专利名称：一种头孢菌素c酰化酶突变体及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术制药领域，具体地涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因与应用。
背景技术：
近年来，由于头孢菌素类抗生素过敏反应小，对P -内酰胺酶较稳定，具有抗菌谱广、疗效好、毒低、同其他抗生素无交叉耐药性、与青霉素较少产交叉过敏反应等优点，已经成为抗感染最重要的有效药物。研究发现，头孢菌素的抗菌部为其母核7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA),因此作为合成半合成头孢菌素重要中间体，7-ACA的研究生产显得至关重要。头孢菌素C (Cephalosporin C，CPC)经化学法或是酶法裂解得到7-ACA。化学法的反应条件较为苛刻，反应过程必须在超低温条件下进行，而且涉及到大量有毒有害的有机溶剂，会带来环境污染等问题。因此，对环境友好的酶法开始成为工业生产的新方向。目前使用两步酶法制备7-ACA在生产成本和环境保护方面有优势，但是从头孢菌素C到7-ACA的转化率与化学法相比要低，而且DAAO催化反应难以控制。头孢菌素C酰化酶(CPC acylase)可以直接把头孢菌素C转变成7-ACA (不经过GL-7-ACA等中间产物)，利用头孢菌素C酰化酶生产7-ACA的一步酶法既具有化学法的优势(高转化率和纯度)也具有两步酶法的优势(高经济性和环境保护)。但是野生型的头孢菌素酰化酶活力较低，不能胜任工业化生产的需要。本发明提供一种高酶活头孢菌素C酰化酶制备方法。
发明内容
本发明目的是提供一种头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因。本发明另一目的是提供头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法。本发明又一目的是提供头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因在制备7-氨基头孢烷酸中的应用。所述头孢菌素C酰化酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO. 4衍生的氨基酸序列。所述头孢菌素C酰化酶突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。与野生型的头孢菌素C酰化酶相比，本发明的头孢菌素C酰化酶突变体具体的氨基酸序列的改变是K171S (第171位赖氨酸变为丝氨酸)，M270W (第270位蛋氨酸变为色氨酸)，I314S (第314位异亮氨酸变为丝氨酸)，L535T (第535位亮氨酸变为苏氨酸)。所述头孢菌素C酰化酶突变体的筛选方法，包括以下步骤(1)由产头孢菌素C酰化酶CPCA假单孢杆菌(Pseudomonas sp. )SE83，扩增CPCA的编码基因adfQ ；(2)采用易错PCR技术，以CPCA的编码基因adfQ为模板，扩增获得CPCA突变体基因；(3)将步骤(2)所得易错PCR产物及表达质粒pET30a用Nde I和Xho I双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB (Kan)平板，即得构建好的重组CPCA基因突变库；(4)将LB (Kan)平板上长出的菌落——对应转入LB (Kan)平板和LB (Kan、IPTG、CPC-Na)平板上，转板后将平板置37 °C恒温培养箱培养，LB (Kan)平板培养8h后取出放入4°C冰箱保存，LB (Kan、IPTG、CPC-Na)平板继续25°C培养36h，然后分别破菌，测定CPCA酶活力，挑选酶活力最强的一株，并测定其基因序列，分别为SEQ ID N0.3所示的基因序列和SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。其中，所述头孢菌素C酰化酶具有SEQ ID NO.1所示的基因序列和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。本发明进一步提供含有所述基因的载体。含有所述基因或所述载体的宿主细胞。本发明的另一方面提供所述头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法，包括以下步骤(I)PCR扩增上述头孢菌素C酰化酶突变体基因；
(2 )将步骤(I)所得PCR产物连接表达载体pET_30b ；(3)连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物。其中，步骤(I)中所用引物为正向引物5'-AAA ( 'A TA / ( i ACGATGGCGGCCA-3'；反向引物5' -AAA CTCGAG TCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3'。其中所述过表达的头孢菌素C酰化酶C-端含有6个组氨酸标签。进一步，采用亲和层析法分离纯化表达产物，分离纯化包括步骤I)以NTA介质填柱，用2倍柱体积的去离子水洗涤，接着加NiS04溶液至NTA介质结合度达到饱和，用5倍柱体积的NAT-O缓冲液(20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5M NaCl)洗柱；2)将含有表达的头孢菌素C酰化酶的大肠杆菌破碎菌体离心后得到的上清加入到Ni2+-NTA树脂柱中，用5倍柱体积的NAT-1缓冲液卿NAT-O缓冲液含有80mmol/L咪唑)洗涤介质以去除杂蛋白，最后用含有300mmol/L咪唑的NAT-O缓冲液洗脱带有6个组氨酸标签的头孢菌素C酰化酶，并做SDS-PAGE分析。本发明的另一方面提供一种7-氨基头孢烷酸的制备方法，其是通过在大肠杆菌中表达头孢菌素C酰化酶基因及其突变体，然后对表达的头孢菌素C酰化酶进行分离纯化，在有底物头孢菌素C的情况下，制备7-ACA。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果本发明利用蛋白质亲和色谱技术，利用带有6个组氨酸标签的头孢菌素C酰化酶能与蛋白纯化树脂N1-NTA层析柱特异性结合的原理，再用含有低浓度的咪唑洗去杂蛋白，保留在N1-NTA层析柱上的6XHis-XK，从而简化6 XHis-XK分离纯化步骤。本发明涉及固定化酶技术，带有6个组氨酸标签的头孢菌素C酰化酶与蛋白纯化树脂N1-NTA层析柱特异性结合，在洗去杂蛋白后，N1-NTA层析柱保留特异性成分一头孢菌素C酰化酶，用此酶制备7-氨基头孢烷酸。
本发明涉及头孢菌素C酰化酶突变体，在使用该突变体转变CPC — >7-ACA酶促反应过程中，转化率达99%，得率达96%，而野生型转化率只有39%，得率只有32%。
图1为PCR技术扩增头孢菌素C酰化酶基因片段，长度2. 3kb ；图2为SDS-PAGE分析纯化前后头孢菌素C酰化酶,①为纯化前②为纯化后；图3为HPLC分析头孢菌素C酰化酶酶促反应；①为头孢菌素酰化酶将头孢菌素C转化为7-氨基头孢烷酸的HPLC图谱；②为头孢菌素CHPLC图谱；③为7-氨基头孢烷酸HPLC图谱。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1头孢菌素C酰化酶基因的获得Wlug假单孢杆菌(Pseudomonas sp. )SE83基因组DNA为PCR反应模板，按SEQID NO.1的序列设计正向引物CPC-F为5' -AAA ('A TA TG ACGATGGCGGCCA-3';反向引物5' -AAA ( TC V iA (/ TCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3'。其中斜体字母部分分别为酶切位点NdeI和XhoI。PCR反应在50 ii L总体积中进行，反应条件为在94°C变性5min后开始循环，然后94°C变性50s，58°C退火lmin，72°C延伸2min，共30个循环后，再于72°C延伸lOmin。取3 y L PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证，结果如图1所示。取IOOy L PCR产物 做琼脂糖凝胶电泳，按照胶回收试剂盒的步骤回收目的片段。实施例2野生型头孢菌素C酰化酶基因表达载体的构建实施例1中PCR产物经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切消化后，与用相同内切酶消化的pET-30a质粒(购自Novagen公司)进行连接反应，构建的载体被称为pET_CPCA，然后用连接产物pET-CPCA混合物转化大肠杆菌DH5-a (购自promega公司)，并进行序列测定提取转化菌体库的质粒，转化大肠杆菌BL (DE3)菌株(购自Novagen公司)。实施例3易错PCR扩增头孢菌素C酰化酶基因利用TaqDNA聚合酶不具有3' -5 /校对功能的性质，在高镁离子浓度(5mmol/L-9mmol/L)和不同浓度dNTP的浓度下(1. 5mmol/L-3. 5mmol/L)，来控制随机突变的频率，向目的基因中引入随机突变，构建突变库。实验中最优的突变率约为0. 6%。易错PCR反应体系(100 ill):
IOxbuffer10f.1l
dATP2p.1
dTTP2pi
dCTP2‘ul
dGTP2^il
MgCl26μl
上游引物4μl
下游引物4μl DNA模板(实施例1PCR片段)4μl
Taq DNA 聚合酶lul
CidH2O63μl
总体积1 OOμlPCR 程序为96°C预变性 4min, 94°C变性 lmin,56°C退火 lmin,75°C延伸 lmin40s,反应45个循环，最后75 °C延伸15min。采用胶回收方法回收PCR产物。取5 产物1%琼脂糖凝胶电泳检验，_20°C保存备用。实施例4突变体的构建实施例3中PCR产物(DNA改组后的混合物)经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切消化后，与用相同内切酶消化的pET-30a质粒进行连接反应，构建的载体被称为pET-CPCAM，然后用连接产物pET-CPCAM混合物转化大肠杆菌DH5-a，构建转化菌体库。实施例5构建表达突变库及高酶活突变体的筛选提取转化菌体库的质粒，分别转化大肠杆菌BL (DE3)菌株，获得转化子约500株，构建表达突变体库。挑取突变菌株至含150 u lLB/kan培养基的96孔板中30°C、150rpm培养，待OD值达0. 6-0. 8，加入IPTG (终浓度0. 2M)，继续培养36h，收集菌体。超声破菌得上清，并进行酶活及蛋白含量测定。检测酶活力最高的菌株，并挑选其克隆，并提取质粒，测定与头孢菌素C酰化酶对应的基因序列。测定的基因序列为SEQ ID NO. 3所示，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO. 4所示。头孢菌素C酰化酶的酶活检测(I)离心收集菌体，用0. lmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)洗涤后低温超声破碎，离心取适量上清液加入100 U I底物头孢菌素C (CPC) (0. lmol/L Tris-HCl缓冲液配制)，并用缓冲液补加至200iil，37°C反应5分钟。(2)终止条件取20 ill反应液，加入500 U I终止液(20%乙酸与0. 05M NaOH)。(3)终止后处理12000rpm离心5min，取500^1溶液加入样品瓶中。(4)HPLC进样条件采用C18柱(4. 6mm*150mm)，柱温30°C，进样体积lOyl，检测吸收峰254nm,进样流量lml/min。进样时间20min。(5)流动相0.1M柠檬酸(每IL加入Ig辛烷磺酸钠)88%:乙腈12%，流速为Iml/min，进样体积为4iU，检测吸光度为254nm，C18柱。(6)酶活单位定义为每分钟催化生成I y mol7-ACA所需的酶量。 表I野生型CPC酰化酶和高酶活CPC酰化酶突变体的酶活
权利要求
1.一种头孢菌素C酰化酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO. 4衍生的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述头孢菌素C酰化酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO. 3所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求2或3所述基因或权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.权利要求1所述的头孢菌素C酰化酶突变体的制备方法，包括以下步骤 (I)PCR扩增权利要求2或3所述头孢菌素C酰化酶突变体基因； (2 )将步骤(I)所得PCR产物连接表达载体pET-30b ； (3)连接产物转入大肠杆菌感受态细胞，获得表达产物。
7.根据权利要求6的制备方法，其特征在于，所用引物为 正向引物5' -AAACATATGACGATGGCGGCCA-3'； 反向引物 5' -AAACTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGATGGGCCGGGACGAGTTCCTGCGAG-3'。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述头孢菌素C酰化酶突变体采用亲和层析法进行分离纯化。
9.权利要求1所述头孢菌素C酰化酶突变体、权利要求2或3所述基因在制备7-氨基头孢烷酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，以头孢菌素C为底物，采用一步酶法制备7-氨基头孢烧酸。
全文摘要
本发明涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体及其编码基因与应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由SEQ ID NO.4衍生的氨基酸序列。本发明的头孢菌素C酰化酶突变体，在使用该突变体转变CPC→7-ACA酶促反应过程中，转化率达99%，得率达96%。
文档编号C12N9/80GK103060298SQ20121059178
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者徐斌, 郑辉, 汪本助 申请人:安徽丰原基因工程技术有限公司