10，15，30，40，60，90，和120分钟之后采集前臂脑静脉的血液样品。采集样品之后，立即向各样品中加入1/100 EDTA 2Na 2H2O溶液和1/50 AEBSF溶液。然后将样品离心从而分离血浆，向其中立即加入1/10 1N盐酸。混合样品并在-80℃贮存直到进行分析。
然后使用Active生长素释放肽ELISA Kit(Cat.No.MM-401，Mitsubishi Kagaku latron Inc.)通过酶-联免疫溶剂测定(ELISA)分析血浆样品的生长素释放肽水平。与RIA类似，该测定可特异性检测活性生长素释放肽。
图7表示血浆生长素释放肽浓度随时间的变化。图7所示结果用于测定各液体制剂的Cmax和Tmax。使用梯形方法，计算各制剂的AUC。然后，AUCs用于测定生长素释放肽的BA。结果在表27中表示。这些值是作为相对于各组中三只短尾猴获得的数据平均值而得到的。
表27静脉内或皮下给予短尾猴生长素释放肽制剂的药动学参数
(表27)
相对于静脉内给予它们的例子，No.5和No.33的皮下制剂获得的BA分别为4.9％和12.8％。因此，使用醋酸钠缓冲液和1％(w/w)苯甲醇配制的液体制剂中生长素释放肽的BA较之使用5％(w/v)甘露糖醇水溶液配制的液体制剂高2.6倍。这表明像在大鼠中一样，苯甲醇可有效增加短尾猴中的生长素释放肽的吸收。
实施例23制剂增加大鼠中血浆生长激素水平的能力 No.4和No 31的制剂用于检测生长素释放肽制剂增加大鼠中生长激素(GH)血浆浓度的能力。
使用7-周龄、雄性SD大鼠(Charles River Laboratories JapanInc.)。将各制剂给予一组三只具有插入到股动脉中的聚乙烯试管(PE-50，Clay Adams Co.，Ltd.)的大鼠。
使用注射器和26G针(购自Terumo Co.，Ltd.)，以50μL/kg的剂量在背部皮肤中皮下给予各制剂。在给药之前和给药之后5，10，20，30和60分钟之后，采集股动脉中聚乙烯试管的血液样品。
收集样品之后，向各样品中立即加入1/100的EDTA 2Na 2H2O溶液。然后将样品离心以分离血浆，然后在-80℃贮存直到进行分析。
使用大鼠生长激素(rGH)[125I]测定系统(Amersham BioscienceCo.，Ltd.Cat.No.RPA551)通过放射免疫测定(RIA)分析血浆样品的GH浓度。图8表示血浆GH浓度随时间的变化。这些值是作为相对于每组三只大鼠获得的数据的平均值而得到的。
从图8所示结果可以看出，血浆GH浓度从初始值(113ng/mL)显著增加并在皮下给予No.4的制剂后5分钟得到其峰值(208ng/mL)。比较而言，皮下给予No.31的制剂后20分钟，血浆GH浓度达到峰值(316ng/mL)。峰值是初始值(96ng/mL)的3.3倍。这些结果表明使用醋酸钠和苯甲醇的制剂的血浆GH浓度增加更显著。
实施例24在大鼠中皮下注射其它类型生长素释放肽的药动学 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.37，No.39，No41，和No.98-No.102的制剂，并通过RIA测量血浆生长素释放肽水平。药动学参数在下面的表28中给出。按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量静脉内给予No.36，No.38和No.40的制剂，并通过RIA测量血浆生长素释放肽水平。
按照与人生长素释放肽相同的方式测量大鼠生长素释放肽的血浆水平。人生长素释放肽和脱-辛酰基人生长素释放肽的血浆水平是使用抗-生长素释放肽抗体通过放射免疫测定(RIA)测量的。具体而言，将抗-生长素释放肽抗体，然后是[125I-Tyr]生长素释放肽(13-28)加入到各样品中用于竞争。随后，加入第二种抗体，使抗体-生长素释放肽复合物沉淀。分离上清液并通过γ-计数器(Packard Instruments Co.，Ltd.)分析放射性。用于测定的抗-生长素释放肽抗体可识别脱-辛酰基生长素释放肽以及生长素释放肽。
人生长素释放肽(Adod生长素释放肽)的血浆水平是使用抗-Adod生长素释放肽抗体通过放射免疫测定(RIA)测量的。具体而言，将抗-Adod生长素释放肽抗体，然后是125I-标记的抗体加入到各血浆样品中用于竞争。随后，加入第二种抗体，使抗体-Adod生长素释放肽复合物沉淀。分离上清液并通过γ-计数器(Packard Instruments Co.，Ltd.)分析放射性。
表28在大鼠中皮下注射的不同类型生长素释放肽的药动学
(表28)
结果证实含有极性有机液体、酸性溶液、糖和醇的液体生长素释放肽制剂不仅可显著增加皮下注射的人生长素释放肽的BA，而且可显著增加皮下注射的其它生长素释放肽，包括大鼠生长素释放肽，脱-辛酰基生长素释放肽(Ser3上没有辛酰基修饰的人生长素释放肽)和人[L-2-氨基十二烷酸3]生长素释放肽的BA。
实施例25在大鼠中皮下注射的其它生理学活性肽和蛋白的药动学 按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量皮下给予No.43，45，47，49，50，和103-107的制剂并通过RIA测量该肽和蛋白的血浆水平。药动学参数在下面的表29中给出。按照比较实施例2，以1mL/kg的剂量静脉内给予No.42，44，46和48的制剂，并通过RIA测量该肽和蛋白的血浆水平。血浆浓度用于测定各肽或蛋白的BA。
人甲状旁腺激素(1-34)(hPTH)的血浆水平是使用抗-PTH抗体通过放射免疫测定(RIA)测量的。具体而言，将抗-PTH抗体，然后是[125I-Tyr34]PTH(1-34)加入到各血浆样品中用于竞争。随后，加入第二种抗体，使抗体-PTH(1-34)复合物沉淀。分离上清液并通过γ-计数器(PackardInstruments Co.，Ltd.)分析放射性。
人高血糖素-样肽-1(GLP-1)的血浆水平是使用Glucagon-likePeptide-1(Active)ELISA Kit(LINCO Research Inc.)通过酶-联免疫溶剂测定(ELISA)测量的。
人髓质素的血浆水平是使用AM成熟的RIA Shionogi(ShionogiCo.，Ltd)通过放射免疫测定(RIA)测量的。
人胰岛素的血浆水平是使用Insulin-RIA-bead II(Yamasa Co.，Ltd.)通过放射免疫测定(RIA)测量的。
人心房钠尿肽(hANP)的血浆水平是使用Shiono RIAANP(Shionogi Co.，Ltd.)通过放射免疫测定(RIA)测量的。
表29皮下给予大鼠的其它生理学活性肽和蛋白的药动学参数
(表29)
结果证实含有糖、醇和酸性溶液的液体肽制剂不仅可显著增加皮下注射的人生长素释放肽的BA，而且可显著增加皮下注射的其它肽，包括大鼠生长素释放肽，脱-辛酰基生长素释放肽(Ser3上没有辛酰基修饰的人)，[L-2-氨基十二烷酸3]人生长素释放肽，人高血糖素-样肽-1(GLP-1)，人心房钠尿肽(hANP)，人髓质素，人甲状旁腺激素(hPTH(1-34))和人胰岛素的BA。
生产实施例1含有人生长素释放肽的pH-调节的药物组合物的制备 将人生长素释放肽，其是生长素释放肽中的一种，溶于纯化水中，形成含有约0.15μmol/mL(＝0.5mg/mL)人生长素释放肽的水溶液。监测该溶液的pH，加入少量0.1M盐酸水溶液至4.0的终pH。从而得到含有人生长素释放肽的水溶液形式的药物组合物。
生产实施例2含有溶于醋酸缓冲液中的大鼠生长素释放肽的药物组合物的制备 大鼠生长素释放肽，其是生长素释放肽中的一种，溶于0.05M醋酸缓冲液(pH4.0)中，形成含有约0.15μmol/mL(＝0.5mg/mL)大鼠生长素释放肽的水溶液形式的药物组合物。确定该水溶液具有4.0的pH。
生产实施例3含有人生长素释放肽的药物组合物的制备 将人生长素释放肽，其是生长素释放肽中的一种，和苯甲醇加入到0.05M醋酸缓冲液(pH4.0)中，形成含有约0.15μmol/mL(＝0.5mg/mL)人生长素释放肽和约1％(w/v)苯甲醇的水溶液形式的药物组合物。测定该水溶液具有4.0的pH。
生产实施例4含有人生长素释放肽的药物组合物的制备 将人生长素释放肽，其是生长素释放肽中的一种，以及苯甲醇和蔗糖加入到纯化水中，形成含有约0.15μmol/mL(＝0.5mg/mL)人生长素释放肽，约1％(w/v)苯甲醇和10％(w/v)蔗糖的水溶液形式的药物组合物。测定该水溶液具有4.7的pH。
生产实施例5含有人生长素释放肽的药物组合物的制备 将人生长素释放肽，其是生长素释放肽中的一种，苯甲醇和蔗糖加入到0.1M醋酸缓冲液(pH4.0)中，形成含有约0.15μmol/mL(＝0.5mg/mL)人生长素释放肽，约1％(w/v)苯甲醇和10％(w/v)蔗糖的水溶液形式的药物组合物。测定该水溶液具有4.0的pH。
工业实用性
正如所述，本发明提供一种有效的液体制剂，其可使作为药物给药的生理学活性肽或蛋白，包括生长素释放肽的生物利用率(BA)达到较高水平。本发明还提供一种提高以水溶液形式皮下注射的生理学活性肽或蛋白，包括生长素释放肽的生物利用率的方法。
通常，皮下给药的生理学活性肽和蛋白被蛋白酶消化，因此它们的BA低于通过静脉内注射所达到的。本发明的液体制剂含有包含生长素释放肽类的含有生理学活性肽或蛋白，可皮下注射从而维持所述肽或蛋白的有效血液水平。固此，本发明在医药学方面是极为重要的。
附图简述
图1是表示静脉内或皮下给予大鼠的人生长素释放肽的血浆水平随时间而变化的曲线图，其中该人生长素释放肽溶于5％(w/v)甘露糖醇水溶液(比较实施例2)中。
图2是表示皮下给予大鼠的人生长素释放肽的血浆水平随时间而变化的曲线图，其中所述人生长素释放肽溶于醋酸钠缓冲液(实施例2)中。
图3是表示皮下给予大鼠的人生长素释放肽的血浆水平随时间而变化的曲线图，其中所述人生长素释放肽溶于含有0-20％(w/v)蔗糖的0.1M醋酸钠缓冲液(pH4.0)中(实施例7)。
图4是表示以10，50，250或2,000μg/kg的剂量皮下给予大鼠的生长素释放肽的血浆水平随时间而变化的曲线图(实施例8)。所述制剂含有0.1M醋酸钠缓冲液(pH4.0)和10％(w/v)蔗糖。
图5是表示以10，50，250或2,000μg/kg的剂量给予大鼠的生长素释放肽剂量与AUC之间关系的曲线图(实施例8)。
图6是表示肌内给予大鼠的人生长素释放肽的血浆水平随时间而变化的曲线图，其中所述人生长素释放肽溶于5％(w/v)甘露糖醇水溶液或醋酸钠缓冲液(实施例12)中。
图7是表示静脉内或皮下给予短尾猴的人生长素释放肽的血浆水平随时间而变化的曲线图，其中所述的人生长素释放肽溶于5％(w/v)甘露糖醇水溶液或醋酸钠缓冲液(实施例13)中。
图8是表示皮下给予溶于5％(w/v)甘露糖醇水溶液或醋酸钠缓冲液(实施例14)中的人生长素释放肽后，大鼠中生长激素的血浆水平随时间而变化的曲线图。
序列表
<110>DAIICHI SUNTORY PHARMA CO.，LTD.
<120>生理学活性肽的液体制剂
<130>DSP-78
<150>JP 2002-146155
<151>2002-05-21
<160>21
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>28
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>生长激素促分泌剂的人内源性肽的氨基酸序列
<400>1
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
<210>2
<211>27
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>生长激素促分泌剂的人内源性肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>2
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu
1 5 10 15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>褐鼠
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>生长激素促分泌剂的大鼠内源性肽的氨基酸序列
<400>3
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
<210>4
<211>27
<212>PRT
<213>褐鼠
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>生长激素促分泌剂的大鼠内源性肽的氨基酸序列
<400>4
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu
1 5 10 15
Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
<210>5
<211>28
<212>PRT
<213>小家鼠
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>生长激素促分泌剂的小鼠内源性肽的氨基酸序列
<400>5
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
<210>6
<211>28
<212>PRT
<213>野猪
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>生长激素促分泌剂的猪内源性肽的氨基酸序列
<400>6
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg
20 25
<210>7
<211>27
<212>PRT
<213>牛
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>生长激素促分泌剂的牛内源性肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>7
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg
20 25
<210>8
<211>27
<212>PRT
<213>绵羊
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>生长激素促分泌剂的绵羊内源性肽(27个氨基酸)的氨基酸序列
<400>8
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu
1 5 10 15
Pro Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg
20 25
<210>9
<211>28
<212>PRT
<213>家犬
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>生长激素促分泌剂的狗内源性肽的氨基酸序列
<400>9
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg
20 25
<210>10
<211>21
<212>PRT
<213>鳗鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(21)
<223>生长激素促分泌剂的鳗鱼内源性肽的氨基酸序列。该肽的C-末端酰胺化。
<400>10
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys
1 5 10 15
Lys Pro Pro Arg Val
20
<210>11
<211>23
<212>PRT
<213>虹鳟鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(23)
<223>生长激素促分泌剂的虹鳟鱼内源性肽(23个氨基酸)的氨基酸序列。该肽的C-末端酰胺化。
<400>11
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln Gly
1 5 10 15
Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val
20
<210>12
<211>20
<212>PRT
<213>虹鳟鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(20)
<223>生长激素促分泌剂的虹鳟鱼内源性肽(20个氨基酸)的氨基酸序列。该肽的C-末端酰胺化。
<400>12
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly Lys
1 5 10 15
Pro Pro Arg Val
20
<210>13
<211>24
<212>PRT
<213>家鸡(Gallus domesticus)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(24)
<223>生长激素促分泌剂的小鸡内源性肽的氨基酸序列。该肽的C-末端酰胺化。
<400>13
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
1 5 10 15
Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg
20
<210>14
<211>24
<212>PRT
<213>家鸡
<220>
<221>肽
<222>(1)..(24)
<223>生长激素促分泌剂的小鸡内源性肽的氨基酸序列。
<400>14
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys
1 5 10 15
Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg
20
<210>15
<211>26
<212>PRT
<213>家鸡
<220>
<221>肽
<222>(1)..(26)
<223>生长激素促分泌剂的小鸡内源性肽的氨基酸序列。
<400>15
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Ash Ile Gln Gln Gln Lys
1 5 10 15
Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg Leu His
20 25
<210>16
<211>27
<212>PRT
<213>牛蛙(Rana catesbeiana)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(27)
<223>生长激素促分泌剂的蛙内源性肽的氨基酸序列。
<400>16
Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg
1 5 10 15
Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met
20 25
<210>17
<211>28
<212>PRT
<213>牛蛙
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>生长激素促分泌剂的蛙内源性肽的氨基酸序列
<400>17
Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg
1 5 10 15
Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Asn
20 25
<210>18
<211>20
<212>PRT
<213>尼罗罗非鱼(Tilapia nilotica)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(20)
<223>生长激素促分泌剂的罗非鱼内源性肽的氨基酸序列。酰胺化
<400>18
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Ash Lys Val Lys
1 5 10 15
Ser Ser Arg Ile
20
<210>19
<211>22
<212>PRT
<213>鲇鱼
<220>
<221>肽
<222>(1)..(22)
<223>生长激素促分泌剂的鲶鱼内源性肽的氨基酸序列.该肽的C-末端酰胺化
<400>19
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Ash Arg Gly Asp
1 5 10 15
Arg Lys Pro Pro Arg Val
20
<210>20
<211>23
<212>PRT
<213>鲇鱼(Silurus asotus)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(23)
<223>生长激素促分泌剂的鲶鱼内源性肽的氨基酸序列
<400>20
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gin Asn Arg Gly Asp
1 5 10 15
Arg Lys Pro Pro Arg Val Gly
20
<210>21
<211>28
<212>PRT
<213>马(Equus caballus)
<220>
<221>肽
<222>(1)..(28)
<223>生长激素促分泌剂的马内源性肽的氨基酸序列
<400>21
Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys
1 5 10 15
Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg
20 2权利要求
1.一种液体制剂，其包含作为活性成分的生理学活性肽或生理学活性蛋白以及酸性溶液。
2.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液包含选自醋酸，乳酸，磷酸，甘氨酸，柠檬酸，盐酸，丙酸，丁酸，苯甲酸及其盐中的一种或两种或多种的组合。
3.根据权利要求1所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液包含选自醋酸，乳酸，丙酸，丁酸和/或磷酸及其盐中的一种或两种或多种的组合。
4.根据权利要求1或2所述的液体制剂，具有3.0-7.0的pH范围。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液的浓度为1-1000mM。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液的浓度为10-500mM。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的液体制剂，其中所述的酸性溶液是具有3.0-7.0的pH的酸缓冲液。
8.一种液体制剂，其包含作为活性成分的生理学活性肽或生理学活性蛋白以及极性有机液体。
9.根据权利要求1-7任意一项所述的液体制剂，含有作为活性成分的生理学活性肽或生理学活性蛋白以及极性有机液体。
10.根据权利要求8或9所述的液体制剂，其中所述的极性有机液体是选自醇和/或N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二甲亚砜和羟苯甲酸甲酯中的一种或两种或多种的组合。
11.根据权利要求8或9所述的液体制剂，其中所述的极性有机液体是选自苯甲醇，乙醇，苯酚，叔-丁醇，氯丁醇，N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或两种或多种的组合。
12.根据权利要求8-11任意一项所述的液体制剂，其中所述的极性有机液体的浓度为0.001-80％(w/v)。
13.根据权利要求8-11任意一项所述的液体制剂，其中所述的极性有机液体的浓度为0.1-10％(w/v)。
14.根据权利要求1-7任意一项所述的液体制剂，还含有糖。
15.根据权利要求8-12任意一项所述的液体制剂，还含有糖。
16.根据权利要求1-7任意一项所述的液体制剂，还含有极性有机液体和糖。
17.根据权利要求14-16任意一项所述的液体制剂，其中所述的糖是选自甘露糖醇，蔗糖，葡萄糖和环糊精中的一种或两种或多种的组合。
18.根据权利要求14-17任意一项所述的液体制剂，其中所述的糖为环糊精。
19.根据权利要求14-17任意一项所述的液体制剂，其中所述的糖的浓度为0.1-20％(w/v)。
20.根据权利要求1-19任意一项所述的液体制剂，其中所述的生理学活性肽或生理学活性蛋白是选自生长素释放肽类，人高血糖素-样肽-1(hGLP-1)，人心房钠尿肽(hANP)，人髓质素，人甲状旁腺激素(hPTH(1-34))和人胰岛素中的一种。
21.根据权利要求1-19任意一项所述的液体制剂，其中所述的生理学活性肽或生理学活性蛋白是生长素释放肽类。
22.根据权利要求1-19任意一项所述的液体制剂，其中所述的生长素释放肽类是生长素释放肽。
23.根据权利要求1-19任意一项所述的液体制剂，其中所述的生长素释放肽是人生长素释放肽。
24.根据权利要求1-19任意一项所述的液体制剂，其中所述的生长素释放肽类的浓度为0.03nmol/mL-15μmol/mL。
25.根据权利要求1-24任意一项所述的液体制剂，用作注射剂。
26.根据权利要求25所述的液体制剂，用作皮下注射剂或肌内注射剂。
27.一种液体制剂，包含作为活性成分的生长素释放肽类；选自醋酸，乳酸，丙酸，丁酸和/或磷酸中的一种或两种或多种的组合的酸溶液和选自苯甲醇，乙醇，苯酚，叔-丁醇，N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基甲酰胺和二甲亚砜中的一种或两种或多种的组合的极性有机液体，其中所述的液体制剂具有3.0-7.0的pH。
28.一种用于提高生长素释放肽类的生物利用率的方法，包括向生长素释放肽的水溶液中加入酸性溶液和极性有机液体。
全文摘要
本发明提供可确保药剂生物利用率的、有效的液体制剂，其中所述的药剂以包含生长素释放肽的生理活性肽或生理活性蛋白质为有效成分。还提供一种用于提高以水溶液形式皮下注射的生理学活性肽或蛋白，包括生长素释放肽的BA的方法。所述的液体制剂含有作为活性成分的生理学活性肽或蛋白，如生长素释放肽；选自醋酸，乳酸，磷酸，甘氨酸，柠檬酸，盐酸，丙酸，丁酸，苯甲酸及其盐中的一种或两种或多种的组合的酸溶液；醇和选自N－甲基－2－吡咯烷酮，二甲基甲酰胺，二甲亚砜和羟苯甲酸甲酯中的一种或两种或多种的组合的极性有机液体。
文档编号A61K47/14GK101022822SQ20058002859
公开日2007年8月22日 申请日期2005年8月24日 优先权日2004年8月24日
发明者松本大, 松本政子, 花田雄志, N·若林 申请人:第一阿斯比奥制药株式会社, 寒川贤治