本发明涉及固定化酶领域，具体涉及一种固定化头孢菌素C酰化酶及其制备方法。
背景技术：
头孢菌素C酰化酶是一类N端亲核(N-terminal nucleophilic，Ntn)水解酶，可直接催化头孢菌素C(cephalosporin C，CPC)生成7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)，而7-ACA又是医药工业生产半合成头孢菌素的重要中间体，需求量很大。因此该酶的固定化在工业上具有广阔的应用前景。
目前已报道的固定化头孢菌素C酰化酶，主要采用共价法，如参考文献Characteristic of immobilized cephalosporin C acylase and itsapplication in one-step enzymatic conversion of cephalosporin C to 7-aminocephalosporanic acid.Xiangwei Zhu,Hui Luo,Yanhong Chang,Houbo Su,Qiang Li,Huimin Yu,Zhongyao Shen,World Journal of Microbiology and Biotechnology April 2011Vol 27,Issue 4,pp823-829中选用三种不同的环氧树脂，比较它们的固定化效果，筛选出了一个较好的载体；参考文献Immobilization and thermostability characterization of cephalosporin C acylase.Kai Hua Han,Hui Luo,Yao Zhen Xie,Shun Yao,Yan Hong Chang,Hui Min Yu,Qiang Li,Zhong Yao Shen,Advanced Materials Research Jan 2013Volumes 634-638,p682-688中选用5种不同的环氧树脂，比较它们的固定化效果，并对其中的一个载体进行了固定化条件的优化；中国专利申请(CN103343117A)中也报道了在醋酸钠缓冲液中用不同的载体对头孢菌素C酰化酶进行固定化的效果。
上述方法存在如下缺点：所需的固定化时间均在20小时或更长。这在 工业上会增加生产成本，不利于大批量的商品化生产。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题：针对现有头孢菌素C酰化酶固定化技术中的固定化时间较长、均在20小时或更长，增加了生产成本的问题，本发明提供了一种新的固定化头孢菌素C酰化酶及其制备方法。该方法与现有技术相比，具有固定化用时大大缩短，且在相同条件下得到的固定化酶具有更高的酶活性、稳定性和重复利用性，克服了现有文献的缺点，解决了现有技术中存在的因用时过长造成的成本增加问题，更适用于工业生产。
本发明技术方案之一：一种制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，其包括下述步骤：将ES-1树脂和头孢菌素C酰化酶在0.5-1.0mol/L，pH 7.0-10.5的磷酸盐缓冲液中混合，15-35℃固定化8-20h，得固定化头孢菌素C酰化酶。
本发明较佳地还可以包括下述步骤：将得到的固定化头孢菌素C酰化酶用0.01-0.1mol/L磷酸盐缓冲液或水洗涤，较佳地洗涤3-5次，以除去表面未结合的蛋白。
本发明较佳地还可以包括固定化头孢菌素C酰化酶的活性检测方法。所述检测方法为：将收集的固定化头孢菌素C酰化酶加入含有头孢菌素C的PBS缓冲液中反应，检测7-ACA的生成量，计算它的表观酶活回收率。
本发明中，所述ES-1树脂为本领域常规，购自天津南开和成科技有限公司，所述ES-1树脂也被称为ESS-1树脂或ES-V-1树脂，为一种负载有环氧基团的载体。较佳地，所述ES-1树脂为预处理后的ES-1树脂。所述预处理包括下述步骤：所述ES-1树脂在0.01-0.1mol/L pH8.0-8.5的磷酸盐缓冲液中，20-30℃静置15-30min，得预处理后的ES-1树脂。所得的预处理后的ES-1树脂较佳地还可以洗涤、抽干，所述洗涤的次数为本领域常规，较佳地为3～5次，所述抽干为本领域常规，较佳地为使用真空泵抽干。所述预处理后的ES-1较佳地于4℃保存备用。
本发明中，所述头孢菌素C酰化酶为本领域常规，包括野生型头孢菌素 C酰化酶或者具有头孢菌素C酰化酶活性的突变体。所述头孢菌素C酰化酶的制备方法为本领域常规，较佳地为通过含有头孢菌素C酰化酶基因重组载体的转化体表达纯化制得，更佳地为通过含有表达头孢菌素C酰化酶的pET28a(+)重组载体的E.coli BL21(DE3)菌株表达纯化制得。
本发明中，所述头孢菌素C酰化酶与ES-1树脂加入的比例较佳地为150-280U/g，更佳为200U/g。所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.5-1.0mol/L，较佳地为0.7-1.0mol/L，更佳地为0.9-1.0mol/L，最佳地为1.0mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0-10.5，较佳地为8.5-10.5，更佳地为9.0-10.0，最佳地为9.5。所述固定化为本领域常规，较佳地为震荡或搅拌固定化。所述震荡为本领域常规，较佳地为通过旋转固定化，更佳地为用摇床旋转。所述旋转的转速为本领域常规，较佳地为120-180r/min，更佳地为120-150r/min，最佳地为150r/min。所述固定化的温度为15-35℃，较佳地为15-25℃，更佳地为25℃，所述固定化的时间为8-20h，较佳地为8-12h，更佳地为10-12h，最佳地为12h。
本发明中，较佳地还可以包括下述步骤：将得到的固定化酶用0.01-0.1mol/L的磷酸盐缓冲液或水洗涤，以除去表面未结合的蛋白。所述洗涤为本领域常规，较佳地为洗涤3～5次。所得洗涤后的固定化酶较佳地还可以抽滤，所述抽滤为本领域常规，较佳地为使用真空泵抽滤。所得的抽滤后的固定化酶较佳地保存在4℃备用。所述磷酸盐缓冲液为本领域常规，较佳地为磷酸钠缓冲液。所述磷酸盐缓冲液pH值为本领域常规，较佳地为8.0-8.5。
本发明中，固定化头孢菌素C酰化酶的活性检测方法为：将收集的固定化酶加入含有头孢菌素C的PBS缓冲液中反应，检测7-ACA的生成量，计算表观酶活回收率。所述PBS缓冲液的浓度为本领域常规，较佳地为0.1mol/L。所述PBS缓冲液中头孢菌素C的含量为本领域常规，较佳地为5mg/ml。所述反应的时间为本领域常规，较佳地为15min。所述检测7-ACA的生成量的方法为本领域常规，较佳地为HPLC。
本发明技术方案之二：一种固定化头孢菌素C酰化酶，其包括ES-1 树脂和固定于ES-1树脂上的头孢菌素C酰化酶。较佳地，所述头孢菌素C酰化酶通过氨基酸残基与ES-1树脂上的环氧基团形成共价键；所述固定于ES-1树脂上的头孢菌素C酰化酶的表观酶活为75-120U/g。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明针对现有固定化头孢菌素C酰化酶的技术中的固定化时间长，酶活性回收率低的问题，提供了一种固定化时间缩短至12h、酶活回收率提高到40％以上的固定化头孢菌素C酰化酶的方法，该方法解决了现有技术高生产成本的问题，更适用于工业生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中的头孢菌素C酰化酶通过文献[CPC酰化酶的人工合成和重组表达，安明，于慧敏，罗晖等，清华大学学报(自然科学版)，2008,48(9)：119-123]记载的方法制备得到：在37℃，200r/min条件下培养重组大肠杆菌10-12h制作种子培养液。从种瓶中按2％接种量转接到卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养约1h至菌密度OD600达到0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，28℃下诱导24h，收集菌体，再用金属亲合法纯化出其中的目的蛋白，即重组头孢菌素C酰化酶。
实施例1
(1)将ES-1树脂(购自天津南开和成科技有限公司)置于400ml pH8.0的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中在25℃下静置15min，用水洗涤3次后用真空泵抽干，于4℃保存备用；
(2)取1g预处理好的ES-1树脂，加入200U的酶液，在1.0mol/L，pH9.5 的磷酸钾缓冲液中，于25℃、150r/min的摇床震荡固定12h；
(3)将上述得到的固定化酶用0.1mol/L，pH8.0的磷酸钠缓冲液洗涤3次，以除去表面未结合的蛋白，并用真空泵抽滤，得到的固定化酶保存在4℃备用；
(4)将得到的固定化酶进行表观酶活回收率的测定，即将回收的固定化酶加入到含有5.0mg/ml CPC的pH8.0的0.1mol/L的PBS溶液中，于37℃，150r/min摇床反应15min，用HPLC检测7-ACA的生成量。与游离酶进行对比，计算此时所得固定化酶的表观酶活回收率达到60％，固定化酶的表观酶活为120U/g。
实施例2
(1)同实施例1，先将载体进行预处理；
(2)取1g预处理好的ES-1树脂，加入200U的酶液，在0.5mol/L，pH8.5磷酸钾缓冲液中，于35℃、150r/min的摇床震荡固定8h；
(3)回收固定化酶，同实施例1的步骤(3)；
(4)检测活性，同实施例1的步骤(4)，此时的固定化酶的表观酶活回收率为41％，固定化酶的表观酶活为82U/g。
实施例3
其它操作如实施例1，仅不同处在于固定化时磷酸钾缓冲液浓度为0.5mol/L，此时的固定化酶的表观酶活回收率为45％，固定化酶的表观酶活为90U/g。
实施例4
其它操作步骤如实施例1，仅不同处在于固定化的时间为20h，此时的表观酶活回收率为48％，固定化酶的表观酶活为96U/g。
实施例5
其它操作如实施例1，不同处仅在于ES-1树脂未经过预处理，此时的固定化酶的表观酶活回收率为40％，固定化酶的表观酶活为80U/g。
实施例6
(1)将ES-1树脂(购自天津南开和成科技有限公司)置于400ml pH8.5的0.01mol/L的磷酸钾缓冲液中在30℃下静置30min，用水洗涤3次后用真空泵抽干，于4℃保存备用；
(2)取1g预处理好的ES-1树脂，加入200U的酶液，在1.0mol/L，pH10.5的磷酸钾缓冲液中，于15℃、150r/min的摇床震荡固定12h；
(3)将上述得到的固定化酶用0.1mol/L，pH8.0的磷酸钠缓冲液洗涤3次，以除去表面未结合的蛋白，并用真空泵抽滤，得到的固定化酶保存在4℃备用。此时的表观酶活回收率为42％，固定化酶的表观酶活为84U/g。
实施例7
(1)将ES-1树脂(购自天津南开和成科技有限公司)置于400ml pH8.2的0.05mol/L的磷酸钾缓冲液中在20℃下静置20min，用水洗涤3次后用真空泵抽干，于4℃保存备用；
(2)取1g预处理好的ES-1树脂，加入200U的酶液，在0.5mol/L，pH9.0的磷酸钾缓冲液中，于25℃、150r/min的摇床震荡固定12h；
(3)将上述得到的固定化酶用0.1mol/L，pH8.0的磷酸钠缓冲液洗涤3次，以除去表面未结合的蛋白，并用真空泵抽滤，得到的固定化酶保存在4℃备用。此时的表观酶活回收率为45％，固定化酶的表观酶活为90U/g。
实施例8
(1)将ES-1树脂(购自天津南开和成科技有限公司)置于400ml pH8.0的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中在25℃下静置15min，用水洗涤5次后用真空泵抽干，于4℃保存备用；
(2)取1g预处理好的ES-1树脂，加入150U的酶液，在0.9mol/L，pH7.0的磷酸钠缓冲液中，于30℃、120r/min的摇床震荡固定12h；
(3)将上述得到的固定化酶用0.01mol/L，pH8.0的磷酸钠缓冲液洗涤3次，以除去表面未结合的蛋白，并用真空泵抽滤，得到的固定化酶保存在4℃备用。此时的表观酶活回收率为50％，固定化酶的表观酶活为75U/g。
实施例9
(1)将ES-1树脂(购自天津南开和成科技有限公司)置于400ml pH 8.0的0.1mol/L的磷酸钾缓冲液中在25℃下静置15min，用水洗涤3次后用真空泵抽干，于4℃保存备用；
(2)取1g预处理好的ES-1树脂，加入280U的酶液，在0.6mol/L，pH9.5的磷酸钾缓冲液中，于20℃、180r/min的摇床震荡固定12h；
(3)将上述得到的固定化酶用去离子水洗涤5次，以除去表面未结合的蛋白，并用真空泵抽滤，得到的固定化酶保存在4℃备用。此时的表观酶活回收率为40％，固定化酶的表观酶活为112U/g。
以下对比例中用到的载体中，Eupergit C250L为单体聚合多孔小球状树脂，颗粒直径分布在120-250μm，担载量约为25mmol环氧基团/100g，具有良好的机械操作强度和化学稳定性，在pH 0-14的酸碱范围内均保持稳定；LX-1000EP：分子中具有两个或两个以上活性环氧基团的低聚物，粒径150-300μm；ES-1，ES-105，ES-103B粒径大小都是100-300μm，但是在骨架、比表面积等方面都有差异。
对比例1
环氧树脂LX-1000EP固定CPC酰化酶
(1)同实施例1对ES-1、LX-1000EP树脂(购自西安蓝晓科技有限公司)，进行预处理；
(2)取1g经过预处理的ES-1、LX-1000EP树脂，分别加入200U的酶，同时在1mol/L，pH8.0的磷酸钾缓冲液中，于25℃，150r/min的摇床震荡24h；
(3)回收固定化酶，同实施例1的步骤(3)；
(4)检测活性，同实施例1的步骤(4)。此时得到的固定化酶ES-1、LX1000-EP的表观酶活回收率分别为45％、28％。
对比例2
环氧树脂Eupergit C250L(购自Sigma Chemical Co.参考文献：Eupergit C250L固定化D-海因酶及其催化性质，丁成勇，徐晓滢，马喆，等。生物 加工过程，2006,11,4(4)：41-45.)固定化CPC酰化酶
(1)同实施例1对Eupergit C250L、ES-1树脂进行预处理；
(2)取1g经过预处理的Eupergit C250L、ES-1树脂，分别加入等量的酶液，同时在1mol/L，pH8.0的磷酸钾缓冲液中，于25℃，150r/min的摇床震荡24h；
(3)回收固定化酶，同实施例1的步骤(3)；
(4)检测活性，同实施例1的步骤(4)。此时得到的固定化酶ES-1、Eupergit C250L的表观酶活回收率分别为45％、30％。
对比例3
环氧树脂ES105固定化CPC酰化酶
(1)同实施例1对ES105(购自天津南开和成科技有限公司)、ES-1树脂进行预处理；
(2)取1g经过预处理的ES105、ES-1树脂，分别加入等量的酶液，同时在1mol/L，pH8.0的磷酸钾缓冲液中，于25℃，150r/min的摇床震荡24h；
(3)回收固定化酶，同实施例1的步骤(3)；
(4)检测活性，同实施例1的步骤(4)。此时得到的固定化酶ES-1、ES105的表观酶活回收率分别为45％、35％。
对比例4
环氧树脂ES103B固定化CPC酰化酶
(1)同实施例1对ES103B(购自天津南开和成科技有限公司)、ES-1树脂进行预处理；
(2)取1g经过预处理的ES103B和ES-1树脂，分别加入等量的酶液，同时在1mol/L，pH8.0的磷酸钾缓冲液中，于25℃，150r/min的摇床震荡24h；
(3)回收固定化酶，同实施例1的步骤(3)；
(4)检测活性，同实施例1的步骤(4)。此时得到的固定化酶ES-1、ES103B的表观酶活回收率分别为45％、33％。
对比例5
(1)将ES-1树脂和ES-105树脂分别在各自最优的条件下进行固定化，即将1g预处理的ES-1树脂和200U的头孢菌素C酰化酶共同置于1.0mol/L pH9.5的磷酸盐缓冲液中，于25℃摇床150r/min固定12h后；将1g预处理的ES-105载体和200U的头孢菌素C酰化酶共同置于0.5mol/L pH8.0的磷酸钾缓冲液中，于20℃摇床150r/min固定28h；
(2)回收固定化酶，同实施例1的步骤(3)；
(3)将回收到的固定化酶分别置于50℃中水浴处理2h，检测残留的固定化酶活力，即将固定化酶加入到含有5.0mg/ml CPC的pH8.5的0.1mol/L的PBS溶液中，于37℃，150r/min摇床反应1h(参考文献并加以改进：国产固定化GL-7-ACA酰化酶制备7-ACA的工艺优化，中南林学院学报，莫章桦，刘友全，张小飞，2006，26(1)：44-47)，用HPLC检测7-ACA的生成量，计算酶的转化效率，。得到的ES-1和ES-105的残留活力分别为初始活力的92.61％，67.20％。
对比例6
(1)将ES-1树脂和ES-105树脂分别在各自最优的条件下进行固定化，同对比例5的步骤(1)；
(2)回收固定化酶，同实施例1的步骤(3)；
(3)将回收到的固定化酶分别置于4℃，在pH7.0的磷酸钾缓冲液中处理2h，检测残留的固定化酶活力，同对比例5的步骤(3)。得到的ES-1和ES-105的残留活力分别为初始活力的71.69％，62.23％。
对比例7
(1)将ES-1树脂和ES-105树脂分别在各自最优的条件下进行固定化，同对比例5的步骤(1)；
(2)回收固定化酶，同实施例1的步骤(3)；
(3)分别检测各固定化酶活性，同实施例1的步骤(4)。重复反应15批，分别计算得到ES-1和ES-105固定化酶第15批的反应活性为第一批反 应活性的90.11％和81.53％。
对比例8
(1)分别取1g实施例1预处理好的ES-1树脂，加入200U的酶液，在1.0mol/L，pH8.0的磷酸钾缓冲液中，于25℃、150r/min的摇床震荡固定8h，12h，16h，20h，24h；
(2)将上述得到的固定化酶用0.1mol/L，pH8.0的磷酸钠缓冲液洗涤3次，以除去表面未结合的蛋白，并用真空泵抽滤，得到的固定化酶保存在4℃备用。
(3)检测活性，同实施例1的步骤(4)。计算8h，12h，16h，20h，24h固定化酶的表观酶活回收率分别为50％、55％、52％、48％、45％。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。