本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种酪氨酸-O-磺酸盐的制备方法。
背景技术：
在生物体内，酪氨酸被磺酸化是一个较为普遍的现象。因此，酪氨酸-O-磺酸(分子式1)在多肽及蛋白质合成上有着较广泛的应用，强酸性基团磺酸的引入极大地改善了酪氨酸的亲水性，在多肽合成中引入酪氨酸-O-磺酸能在一定程度上改善多肽的水溶性，有利于后续的合成以及纯化工作。
Dodgson,K.S.等人在二十世纪五十年代就开始研究酪氨酸的磺酸化(Sulfatases.XXIII.The enzymicdesulfation of tyrosine Osulfate Biochemical Journal,71,10-15；1959)，他们采用硫酸为磺化试剂，将酪氨酸磺化得到酪氨酸-O-磺酸(分子式1)，反应收率为14％。具体反应如下所示：
由于反应收率过低，后处理难度非常大，很难得到高纯度的产品，这个方法很难应用到生产中。
Toth,Gabor K.等人提出了另一种合成方案(Comparison and optimization of synthetic methods for preparing cholecystokinin peptidesInternational Journal of Peptide&Protein Research,26(6),630-8；1985)，他们使用氯磺酸为磺化试剂，以吡啶为缚酸剂，在氯仿中将酪氨酸磺化得到酪氨酸-O-磺酸，再将所得到的粗产物用氢氧化钠制成酪氨酸 -O-磺酸钠，经过后处理得到纯品。具体反应如下所示：
该方法由于使用了氯仿为溶剂，安全方面有较大的问题。Penke,Botond and Nyerges,Levente对这个方法进行了更深入的研究(Solid-phase synthesis of porcine cholecystokinin-33in a new resin via FMOC strategyPeptide Research,4(5),289-95；1991)，他们将反应溶剂由氯仿改成三氟醋酸，极大地提高了反应的安全性，反应收率80％。
Ueki,M.等人(Synthesis and anti-HIV activity of nonatyrosine N-and O1-9-decasulfateBioorganic&Medicinal Chemistry,9(2),477-486；2001)用吡啶三氧化硫络合物为磺化试剂，在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中磺化得到酪氨酸-O-磺酸，然后用碱调节pH，得到酪氨酸-O-磺酸二钠盐，反应收率81％，但是由于得到其二钠盐所需用碱的量比较大，操作中反应液的pH值也太大，酪氨酸-O-磺酸部分水解导致产品中酪氨酸含量较大，纯化难度极大。
Futaki,Shiroh等人于1990年发表文章提出了另一种合成思路(Use of dimethylformamide-sulfur trioxide complex as a sulfating agent of tyrosineJournalofthe Chemical Society,PerkinTransactions 1:Organic and Bio-Organic Chemistry(1972-1999),(6),739-44；1990)，他们利用三氧化硫DMF络合物为磺化试剂，在吡啶与DMF混合溶剂中进行磺化，获得酪氨酸-O-磺酸。具体反应如下所示：
在上述方法的基础上，Takeshi Yagami等人在1993年提出一个方案(Evalution of the Final Deprotection System for the Solid-Phase Synthesis of Tyr(SO3H)-Containing Peptide with9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-Strategy and Its Application to the Synthesis of Cholecystokinin(CCK)-12,Chem.Pharm,Bull.41(2)376-380(1993)),以DMF、吡啶及二氧六环混合液为溶剂，三氧化硫DMF络合物为磺化试剂对Fmoc保护的酪氨酸进行磺化(室温条件下搅拌过夜)，反应液浓缩后得到的粗品用碳酸钠进行碱化，经过冻干、柱层析等步骤得到纯品,文献报道收率为87％。
然而，现有技术中，反应产物的纯化方法较为复杂，这极大地限制了产物的规模化生产。
技术实现要素：
本发明克服现有技术中的缺点，提供一种制备酪氨酸-O-磺酸盐的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)在稀释剂和碱的存在下，将磺化试剂和Fmoc保护的酪氨酸反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)的反应液倒入不良溶剂中，然后静置；
(3)倾去步骤(2)所得物的上清液，残余物用水溶解，然后用碱调节pH至弱酸性；
(4)用良溶剂洗涤步骤(3)所得水溶液，然后浓缩；
(5)向步骤(4)的浓缩物中加入良溶剂并搅拌，过滤，滤液加入至不良溶剂中，搅拌，收集固体，干燥，得到固体；
其中，Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连。
本发明的制备方法，避免了使用蒸馏、冻干等耗时长、设备要求高的问题，后处理中通过增加萃取操作，极大地提高了纯度，避免了使用难以放大的柱层析纯化操作，其是一个适合放大生产、操作简单、产品纯度高的方法。
附图说明
图1实施例2所得产物的HPLC图
具体实施方式
本发明的制备酪氨酸-O-磺酸盐的方法包括如下步骤：
(1)在稀释剂和碱的存在下，将磺化试剂和Fmoc保护的酪氨酸反 应，得到反应液；
(2)将步骤(1)的反应液倒入不良溶剂中，然后静置；
(3)倾去步骤(2)所得物的上清液，残余物用水溶解，然后用碱调节pH至弱酸性；
(4)用良溶剂洗涤步骤(3)所得水溶液，然后浓缩；
(5)向步骤(4)的浓缩物中加入良溶剂并搅拌，过滤，滤液加入至不良溶剂中，搅拌，收集固体，干燥，得到固体；
其中，Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连。
在本说明书中，如无相反说明，则所述操作均在常温常压下进行。
在本说明书中，在室温常压下，在100g溶剂中，能溶解不小于10g产物的溶剂称为良溶剂；在室温常压下，在100g溶剂中，能溶解不大于1g产物的溶剂称为不良溶剂。
在本说明书中，步骤(4)和步骤(5)的良溶剂可相同或不同，优选不同。
在本说明书中，步骤(2)和步骤(5)的不良溶剂可相同或不同，优选相同。
在步骤(1)中，所述稀释剂可以是所有对参与该反应的物质呈惰性的有机溶剂，例如，但不限于：DMF、1,4-二氧六环等，或其任意组合，
所述碱可为碱性较弱的碱，例如，但不限于：有机碱，如吡啶、三乙胺等，
所述磺化试剂可为三氧化硫吡啶络合物、硫酸、发烟硫酸或三氧化硫DMF络合物，优选三氧化硫DMF络合物。
在步骤(2)中，所述反应液可由步骤(1)中的反应液直接得到，也可由步骤(1)中的反应液经处理后得到，如通过浓缩除去低沸点溶剂而仅剩产物和高沸点溶剂，
所述不良溶剂为与步骤(1)的反应液互溶的溶剂，例如，但不限于：醚类，如乙醚、丙醚、甲基叔丁基醚，或它们的混合物，
在一个优选的实施方案中，所用不良溶剂的温度低于0℃，
所述静置可在室温下进行也可在低温下进行，优选低温，静置的时间可为5个小时、10个小时或更长。
在步骤(3)中，所述水的温度可为0-25℃，优选0-10℃，更优选0 ℃，
所述碱可为无机碱，例如，但不限于：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾等，优选氢氧化钠，
在一个优选的实施方案中，所述碱为其水溶液的形式，例如10％的氢氧化钠水溶液，
所述弱酸性水溶液的pH可为6-7，优选6.5，
在调节pH过程中，优选在搅拌下进行。
在步骤(4)中，所述良溶剂为不与水互溶的溶剂，例如，但不限于：乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸异丙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、1,1,2,2-四氯乙烷，优选乙酸乙酯、二氯甲烷，
所述洗涤至少进行2次，优选3次，
所述浓缩操作使用本领域已知的方法进行，如减压蒸馏。
在步骤(5)中，所述良溶剂为与不良溶剂互溶的溶剂，例如，但不限于：醇类，如甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇，优选甲醇、乙醇，
加入良溶剂后进行充分搅拌，搅拌时间不低于20分钟，优选30分钟，
所述不良溶剂和良溶剂的体积比可为15-8：1，优选10：1，
在加入不良溶剂后进行充分搅拌，搅拌时间不低于5分钟，
所述收集固体可采用本领域已知的方法进行，例如离心、过滤等方法，优选离心方法。
所述干燥可采用本领域已知的方法进行，例如常压干燥、真空干燥、红外干燥、冷冻干燥，优选真空干燥方法。
以下参照实施例详细描述本发明，应理解，下述实施例意在说明，不对本发明构成限制。
实施例1：
反应瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后将200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六环混合均匀后加入到反应瓶中，搅拌溶解，称取DMF三氧化硫复合物12.4g加入反应瓶中，室温下开始搅拌过夜。TLC跟踪反应，直至Fmoc-L-酪氨酸反应完全。
反应液倒入到1200毫升冰冻的乙醚中，所得混合溶液在-20℃条件下 放置过夜。倾去上清液，残余油状物用250毫升冰水溶解，然后用10％的氢氧化钠水溶液调节使pH为6.5，过程中保持体系温度不超过0℃，所得溶液冻干。向所得冻干的固体中加入250毫升的甲醇搅拌30分钟，过滤，滤液加入到2.5升的冰冻乙醚中，搅拌5分钟，离心收集固体，真空干燥，得类白色固体32.6克，收率64.2％，HPLC检测纯度95.0％。
1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.50(s,1H),7.93(d,J＝7.4Hz,2H),7.65(d,J＝7.6Hz,2H),7.53(t,J＝6.9Hz,2H),7.28(t,J＝7.4Hz,2H),7.05(d,J＝6.9Hz,2H),6.81(d,J＝7.2Hz,2H),4.61(d,J＝5.4Hz,2H),4.56(t,J＝6.2Hz,1H),4.46(d,J＝6.2Hz,1H),3.16(m,1H),2.2(m,1H).
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实施例2：
反应瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后将200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六环混合均匀后加入到反应瓶中，搅拌溶解，称取三氧化硫N,N-二甲基甲酰胺络合物12.4克加入反应瓶中，室温下开始搅拌。TLC跟踪反应，直至Fmoc-L-酪氨酸反应完全。
反应液倒入到1200毫升冰冻的乙醚中，所得混合溶液在-20℃条件下放置过夜。倾去上清液，残余油状物用250毫升冰水溶解，用10％的NaOH水溶液调节使pH为6.5，过程中保持体系温度不超过0℃。所得水溶液用乙酸乙酯洗涤(150毫升*3)后，在35摄氏度下旋蒸至干。加入250毫升甲醇搅拌30分钟，过滤，滤液加入到2.5升的冰冻乙醚中，搅拌5分钟，离心收集固体，真空干燥，得类白色固体34.4克，收率67.7％，HPLC检测纯度99.4％。
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实施例3：
反应瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后将200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六环混合均匀后加入到反应瓶中，搅拌溶解，称取三氧化硫吡啶络合物12.8克加入反应瓶中，室 温下开始搅拌。TLC跟踪反应，直至Fmoc-L-酪氨酸反应完全。
反应液倒入到1200毫升冰冻的乙醚中，所得混合溶液在-20℃条件下放置过夜。倾去上清液，残余油状物用250毫升冰水溶解，用10％的NaOH水溶液调节使pH为6.5，过程中保持体系温度不超过0℃。所得水溶液用乙酸乙酯洗涤(150毫升*3)后，在35摄氏度下旋蒸至干。加入250毫升甲醇搅拌30分钟，过滤，滤液加入到2.5升的冰冻乙醚中，搅拌5分钟，离心收集固体，真空干燥，得类白色固体32.5克，收率64.0％HPLC检测纯度90.0％。
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实施例4：
反应瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后将200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六环混合均匀后加入到反应瓶中，搅拌溶解，量取发烟硫酸14.5毫升加入反应瓶中，室温下开始搅拌。TLC跟踪反应，直至Fmoc-L-酪氨酸反应完全。
反应液倒入到1200毫升冰冻的乙醚中，所得混合溶液在-20℃条件下放置过夜。倾去上清液，残余油状物用250毫升冰水溶解，用10％的NaOH水溶液调节使pH为6.5，过程中保持体系温度不超过0℃。所得水溶液用二氯甲烷洗涤(150毫升*3)后，在35摄氏度下旋蒸至干。加入250毫升甲醇搅拌30分钟，过滤，滤液加入到2.5升的冰冻乙醚中，搅拌5分钟，离心收集固体，真空干燥，得类白色固体22.3克，收率43.9％，HPLC检测纯度85.0％。
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实施例5：
20升反应釜中加入Fmoc-L-酪氨酸1500克，然后将9260毫升的N,N-二甲基甲酰胺、2315毫升的吡啶和1160毫升的1,4-二氧六环混合均匀后加入到反应釜中，搅拌溶解，称取三氧化硫N,N-二甲基甲酰胺络合物575克加入反应釜中，室温下开始搅拌。TLC跟踪反应，直至Fmoc-L-酪氨酸反应完全。
反应液倒入到55升冰冻的甲基叔丁基醚中，所得混合溶液在-20℃条 件下放置过夜。倾去上清液，残余油状物用11.5升冰水溶解，用10％的NaOH水溶液调节使pH为6.0，过程中保持体系温度不超过0℃。所得水溶液用乙酸异丙酯洗涤(6.9升*3)后，在35-40摄氏度下旋蒸至干。加入11.5升甲醇搅拌30分钟，过滤，滤液加入到115升的冰冻乙醚中，搅拌5分钟，离心收集固体，真空干燥，得类白色固体1587.7克，收率67.5％HPLC检测纯度97.2％。
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实施例6：
反应瓶中加入Fmoc-L-酪氨酸32.4克，然后将200毫升的N,N-二甲基甲酰胺、50毫升的吡啶和25毫升的1,4-二氧六环混合均匀后加入到反应瓶中，搅拌溶解，称取DMF三氧化硫复合物12.4g加入反应瓶中，室温下开始搅拌过夜。TLC跟踪反应，直至Fmoc-L-酪氨酸反应完全。
反应液倒入到1200毫升冰冻的丙醚中，所得混合溶液在-20℃条件下放置过夜。倾去上清液，残余油状物用250毫升冰水溶解，然后用10％的氢氧化钠水溶液调节使pH为6.9，过程中保持体系温度不超过5℃，所得溶液冻干。向所得冻干的固体中加入250毫升的甲醇搅拌30分钟，过滤，滤液加入到2.5升的冰冻丙醚中，搅拌5分钟，离心收集固体，真空干燥，得类白色固体22.1克，收率43.5％，HPLC检测纯度94.6％。
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