技术领域本发明涉及有机无机杂化微球颗粒及其制备和应用，具体地说是一种末端带有羟基，磺酸，酰胺等功能基团的有机无机杂化核壳结构微球颗粒。
背景技术：
强极性化合物(如寡糖，糖苷，糖肽等)在药物和生物体内起到重要的作用，因此，其分离分析逐渐成为大家关注的焦点。但是，目前使用最广泛的高效分离技术反相高效液相色谱(RP-HPLC)对于强极性化合物的保留很弱。亲水作用液相色谱(HILIC)作为一种用于分离强极性化合物的色谱技术(Strege，M.A.etal，Anal.Chem.2000，72，4629-4633；Wang，X.D.etal，J.Chromatogr.A，2005，1083，58-62)在近年来得到广泛的发展，尤其是酰胺类，羟基类，糖类等(Guo，Y.etal，J.Chromatogr.A，2005，1074，71-80；Irgum，K.etal，J.Sep.Sci.，2006，29，1784-1821)固定相在分离与富集极性分子和糖肽方面具有显著的优势。然而，这些固定化方法通常修饰一种功能化基团，而且要求反应条件较为严格(如无水溶剂，较高的反应温度等)制备步骤多，反应效率低，功能基团之间要求为交叉的反应。因此，需要寻找一种反应条件温和，选择性高反应条件与水环境兼容的新方法。点击化学具有反应产率高、官能基团稳定以及反应活性高的特点。Guo,Z.etal,Chem.Commun.,2007,2491–2493报道了一种在硅球表面修饰麦芽糖的亲水固定相，该方法通过“点击化学”方法将含有叠氮基团的麦芽糖固定到硅球表面，有效提高了麦芽糖的固定化率，显著提高了其对极性物质的分离能力，但是该技术属于金属催化的叠氮化物与炔基的反应，且该材料的仅仅修饰糖类的羟基。
技术实现要素：
针对以上不足，本发明提供一种硫醇-烯点击化学制备表面同时带有羟基，酰胺和磺酸基团的功能化亲水微球颗粒，该方法具有反应条件温和，选择性高反应条件与水环境兼容的特点，得到的产物颗粒形状规整，单分散性好，可用于在亲水作用液相色谱模式下对核苷和糖肽的分离富集。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：步骤一：将硅胶颗粒、含有硫醇基团的硅烷化试剂、反应溶剂甲苯等加入反应容器中，超声1分钟，使得加入的试剂以及硅胶颗粒均匀的分散在溶剂中，在烧瓶上接冷凝管，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中，加热回流6～30h，之后停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用3000～10000rad/min的速度离心，去除上清液，依次使用甲苯、甲醇、丙酮抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。步骤二：在烧瓶中，装上冷凝管，加入反应溶剂，将步骤一中得到的硅烷化修饰后的硅胶颗粒、3-烯丙氧基-2-羟基-1-丙磺酸、甲叉双丙烯酰胺、引发剂等加入烧杯中，超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解均匀的分散在溶液中，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至60～140℃。维持60～80℃条件下反应4-48小时，停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用3000～10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶剂洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。在步骤一中，所说的硅烷化试剂为含有巯基的硅烷化试剂。含有硅胶颗粒，硅烷化试剂的溶液中，硅胶颗粒占总质量的0.01～0.2wt％单体的总摩尔数浓度为0.05～1mol/L，余量为反应溶剂。修饰后的微球颗粒，其粒径为100nm～10μm。在步骤二中，所说的引发剂选偶氮类引发剂。反应溶液为水、乙腈、甲醇、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺或者其混合物。含有3-烯丙氧基-2-羟基-1-丙磺酸、甲叉双丙烯酰胺和引发剂的溶液中，单体的总摩尔数浓度为0.05～0.4mol/L，引发剂占单体总质量的0.5～10％，余量为反应溶剂。制备出来的有机无机杂化微球颗粒，其粒径为100nm～10μm。本发明在材料表面通过硫醇-烯方法引入羟基、磺酸基、酰胺基等亲水性功能基团，不仅克服了传统后修饰方法步骤繁琐、反应效率低的缺点，而且使得形成的核壳结构的微球表面具有三维结构的聚合物链，该结构可以提高材料的亲水色谱能力。本发明的微球颗粒可以作为一种新型亲水作用色谱固定相，并且用于从简单样品混合物或者复杂样品中分离或富集核苷、糖肽。本发明具有如下优点：1.本发明所述制备方法，采用巯基-烯点击化学的方法，使得制备反应条件温和，反应速度快，反应效率高，所得材料重现性高。2.有机无机杂化核壳结构微球颗粒外层形成采用巯基-烯点击化学方法，使得本发明核壳结构微球颗粒的粒径分布较窄，粒径单分散，且表面同时含有大量的羟基、酰胺、磺酸等亲水性功能基团。3.通过本发明制备的硼酸功能化核壳结构微球由于同时含有大量的各种亲水性基团，因此，可作为一种新型亲水作用色谱固定相，并且用于从简单样品混合物或者复杂样品中分离或富集核苷、糖肽，开辟通过巯基-烯点击化学方法制备微球颗粒在分离分析领域的新应用。附图说明图1为实施例1中制备的聚合物微球的扫描电镜照片图2为使用实施例1中制备的聚合物微球作为固定相用于核苷的分离色谱图。具体实施方式下面采用具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。实施例11.单分散核壳结构聚合物纳米粒子的制备在150mL的圆底烧瓶中，加入80mL甲苯，加入6g粒径为5μm的硅胶颗粒,3g的3-巯丙基三乙氧基硅烷，超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒均匀的分散在溶液中，在烧瓶上接冷凝管，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中，加热回流6h，之后停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，依次使用甲苯、丙酮、甲醇、丙酮抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3遍洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，得到修饰的硅烷化试剂的硅胶颗粒。在100mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入反应溶剂水-乙醇混合溶液(体积比为2:1)50mL，加入1000mg修饰硅烷化的硅胶颗粒、200mg3-烯丙氧基-2-羟基-1-丙磺酸(PSAS)、600mg甲叉双丙烯酰胺酸、100mg偶氮二异丁腈(AIBN)超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解形成均匀分散在溶剂中，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至75℃。维持75℃条件下反应12小时，停止反应，冷却至室温，得到微球颗粒silica(MBAAm-co-PSAS)之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶液洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。2.聚合物微球粒子的表征经过扫描电镜测试，结果如图1所示。3.聚合物微球可用于核苷的分离使用聚合物微球颗粒用于装填2.1×50mm色谱柱，用于核苷的分离分析。如图2所示，(1)胸苷，(2)尿苷，(3)腺苷，(4)胞嘧啶核苷，(5)鸟苷。5种不同的核苷得到了很好的分离。色谱条件为：色谱柱：2.1×50mm；流动相：A，20mMNH4HCO3水溶液，pH4；B，乙腈；等度条件：0-5min，15％A；流速：0.25mL/min；柱温：25℃；检测波长：254nm。。实施例21.单分散核壳结构聚合物纳米粒子的制备在150mL的圆底烧瓶中，加入60mL甲苯，加入3g粒径为5μm的硅胶颗粒,3g的3-巯丙基三乙氧基硅烷，超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒均匀的分散在溶液中，在烧瓶上接冷凝管，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中，加热回流6h，之后停止反应，冷却至室温。之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，依次使用甲苯、丙酮、甲醇、丙酮抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3遍洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，得到修饰的硅烷化试剂的硅胶颗粒。在100mL的圆底烧瓶中，装上冷凝管，加入反应溶剂水-乙醇混合溶液(体积比为2:1)80mL，加入1200mg修饰硅烷化的硅胶颗粒、600mg3-烯丙氧基-2-羟基-1-丙磺酸(PSAS)、300mg甲叉双丙烯酰胺酸、100mg偶氮二异丁腈(AIBN)超声1分钟，使得加入的试剂以及颗粒溶解形成均匀分散在溶剂中，之后通氮气15分钟，加入磁力搅拌子，磁力搅拌子保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中均匀缓慢加热，在30min内升温至75℃。维持75℃条件下反应12小时，停止反应，冷却至室温，得到微球颗粒silica(MBAAm-co-PSAS)之后使用高速离心机用10000rad/min的速度离心，去除上清液，加入反应溶液洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时。其他同实施例1。