一种制备固定化头孢菌素c酰化酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，包括：以戊二醛作为交联剂将头孢菌素C酰化酶固定在氨基载体上,然后用含氨基的大分子进行后修饰。本发明的方法能够获得具有较高稳定性的固定化头孢菌素C酰化酶。本发明提供的制备方法简单，工艺稳定，生产成本低。
【专利说明】一种制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法。
【背景技术】
[0002]头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)酰化酶是一步酶法生产7_氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)的一种酰化酶,可以直接催化底物头孢菌素C,脱去D- α -氨基己二酸侧链，一步生产7-ACA。与传统的两步酶法相比，一步酶法操作更简单、方便，成本低，日益受到重视。固定化酶技术是产生于20世纪六十年代，目前已广泛应用于生物催化领域的工业生产中。与游离酶相比，固定化酶具有稳定性高、回收方便、易于控制、可重复使用、成本低廉等优点，在两步酶法生产7-ACA的生产中的酶制剂采用的即是固定化酶技术。
[0003]近年来，随着酶固定化技术的发展，人们越来越多地利用共价法固定化酶来生产各种β内酰胺类抗生素。在两步法生产7-ACA的工艺中即广泛采用了共价结合法固定化酶(Roberto Fernandez-Lafuente, et al.Journal of MolecularCatalysis B:Enzymatic, 1999，7:173 - 179;FernandoLopez-Gallegojet al.Journal ofBiotechnology, 2004, 111:219 - 227)。在固定化酶的工业应用中，为了降低固定化酶的使用成本，一般要求固定化酶具有较好的活性和稳定性，可以重复、多批次的使用。因此，在一步酶法生产7-ACA技术的开发中，通过酶分子的基因工程改造、新型固定化酶载体的制备、固定化工艺的改进等，制备得到酶活高、稳定性好的固定化CPC酰化酶是至关重要的。在酶的固定化工艺中，如果在基本不影响固定化酶活性的前提下进一步提高固定化酶的催化稳定性，将更有利于固定化酶用于7-ACA的工业生产。
[0004]戊二醛作为交联剂用于酶固定化是已知的，其能通过单点或多点固定化来提高酶的稳定性。可以将富含氨基的载体用戊二醛活化之后再进行酶固定化，也可以首先将酶与氨基载体进行离子吸附，之后加入戊二醛。在使用戊二醛进行酶固定化之后，可以使用小分子化合物例如小分子胺、氨基酸、巯基乙醇等对固定的酶进行后修饰，所述后修饰主要是为了封闭未反应完的活性基团例如醛基。
【发明内容】
[0005]在对固定CPC酰化酶的研究过程中，发明人发现使用含氨基的大分子对戊二醛固定化的CPC酰化酶进行后修饰，获得的固定化CPC酰化酶的热稳定性和耐酸性比不进行后修饰或使用小分子化合物进行后修饰显著增加。对于热稳定性和耐酸性增加的机理还不是很清楚，但是，推测含氨基的大分子可以在载体和/或酶分子上未反应的活性基团(例如醛基)之间“架桥”，并且由于含氨基的大分子自身的柔性，可以填充酶分子、载体和戊二醛之间存在的间隙，从而对酶分子形成一定的“捆绑”作用，因此增加酶分子的结构稳定性。
[0006]在本发明 的一个方面，提供了制备固定化CPC酰化酶的方法，包括:采用戊二醛交联剂使头孢菌素C酰化酶固定在氨基载体上，然后用含氨基的大分子进行后修饰。[0007]所述氨基载体先用戊二醛活化处理，再进行头孢菌素C酰化酶的固定化。或者，头孢菌素C酰化酶先吸附固定在氨基载体上，再用戊二醛交联。
[0008]上述后修饰按如下进行:将戊二醛固定的CPC酰化酶与含氨基的大分子在缓冲液特别是磷酸钠缓冲液中混合，调节PH值为7.0-9.0,室温搅拌2_40h。
[0009]任选地，对后修饰之后的固定化CPC酰化酶进行洗涤和干燥。
[0010]所述含氨基的大分子选自聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、聚赖氨酸等。
[0011]在所述后修饰过程中，使用浓度为0.l-10g/100ml，例如2.5g/100ml的含氨基的大分子在缓冲液中的溶液。
[0012]所述pH值可以是在7.5-8.5范围，例如pH为8.0。
[0013]搅拌进行的时间可以是例如3-30小时、5-30小时、10-28小时、15-25小时、20-24小时；还可以是例如24小时。
[0014]搅拌转速可以是50-300rpm，例如100_200rpm。
[0015]本发明还提供了由本发明的方法得到的固定化头孢菌素C酰化酶。
[0016]本发明具有以下优点:
[0017](I)制备的固定化CPC酰化酶较没有进行后修饰方式得到的CPC酰化酶热稳定性和耐酸性增强。
[0018](2)所用的试剂都是常见的试剂，用量较小，成本低，无污染；
.[0019](3)工艺简单，操作方便，操作稳定性好，非常适于工业化生产。
【具体实施方式】
[0020]以下将更详细地描述本发明。
[0021]作为本发明的方法中使用的CPC酰化酶，其可以通过本领域技术人员已知的方法获得。举例来说，所述CPC酰化酶可以通过微生物例如重组大肠杆菌培养获得；例如，由重组大肠杆菌BL21 (DE3)/pET-CPCacy经过摇瓶培养，超声波细胞破碎，离心，制备而得(ZhuXff, et al., WorldjournalofMicrobiologyandBiotechnology, 2011, 27(4):823_829)。
[0022]作为本发明的方法中使用的载体，为酶固定化工艺中常用的富含氨基的载体，也称为氨基载体，例如LX-1000HA，得自西安蓝晓科技有限公司。
[0023]作为在本发明的方法中使用的缓冲体系可以为磷酸钠缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸纳缓冲液等。
[0024]作为在本发明中使用的所述含氨基的大分子，可以使用任意的含有氨基的大分子，只要该大分子可以溶于酶固定化过程中使用的缓冲液，其实例包括聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、聚赖氨酸等。
[0025]以下通过实施例对添加含氨基的大分子进行CPC酰化酶固定化酶制备的方法进行详细的阐述。
[0026]实施例中的分析方法:
[0027]( I)游离CPC酰化酶的酶活测定:
[0028]CPC酰化酶活力的定义:在370C、pH8.5、底物浓度一定的条件下，每分钟催化CPC生成I μ mol7-ACA所需的酶量为I个活力单位。
[0029]I)用0.lmol/L、pH8.5的磷酸钠缓冲液分别配制20mg/mL的CPC溶液和3mg/mL的7-ACA溶液，并用lmol/L的NaOH溶液调其pH至8.5。
[0030]2)分别取0、1、2、4、8、12、16、2(1740六溶液加入到离心管中，再用0.lmol/L、pH8.5的磷酸钠缓冲液逐一补足到20 μ L。
[0031]3)分别向各管中加入20 μ L CPC溶液(37°C预热3min)并混匀，37°C静置5min后加入200 μ L终止液(50mmol/L的NaOH溶液与20%的冰醋酸溶液按1:2的体积比混合而成)，并震荡充分混匀。
[0032]4)将上述混合液12000rpm离3min，然后各取200 μ L上清液到新的离心管中，再加入40 μ L显色剂(对二甲氨基苯甲醛的甲醇溶液(0.5%,w/v))并混匀，室温静置IOmin后，各取200 μ L，以O为空白对照，分别测定其它几个样品在415nm处的吸光度值(采用上海精密科学仪器有限公司生产的722S型可见光分光光度计进行测定)。
[0033]5)以7-ACA浓度为横坐标，OD415为纵坐标绘制标准曲线。
[0034]6)取20 μ L CPC酰化酶溶液加入到离心管中(37°C预热lmin)，再加入20 μ L CPC溶液(37°C预热3min)，37°C反应5min后加入200 μ L终止液，混匀。
[0035]7)将上述混合液12000rpm离心3min后取200yL上清液到离心管中，再加入40 μ L显色剂并混匀，室温静置IOmin后，取200 μ L测定其在415nm处的吸光度值。
[0036]8)通过标准曲线计算7-ACA浓度，最终计算出CPC酰化酶的活性。
[0037](2)固定化CPC酰化酶的酶活测定:
[0038]固定化CPC酰化酶的酶活测定法方和游离酶的类似。
[0039]I)称取一定质量的固定化酶于37°C预热3min。
[0040]2)加入37°C预热的0.lmol/L、pH8.5的磷酸钠缓冲液分别配制20mg/mL的CPC溶液 4mL。
[0041]3) 37°C、160rpm 反应 5min。
[0042]4)取20 μ L上清液进行适当稀释，加入200 μ L终止液，混匀。
[0043]5)将上述混合液12000rpm离心3min后取200yL上清液到离心管中，再加入40 μ L显色剂并混匀，室温静置IOmin后，取200 μ L测定其在415nm处的吸光度值(采用上海精密科学仪器有限公司生产的722S型可见光分光光度计进行测定)。
[0044]6)通过标准曲线计算7-ACA浓度，最终计算出固定化CPC酰化酶的活性。
[0045](3)固定化酶的热稳定性确定
[0046]在本发明中，固定化酶的热稳定性考察是在0.1M的pH8.0的磷酸钠溶液中，于50°C水浴中进行热处理Ih后的残余酶活比。残余酶活比=固定化酶热处理后酶活/固定化酶原始酶活。
[0047](4)固定化酶耐酸性测定
[0048]将固定化酶置于醋酸缓冲液(20mM，pH5.5)中，25度下温育不同的时间，定时从其中取样测剩余酶活。在本发明中，固定化酶的半衰期是指在此条件下固定化酶的活性降为初始酶活一半所需的时间。
[0049]实施例1:氨基载体用戊二醛活化后与CPC酰化酶固定，再用PEI1800进行后修饰
[0050](I)Ig氨基载体LX-1000HA加入0.1M、pH8.0的磷酸钠缓冲液4mL，搅拌15分钟后，测PH值，维持pH7.8-8.2，I小时后过滤抽干。将处理好的Ig载体加入已配制好的2%的戊二醛磷酸钠缓冲液(PH8.0)中，25°C下搅拌I小时，过滤，用去离子水洗涤载体至水清，抽干，4°C保存备用。
[0051](2)有30U游离酶酶活的IOmL0.1M磷酸钠缓冲液(ρΗ8.0)，取步骤(I)活化的载体Ig加入到该体系中，25°C下低速搅拌20h。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值8.0的磷酸钠缓冲液洗涤，抽干回收。
[0052](3)在IOmL磷酸钠缓冲液中(0.1M、pH值8.0)分别加入0,0.25gPEI1800 (分子量为1800的PEI)，摇匀待PEI1800完全溶解，取步骤(2)的固定化酶Ig加入到该体系中，将固定体系终PH值调为8.0，25°C下低速搅拌24h。将上述固定后得到的固定化酶用大量
0.1Μ、ρΗ值8.0的磷酸钠缓冲液洗涤，抽干回收。
[0053]将处理后的固定化酶进行酶活测定，加入0,2.5%PEI1800制备的固定化CPC酰化酶酶活分别为25、23U/g。将加入0、2.5%PEI1800制备的固定化酶对其50°C热处理Ih后，测得其残余酶活比例分别为25.1%和34.9%。
[0054]实施例2:氨基载体用戊二醛活化后与CPC酰化酶固定，再用PEI20000进行后修饰
[0055]( I)同实施例1，首先将载体进行活化。
[0056](2)同实例1，将得到载体与游离酶进行共价结合。
[0057](3)在IOmL磷酸钠缓冲液中(0.1Μ、ρΗ值8.0)分别加入0,0.25gPEI20000 (分子量为20000的PEI)，摇匀待PEI20000完全溶解，取步骤(2)的固定化酶Ig加入到该体系中，将固定体系终PH值调为8.0，25°C下低速搅拌24h。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值8.0的磷酸钠缓冲液洗涤，抽干回收。
[0058]将处理后的固定 化酶进行酶活测定，加入0、2.5%PEI20000制备的固定化CPC酰化酶酶活分别为25、23U/g。将加入0、2.5%PEI20000制备的固定化酶按照实例I对其50°C热处理Ih后，测得其残余酶活比例分别为25.1%和38.9%。
[0059]实施例3:氨基载体用戊二醛活化后与CPC酰化酶固定，再用羧甲基壳聚糖进行后修饰
[0060]( I)同实施例1，首先将载体进行活化。
[0061](2)同实例1，将得到载体与游离酶进行共价结合
[0062](3)在IOmL磷酸钠缓冲液中(0.1M、pH值8.0)分别加入0、0.25g羧甲基壳聚糖，摇匀待羧甲基壳聚糖完全溶解，取步骤(2)的固定化酶Ig加入到该体系中，将固定体系终pH值调为8.0，25°C下低速搅拌24h。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1Μ、ρΗ值8.0的磷酸钠缓冲液洗涤，抽干回收
[0063]将处理后的固定化酶进行酶活测定，加入0,2.5%羧甲基壳聚糖制备的固定化CPC酰化酶酶活分别为25、24U/g。将加入0、2.5%羧甲基壳聚糖制备的固定化酶按照实例I对其50°C热处理Ih后，测得其残余酶活比例分别为25.1%和37.6%。
[0064]对比例1:氨基载体用戊二醛活化后与CPC酰化酶固定，再用己二胺进行后修饰
[0065](I)同实施例1，首先将载体进行活化。
[0066](2)同实例1，将得到载体与游离酶进行共价结合
[0067](3)在IOmL磷酸钠缓冲液中(0.1Μ、ρΗ值8.0)分别加入0、2.32g己二胺(分子量为116.2)，摇匀待己二胺完全溶解，取步骤(2)的固定化酶Ig加入到该体系中，将固定体系终pH值调为8.0，25°C下低速搅拌24h。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值8.0的磷酸钠缓冲液洗涤，抽干回收
[0068]将处理后的固定化酶进行酶活测定，加入0、2M己二胺制备的固定化CPC酰化酶酶活分别为25、23U/g。将加入0、2M己二胺制备的固定化酶按照实例I对其50°C热处理Ih后，测得其残余酶活比例分别为25.1%和25.3%。而在实施例1、2、3中，用含氨基的大分子(PEI，壳聚糖，羧甲基壳聚糖)采用相同方法处理固定化酶，其酶活稳定性要明显高的多。
[0069]实施例4 =CPC酰化酶吸附在氨基载体上，用戊二醛交联后再用PEI1800进行后修饰
[0070](I)Ig氨基载体加入0.1Μ、ρΗ8.0的磷酸钠缓冲液4mL，搅拌15分钟后，测pH值，维持pH7.8-8.2，I小时后过滤抽干。将处理好的Ig载体加入到有30U游离酶酶活的IOml0.1M磷酸钠缓冲液(PH8.0)中25°C下低速搅拌20h。将上述固定后得到的固定化酶用大量0.1M、pH值8.0的磷酸钠缓冲液洗涤，抽干回收。
[0071](2)将步骤(I)得到固定化酶Ig加入已配制好的0.5%的戊二醛磷酸钠缓冲液(PH8.0)中，25°C下搅拌I小时，过滤，用去离子水洗涤载体至水清，抽干，4°C保存备用。
[0072](3)在IOmL磷酸钠缓冲液中(0.1M、pH值8.0)分别加入O、0.25gPEI1800,摇匀待PEI1800完全溶解，取步骤(2 )的固定化酶Ig加入到该体系中，将固定体系终pH值调为8.0，25°C下低速搅拌24h。
[0073](4)同实例1，将得到的固定化酶进行洗涤处理。
[0074]将处理后的固定化酶进行酶活测定，加入0,2.5%PEI1800制备的固定化CPC酰化酶酶活分别为18、14U/g。将加入0、2.5%PEI1800制备的固定化酶按照实例I对其50°C热处理后，测得其残余酶活比 例分别为48.1%和65.4%。
[0075]实施例5 =CPC酰化酶固定在氨基载体上，用戊二醛交联后再用羧甲基壳聚糖进行后修饰
[0076](I)同实例4，将载体洗涤后与酶吸附。
[0077](2)同实施例4，步骤(I)得到固定化酶用戊二醛交联。
[0078](3)在IOmL磷酸钠缓冲液中(0.1M、pH值8.0)分别加入0、0.25g羧甲基壳聚糖，摇匀待羧甲基壳聚糖完全溶解，取步骤(2)的固定化酶Ig加入到该体系中，将固定体系终pH值调为8.0，25°C下低速搅拌24h。
[0079](4)同实例1，将得到的固定化酶进行洗涤处理。
[0080]将处理后的固定化酶进行酶活测定，加入0,2.5%羧甲基壳聚糖制备的固定化CPC酰化酶酶活分别为18、18U/g。将加入0、2.5%羧甲基壳聚糖制备的固定化酶按照实例I对其50°C热处理后，测得其残余酶活比例分别为48.1%和67.6%。
[0081]实施例6:CPC酰化酶吸附固定在氨基载体上，用戊二醛交联后再用PEI20000进行后修饰
[0082](I)同实例4，将载体洗涤后与酶吸附
[0083](2)同实施例4，步骤(I)得到固定化酶用戊二醛交联。
[0084](3)在IOmL磷酸钠缓冲液中(0.1M、pH值8.0)分别加入0、0.25gPEI20000，摇匀待PEI20000完全溶解，取步骤(2)的固定化酶Ig加入到该体系中，将固定体系终pH值调为8.0，25 °C下低速搅拌24h。
[0085](4)同实例1，将得到的固定化酶进行洗涤处理。[0086]将处理后的固定化酶进行酶活测定，加入0、2.5%PEI20000制备的固定化CPC酰化酶酶活分别为18、14U/g。将加入0、2.5%PEI20000制备的固定化酶按照实例I对其50°C热处理后，测得其残余酶活比例分别为48.1%和77.8%。将将加入0、2.5%PEI20000制备的固定化酶放到pH5.5(25°C )下放置，测得其半衰期分别为1.3h, 2.3h。
[0087]实施例7:CPC酰化酶吸附固定在氨基载体上，用戊二醛交联后再用壳聚糖2000进行后修饰
[0088](I)同实例4，将载体洗涤后与酶吸附
[0089](2)同实施例4，步骤(I)得到固定化酶用戊二醛交联。
[0090](3)在IOmL磷酸钠缓冲液中(0.1Μ、ρΗ值8.0)分别加入0、0.25g壳聚糖2000，摇匀待壳聚糖2000 (分子量为2000的壳聚糖)完全溶解，取步骤(2)的固定化酶Ig加入到该体系中，将固定体系终PH值调为8.0，25°C下低速搅拌24h。
[0091](4)同实例1，将得到的固定化酶进行洗涤处理。
[0092]将处理后的固定化酶进行酶活测定，加入0,2.5%壳聚糖2000制备的固定化CPC酰化酶酶活分别为18、15U/g。将加入0、2.5%壳寡糖2000制备的固定化酶按照实例I对其50°C热处理后，测得其残余酶活比例分别为48.1%和77.0%。将加入0、2.5%壳寡糖2000制备的固定化酶按照实例6对其进行pH5.5放置后，半衰期分别为1.3h, 2.lh。
[0093]对比例2:CPC酰化酶吸附固定在氨基载体上，用戊二醛交联后再用乙二胺进行后修饰
[0094]( I)同实例4，将载体洗涤后与酶吸附
[0095](2)同实施例4，步骤(I)得到固定化酶用戊二醛交联。
[0096](3)在IOmL磷酸钠缓冲液中(0.1Μ、ρΗ值8.0)分别加入O、1.2g乙二胺(分子量为60.1)，摇匀乙二胺完全溶解，取步骤(2)的固定化酶Ig加入到该体系中，将固定体系终pH值调为8.0，25°C下低速搅拌24h。
[0097](4)同实例1，将得到的固定化酶进行洗涤处理。
[0098]将处理后的固定化酶进行酶活测定，加入0、2M乙二胺制备的固定化CPC酰化酶酶活分别为18、13U/g。将加入0、2M乙二胺制备的固定化酶按照实例I对其50°C热处理后，测得其残余酶活比例分别为48.1%和51.3%。而在实施例4、5、6、7中，用含氨基的大分子(PEI，壳聚糖，羧甲基壳聚糖)采用相同方法处理固定化酶，其酶活稳定性要明显高的多。
[0099]最后所应说明的是:以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换；而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的范围内。
【权利要求】
1.一种制备固定化头孢菌素C酰化酶的方法，包括:采用戊二醛交联剂使头孢菌素C酰化酶固定在氨基载体上，然后用含氨基的大分子进行后修饰。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:氨基载体先用戊二醛活化处理，再进行头孢菌素C酰化酶的固定化。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:头孢菌素C酰化酶先吸附固定在氨基载体上，再用戊二醛交联。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于:所述含氨基的大分子选自聚乙烯亚胺、壳聚糖、羧甲基壳聚糖和聚赖氨酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:在所述后修饰过程中，使用浓度为0.lg/100ml-10g/100ml，例如2.5g/100ml的含氨基的大分子在缓冲液中的溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于:所述方法中使用磷酸钠缓冲液、硼酸缓冲液或碳酸钠缓冲液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于:所述后修饰按如下进行:将戊二醛固定的CPC酰化酶与含氨基的大分子在缓冲液，特别是磷酸钠缓冲液，中混合，调节pH值为7.0-9.0,室温搅拌2-40小时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述搅拌进行3-30小时、5-30小时、10-28小时、15-25小时、20-24小时；例如24小时。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:搅拌转速是50-300rpm，例如100-200rpmo
10.由权利要求1-9任一项所述的方法得到的固定化头孢菌素C酰化酶。
【文档编号】C12N11/08GK103436517SQ201310401009
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】罗晖, 何华, 常雁红, 魏艳梅, 于慧敏, 沈忠耀 申请人:北京科技大学