突变型头孢菌素c酰化酶及其制备方法和转化7-aca的方法

专利名称：突变型头孢菌素c酰化酶及其制备方法和转化7-aca的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，特别地，涉及一种突变型头孢菌素C酰化酶，本发明的另一方面还提供了前述突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法和应用。
背景技术：
7_氨基头抱烧酸(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)是医药工业生产半合成头孢菌素抗生素的重要中间体，工业化生产7-ACA主要用化学法和酶法。目前国内7-ACA 生产大多仍采用化学法，但由于该方法需采用大量昂贵的化学试剂、反应条件苛刻、环境污染严重、成本高等缺陷，而酶法生产7-ACA优势明显，工艺简单、反应条件温和、生产环保、 成本低、质量优等特点。化学法技术成熟，进一步上升的空间较小；而酶法技术先进，绿色环保，仍具备较大上升空间。随着国家环保的重视、及对可持续发展的绿色工业追求，酶法取代化学法是必然的趋势。
酶法生产7-ACA可分为两步酶法和一步酶法。目前主要研究及工业化应用的是两步酶法，其过程主要是头孢菌素C钠盐在固定化D-氨基酸氧化酶催化下被氧化成α -酮己二酸单酰7-ACA，α -酮己二酸单酰7-ACA迅速转化为GL-7-ACA，GL-7-ACA在固定化 GL-7-ACA酰化酶催化作用下裂解为7-ACA和戊二酸，再经过结晶和干燥得到7-ACA产品。一步酶法是利用头孢菌素C酰化酶对底物CPC进行直接催化生成7-ACA，相比于两步酶法，一步酶法具有生产工艺简单、设备要求低及生产成本低等优点，但是头孢菌素C酰化酶对CPC 的催化活性低，仅为GL-7-ACA酰化酶的2 4%。
为了提高头孢菌素C酰化酶的催化活性，目前对头孢菌素C酰化酶进行突变的方式主要有以下几个1、取头孢菌素酰化酶基因序列，在270位点引入苯丙氨酸，在215、296、 416、417、261、271、294、297、307、308和309等位点引入突变氨基酸，经密码子优化后克隆入ρΕΤ24，转化入大肠杆菌BL21 (DE3)获得含有头孢菌素酰化酶突变基因的转化子，发酵检测发现在这些位点的突变提高了头孢菌素酰化酶的CPC酰化酶活性。2、将来源于假单胞杆菌Ν176中头孢菌素C酰基转移酶基因(vac)序列，设计出两条适用于顶头孢霉中表达的基因序列(ecsl和ecs2)，利用基因工程技术转化入顶头孢霉获得包含有ecsl或ecs2的转化子，在转化子发酵液中检测到7-ACA转化率为38. 4%。3、、基于来源于假单胞杆菌SE83的 CPC酰化酶基因(acy II)序列，通过分子模拟技术进行理性设计，应用定点突变和饱和突变技术对V121a、G139a、F58 0、175 β、1176 β和S471 β等六个点进行突变，密码子优化后转化入大肠杆菌得到转化子后检测突变效果，V121 a A、G139 a S、F58 β N、175 β Τ、1176 β V 和S471 β C等六倍突变体S12的CPC酰化酶活性最高，高达712U/L，对CPC的转化率也高达 98%。3、基于假单胞杆菌SE83的CPC酰化酶基因(acy II )氨基酸序列，在引入S12的6个突变点的基础上进行了 L677F和A675G双点突变得到突变体CAase_TU2，经密码子优化后克隆入pET28a(+)和pMKC载体，分别转化入BL21 (DE3)和JM105后诱导表达出CPC酰化酶。 4、基于假单胞杆菌SE83头孢菌素酰化酶II基因(acy II )序列，通过密码子优化技术，降低基因序列中的GC含量，获得合成CPC酰化酶基因(sCPCAcy)，其CPC酰化活力高于GL-7-ACA 酰化活力2. 3倍，基于sCPCAcy基因序列，把位于通道处675位点的Ala突变成Gly，克隆入pET28后转入大肠杆菌JM109 (DE3)获得大肠杆菌JM109 (DE3) /pET28_sCPCAcyA675G表达系统，诱导表达后得到CPC酰化酶。前述这些突变方法虽然酶活力有所提高，但是仍然无法满足工业需求，同时得到的突变型头孢菌素C酰化酶容易受7-ACA产物的抑制，使7-ACA 的产率低，转化速率低，酶的活性受外界影响较大。为了满足工业的需求，急需要一种酶活力高，不易受产物抑制，受外界因素影响较小的头孢菌素C酰化酶。发明内容
本发明目的在于提供一种突变型头孢菌素C酰化酶及其制备方法和应用，以解决现有技术中突变型头孢菌素C酰化酶催化活性小，酶活性受外界影响大，存在产物抑制的技术问题。
为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种突变型头孢菌素C酰化酶， 将具有序列表中SEQ ID NO. I的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸位点取代得到的突变氨基酸序列；氨基酸取代位点为288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸中的一个或多个。
进一步地，突变氨基酸序列的编码基因为a'中的一种，
a)具有序列表中SEQ ID NO. 4的基因序列；
b)具有序列表中SEQ ID NO. 6的基因序列；
c)具有序列表中SEQ ID NO. 8的基因序列；
d)在严格条件下可与a、b或c任一项限定的基因序列杂交且编码具有头孢菌素C 酰化酶活性的蛋白质的基因序列；
e)与a、b或c任一项限定的基因序列具有90%以上的同源性且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列。
进一步地，突变氨基酸序列为将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，具有序列表中SEQ IDN0. 3的氨基酸序列ο
进一步地，突变氨基酸序列为将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第417位的组氨酸突变为甘氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 5的氨基酸序列。
进一步地，突变氨基酸序列为将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第296位的组氨酸突变为天然氨基酸和将第417位的组氨酸突变为甘氨酸。
进一步地，第296位的组氨酸为突变为苯丙氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 7的蛋白质序列。本发明的另一方面还提供了一种前述突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法，包括以下步骤
a)将具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列进行定点突变、定点饱和突变或多点突变步骤得到可编码SEQ ID NO. I氨基酸序列的突变基因；
b)将突变基因插入到质粒中得到表达载体；
c)将表达载体转化进入菌株中得到重组菌；
d)将重组菌用1%乳糖诱导进行发酵得到头孢菌素C酰化酶。
进一步地，还包括纯化步骤，纯化步骤为将头孢菌素C酰化酶通过固定化金属亲和层析法进行纯化得到头孢菌素C酰化酶纯酶。
进一步地，质粒为pET28a(+)，菌株为 E. coli BL21(DE3)。
本发明的另一方面还提供了一种由前述头孢菌素C酰化酶转化成7-ACA的方法， 将前述述头孢菌素C酰化酶与CPC-Na底物进行转化反应f 3h，转化温度为2(T25°C，pH为 8. 2 8. 6。
本发明具有以下有益效果
本发明提供的突变型头孢菌素C酰化酶，通过对野生型头孢菌素C酰化酶的第288 位的缬氨酸进行突变可以增加头孢菌素C酰化酶稳定性，对第417位组氨酸位点进行突变， 可以减小组氨酸活性作用区域的空间位阻，对第296为组氨酸位点进行突变可以改变活性作用区域的酸碱性和空间位阻，通过对前述三个位点的突变改变了野生型头孢菌素C酰化酶的生物性能，提高了催化活性高和比活，同时产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制小，受外界影响小，可以迅速的催化CPC转化生成7-ACA。
本发明提供的突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法，将野生型头孢菌素C酰化酶的经过定点突变、定点饱和突变或多点突变，同时采用1%的乳糖对重组菌进行诱导，得到的突变型头孢菌素C酰化酶表达水平更高，结构更稳定，不容易产生其他类型的突变。
本发明提供的转化7-ACA的方法将转化温度确定为2(T25°C，PH确定为8. 2^8. 6， 在60分钟内7-ACA的产率达到98%以上，CPC的残留量仅为1%，7-ACA的产率高，转化速率快。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。 下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。


构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中
图I是本发明优选实施例的重组表达质粒pET28-CPC构建流程图2是本发明优选实施例的SDS-PAGE图谱；
图3是本发明实施例3的反应初始时7-ACA含量的HPLC峰图4是本发明实施例3的反应结束时7-ACA含量的HPLC峰图5是本发明醋酸根离子对对比例I中头孢菌素C酰化酶的影响图
图6是本发明醋酸根离子对实施例3中头孢菌素C酰化酶的影响图
图7是本发明7-ACA产物对对比例I中头孢菌素C酰化酶的影响图
图8是本发明7-ACA产物对实施例3中头孢菌素C酰化酶的影响图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
本发明的一个方面提供了一种突变型头孢菌素C酰化酶，现有的野生型的头孢菌素C酰化酶的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO. I的氨基酸序列，该氨基酸序列的编码基因为序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列。本发明提供的氨基酸序列将具有序列表中SEQ IDNO. I的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸位点取代得到的突变氨基酸序列；氨基酸取代位点为288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸中的一个或多个。由于288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸位于头孢菌素C酰化酶的活性区域影响了头孢菌素C酰化酶的活性，同时在这三个位点上缬氨酸、组氨酸存在产物抑制，导致7-ACA产率低， 转化速率慢。为了提高头孢菌素C酰化酶的活性和7-ACA的转化率，本发明对前述三个位点进行突变，对第288位的缬氨酸进行突变可以增加头孢菌素C酰化酶稳定性，对第417位组氨酸位点进行突变，可以减小组氨酸活性作用区域的空间位阻，对第296为组氨酸位点进行突变可以改变活性作用区域的酸碱性和空间位阻，通过对前述三个位点的突变改变了野生型头孢菌素C酰化酶的生物性能，提高了催化活性高和比活，同时产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制小，可以迅速的催化头孢菌素C直接转化生成7-ACA。
进一步地，突变氨基酸序列的编码基因为a'中的一种，
a)具有序列表中SEQIDN0. 4的基因序列；
b)具有序列表中SEQ IDN0. 6的基因序列；
c)具有序列表中SEQIDN0. 8的基因序列；
d)在严格条件下可与a、b或c任一项限定的基因序列杂交且编码具有头孢菌素C 酰化酶活性的蛋白质的基因序列；
e)与a、b或c任一项限定的基因序列具有90%以上的同源性且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列。
本文中的严格条件可为在I X SSC，O. 1%SDS的溶液中，在60°C条件下杂交并洗膜。
前述突变氨基酸序列的编码基因是序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列进行定点突变，多点突变和定点饱和突变得到的。序列表中SEQ ID NO. 4的基因序列编码序列表中SEQ ID NO. 3的氨基酸序列；序列表中SEQ ID NO. 6的基因序列编码序列表中SEQ ID NO. 5的氨基酸序列；序列表中SEQ ID NO. 8的基因序列编码序列表中SEQ ID NO. 7的氨基酸序列。
进一步地，将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 3的氨基酸序列。氨基酸序列为将活性作用区域的第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸以增加头孢菌素C酰化酶稳定性，使头孢菌素C酰化酶的活性更高。
进一步地，将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第417位的组氨酸突变为甘氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 5的氨基酸序列。本发明将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第417位的组氨酸突变为甘氨酸以减小活性作用区域的空间位阻，使头孢菌素C酰化酶的活性更大，产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制更小。
进一步地，第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第296位的组氨酸突变为天然氨基酸和将第417位的组氨酸突变为甘氨酸。将第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将第417 位的组氨酸突变为甘氨酸，和将第296位的组氨酸突变为天然氨基酸以改变活性作用区域的酸碱性和空间位阻，使头孢菌素C酰化酶的活性更大，产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制更小。
进一步地，将第296位的组氨酸突变为苯丙氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 7的氨基酸序列。使头孢菌素C酰化酶的活性更大，产物对突变型头孢菌素C酰化酶抑制更小。
本发明的另一方面还提供了一种前述突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法，包括以下步骤
a)将具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列进行定点突变、定点饱和突变或多点突变步骤得到具有序列表中SEQ ID NO. 4的基因序列；具有序列表中SEQ ID NO. 6的基因序列；具有序列表中SEQ ID NO. 8的基因序列；在严格条件下可与a、b或c任一项限定的基因序列杂交且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列；与a、b或c任一项限定的基因序列具有90%以上的同源性且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列的突变基因；
b)将突变基因插入到质粒中得到表达载体；
c)将表达载体转化进入菌株中得到重组菌；
d)将重组菌用1%乳糖诱导进行发酵得到头孢菌素酰化酶。
按照本发明的制备方法制得的头孢菌素C酰化酶，野生型头孢菌素C酰化酶的进过定点突变、定点饱和突变或多点突变后，得到的突变型头孢菌素C酰化酶的结构更稳定， 不容易产生其他类型的突变，突变型头孢菌素C酰化酶的活性更高，产量更大。同时本发明采用1%的乳糖对重组菌进行诱导，可以获得最高的CPC-III酶活表达水平；当乳糖浓度在 1%以内时，CPC-III的酶活随乳糖浓度的增大而增大；当乳糖浓度高于1%时，CPC-III的酶活随乳糖浓度的增大而减小。
进一步地，还包括纯化步骤，纯化步骤为将头孢菌素C酰化酶通过固定化金属亲和层析法进行纯化得到头孢菌素C酰化酶纯酶。将头孢菌素C酰化酶进行纯化后，杂质更少，纯度更高。
进一步地，质粒为pET28a(+)，菌株为 E. coli BL21(DE3)。本发明以 pET28a (+)作为重组表达载体，由于pET28a(+)为诱导型表达载体,对突变型的头孢菌素C酰化酶的表达能力更强。基因工程重组菌株为将重组表达载体通过电转化或化学转化的方法导入到大肠杆菌宿主菌中，该大肠杆菌宿主菌具体为E. coli BL21(DE3)或E. coli BL21 (DE3)plys，选择前述的大肠杆菌作为本发明头孢菌素C酰化酶的宿主菌，成本更低，得到的头孢菌素C酰化酶的产量更多。
一种前述头孢菌素C酰化酶转化成7-ACA的方法，将前述头孢菌素C酰化酶与 CPC-Na底物进行转化反应f 3h，转化温度为2(T25°C，pH为8. 2^8. 6。当pH值、底物浓度和酶量一定时，温度低于20°C，转化反应时间随温度降低呈现明显延长趋势；当温度高于 25°C，转化温度越高，则CPC的降解速度越快，当时7-ACA的降解速度呈现加快趋势，导致 7-ACA的产率随温度升高而降低。当温度、底物浓度和酶量一定时，pH低于8. 2，CPC转化率随pH降低呈明显的下降趋势，反应时间也呈延长趋势；pH高于8. 6，CPC、7-ACA的降解速度随PH升高呈加快趋势，7-ACA的产率随pH升高而降低。本发明的转化温度为2(T25°C，PH 为8. 2^8. 6，转化反应速度最快，7-ACA的产率最高。
实施例
下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法。引物为上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列测序为华大基因完成。大肠杆菌宿主菌为E. coli BL21 (DE3)购于Merck公司，大肠杆菌宿主菌还可以是E. coli BL21 (DE3)plys,购于天根公司。全自动电位滴定仪购于瑞士万通公司，型号为8系列。全自动电位滴定仪购于梅特勒-托利多公司，其余材料均为市售。
本发明人根据大肠杆菌密码子简并性及偏爱性对来源于假单胞菌N176编码头孢菌素C酰化酶的基因(CPCA)进行优化并合成。图I为重组表达质粒pET28-CPC构建流程图。
实施例f 4的野生型头孢菌素C酰化酶编码基因的获得、野生型头孢菌素C酰化酶载体的构建及基因工程菌的构建、头孢菌素C酰化酶酶活力的检测按照下述方法进行。
I、野生型头孢菌素C酰化酶编码基因的获得
将来源于假单胞菌N176的头孢菌素C酰化酶的氨基酸序列SEQ ID NO. 1，根据大肠杆菌密码子简并性及偏爱性对该氨基酸序列进行反向设计得到头孢菌素C酰化酶编码 DNA序列，同时在该DNA序列的N端和C端分别加上Hind III和EcoR I酶切位点得到优化好的DNA序列。将优化好的DNA序列进行全基因合成得到具有氨基酸序列表SEQ ID NO. 2 的基因序列。
2、野生型头孢菌素C酰化酶载体的构建及基因工程菌的构建
将具有氨基酸序列表SEQ ID NO. 2的基因序列与载体pUC57分别进行Hind III 和EcoR I双酶切，切胶回收后，将回收产物进行按照3 1的比例进行混合，加入T41igase 于16°C过夜连接。将连接产物5μ I转入50μ I的ToplO’感受态中，涂布于含50yg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板中进行蓝白斑筛选。挑取白色单菌落进行扩培并提取质粒，将质粒与表达载体pET28a(+)分别进行Hind III和EcoR I双酶切，然后电泳并将目的条带切胶纯化回收，将回收后的质粒与载体以3 1的比例混合，加入T41igase于16°C过夜连接构建表达载体PET28-CPCA，其表达蛋白命名为N176-CPC。
将5μ I的N176-CPC转入50 μ I的ToplO’感受态中，涂布于含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证，将阳性克隆接种于含 50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基进行扩培，提取质粒进行Hind III和EcoR I双酶切验证，将验证完的质粒进行基因测序。测序完成后，将与野生型头孢菌素C酰化酶基因相同的质粒1μ I转入50 μ I的BL21(DE3)感受态中。
3、头孢菌素C酰化酶酶活力的检测
(I)滴定法
原理头孢菌素C在头孢菌素C酰化酶作用下转化成7-ACA和氨基己二酸，用NaOH 溶液中和氨基己二酸，根据NaOH的消耗量计算CPC酰化酶活力。
具体操作方法在I. 5ml离心管中预先加入玻璃珠，当玻璃珠达到离心管刻度 I. Oml处停止，精确量取O. 5ml实施例f 3中的突变型头孢菌素C酰化酶于离心管中，在振荡频率为1500/min的MS3振荡器上振荡IOmin后，将样品连同玻璃珠一起，加至已装有预热至25°C的30ml的l%CPC_Na底物溶液的反应器中，调节水浴恒温25°C，用O. lmol/L的氢氧化钠滴定液调PH至8. 00时开始计时，保持pH为8. 00的条件搅拌反应5分钟，用全自动电位滴定仪检测氢氧化钠滴定液的消耗量。滴定法中酶活力的计算公式为
vNaOIl K ^NaOIl '膽0 251酶活力= 1 X(F样或 ％.:)^ (u/ml 成 u/gh
其中VNaQH :氢氧化钠滴定液的消耗量，ml ο
CNa0H :氢氧化钠滴定液的摩尔浓度为0. lmol/L。
T :反应时间，min。8
V样酶液样品体积，ml。
W样固定化酶样品重量，go
1000:由 mmol 转为 ymol。
酶活力单位(U)定义为在25°C，pH8. O条件下，在Imin内催化底物头孢菌素C生成I μ mol氨基己二酸时所需的酶量为IU。
(2)高效液相色谱(HPLC)法
精确量取20 μ I的实施例f 3中的突变型头孢菌素C酰化酶进行离心过滤取上清液。将上清液与含有3% (W/V)的头孢菌素C的0.02mol/L、pH8.00磷酸盐缓冲液混合至终体积200 μ 1，得到反应初始时体系。将反应初始时体系在25V反应IOmin后，加入200 μ I 的40%的冰醋酸终止反应，得反应结束时体系。将反应初始时体系和反应结束时体系分别进行HPLC分析。
溶样相配制称取I. 542g乙酸铵加950ml超纯水溶解后，用3mol/L的氨水调pH 至7. O, O. 45 μ m水系滤膜过滤,混合均匀后备用。
流动相配制称取I. 542g乙酸铵加965ml超纯水溶解后，用3mol/L的氨水调pH 至7. 0,0. 45 μ m水系滤膜过滤,加入50ml色谱纯的乙腈,混合均勻后脱气30min。
检测波长254nm。
柱子类型BDSC18200mmX4. 6mm。
总流速1.Oml/min。
进样量20μ I。
酶活力单位(U)定义为在25°C，pH8. O条件下，在Imin内催化底物头孢菌素C生成I μ mol产物7-ACA的所需的酶量为1U。
实施例I
a)以含野生型头孢菌素C酰化酶表达载体PET28-CPCA克隆菌株ToplO’菌株中提取的质粒为突变模板，提取的质粒具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列。根据提取质粒的基因序列设计突变引物，在反向PCR反应体系中反向PCR进行288位点的定点突变，首先在95°C下预变性5min，然后在94°C下变性30S，在60°C下退火Imin，在72°C下延伸8min， 重复变性、退火、延伸18次，最后72°C延伸IOmin得到PCR产物。反向PCR反应体系的制备方法为将5 μ I的10*pfxbuffer，I μ I的正向引物，I μ I的反向引物，I μ I的Mg2+，I μ I的模板 DNA, 10 μ I 的 5*Enhancer Buffer, 2 μ I 的 dNTPs，O. 5 μ I 的酶活力为 2. 5U/ μ I 的 pfx 高保真DNA聚合酶，加无菌去离子水定容至50 μ I。该单点突变为V288M，该定点突变正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 9的基因序列；反向引物具有序列表中SEQ IDN0. 10的基因序列。
将PCR产物进行纯化，将25 μ I纯化后的PCR产物，2 μ I的DPN I快速酶，3 μ I的 10*Buffer混合，在37°C温育30min，然后后置于80°C热水中5min使DPNI快速酶失活得到突变基因。
b)将突变基因放置于冰上Ih进行自身环化，然后将环化的突变基因转入大肠杆菌ToplO’感受态细胞中，涂布于含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证获得阳性克隆。将阳性克隆接种于含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基进行扩培得到扩培产物。提取扩培产物中的质粒进行Hind III和EcoR I双酶切验证，将验证完的质粒进行基因测序选出基因序列正确的表达载体。该表达载体命名为PET28-CPCAI，其表达蛋白即单倍突变体，命名为CPC-I。
c)将CPC-I通过化学转化法转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中，并涂布于含 50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养得到含野生型或突变型头孢菌素 C酰化酶载体的重组菌。
d)挑取重组菌中的单菌落接种于含浓度为50 μ g/ml硫酸卡那霉素的20ml的LB 液体培养基中进行扩培，于37°C培养8h得到扩培产物。将扩培产物以5%的接种量接种于 IOOml的TB培养基中进行发酵培养，先在37°C中发酵6h，再加入1%的乳糖并降温至25°C 进行乳糖诱导培养14h得到头孢菌素酰化酶发酵液。
e)将头孢菌素酰化酶发酵液于12，OOOrmp，4°C离心得到菌体，在菌体中加入IOml 温度为4°C的无菌生理盐水进行悬浮得到菌悬液，将菌悬液并用超声波破碎法破碎细胞，离心取上清液。将上清液上样至已活化并结合Ni+的IDA树脂上，用梯度浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统(Bio-Rad)进行实时监控，当计算机中出现目的蛋白峰时，开始收集头孢菌素酰化纯酶直到该峰消失为止。
实施例2
a)以含野生型头孢菌素C酰化酶表达载体PET28-CPCA I克隆菌株ToplO’菌株中提取的质粒为突变1旲板，提取的质粒具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列。根据提取质粒的基因序列设计突变引物，在反向PCR反应体系中反向PCR反应，基于288位点突变再次进行417位点的定点突变，首先在95°C下预变性5min，然后在94°C下变性30S，在60°C下退火lmin，在72°C下延伸8min，重复变性、退火、延伸18次，最后72°C延伸IOmin得到PCR 产物。反向PCR反应体系的制备方法为将5μ I的10*pfx buffer，ly I的正向引物，1μ I 的反向引物，I P I 的 Mg2+, I μ I 的模板 DNA, 10 μ I 的 5*Enhancer Buffer, 2 μ I 的 dNTPs, 0. 5μ I的酶活力为2. 5U/y I的pfx高保真DNA聚合酶，加无菌去离子水定容至至50 μ I。 该单点突变为V288M、H417G，该定点突变正向引物具有序列表中SEQ ID NO. 11的基因序列； 反向引物具有序列表中SEQ IDN0. 12的基因序列。
将PCR产物进行纯化，将25 μ I纯化后的PCR产物，2 μ I的DPN I快速酶，3 μ I的 10*Buffer混合，在37°C温育30min，然后后置于80°C热水中5min使DPNI快速酶失活得到突变基因。
b)将突变基因放置于冰上Ih进行自身环化，然后将环化的突变基因转入大肠杆菌ToplO’感受态细胞中，涂布于含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证获得阳性克隆。将阳性克隆接种于含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基进行扩培得到扩培产物。提取扩培产物中的质粒进行Hind III和 EcoR I双酶切验证，将验证完的质粒进行基因测序选出基因序列正确的表达载体。该表达载体命名为PET28-CPCAII，其表达蛋白即双倍突变体命名为CPC-II。
c)将CPC-II通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含 50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养得到含野生型或突变型头孢菌素 C酰化酶载体的重组菌。
d)挑取重组菌中的单菌落接种于含浓度为50 μ g/ml硫酸卡那霉素的20ml的LB 液体培养基中进行扩培，于37°C培养8h得到扩培产物。将扩培产物以5%的接种量接种于IOOml的TB培养基中进行发酵培养，先在37°C中发酵6h，再加入1%的乳糖并降温至25°C 进行乳糖诱导培养14h得到头孢菌素酰化酶。
e)将头孢菌素酰化酶发酵液于12，000rmp，4°C离心得到菌体，在菌体中加入IOml 温度为4°C的无菌生理盐水进行悬浮得到菌悬液，将菌悬液并用超声波破碎法破碎细胞，离心取上清液。将上清液上样至已活化并结合Ni+的IDA树脂上，用梯度浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统(Bio-Rad)进行实时监控，当计算机中出现目的蛋白峰时，开始收集头孢菌素酰化纯酶直到该峰消失为止。
实施例3
a)以含野生型头孢菌素C酰化酶表达载体pET28-CPCAII克隆菌株ToplO’菌株中提取的质粒为突变1旲板，提取的质粒具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列。根据提取质粒的基因序列设计突变引物，在反向PCR反应体系中反向PCR进行第288、417和296位点的定点饱和突变，首先在95°C下预变性5min，然后在94°C下变性30S，在60°C下退火lmin， 在72°C下延伸8min，重复变性、退火、延伸18次，最后72°C延伸IOmin得到PCR产物。反向 PCR反应体系的制备方法为将5μ I的10*pfxbuffer，I μ I的正向引物，1μ I的反向引物， I μ I 的 Mg2+, I μ I 的模板 DNA，10 μ I 的 5*Enhancer Buffer, 2 μ I 的 dNTPs, O. 5 μ I 的酶活力为2. 5U/y I的pfx高保真DNA聚合酶，加无菌去离子水定容至至50 μ I。该三点点突变为V288M、H417G，H296X(其中X为任意氨基酸)，该定点饱和突变正向引物具有序列表中 SEQ ID NO. 13的基因序列；反向引物具有序列表中SEQ IDN0. 14的基因序列。
将PCR产物进行纯化，将25 μ I纯化后的PCR产物，2 μ I的DPN I快速酶，3 μ I的 IO^Buffer混合，在37°C温育30min，然后后置于80°C热水中5min使DPNI快速酶失活得到突变基因。
b)将突变基因放置于冰上Ih进行自身环化，然后将环化的突变基因转入大肠杆菌ToplO’感受态细胞中，涂布于含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养。挑取单菌落进行菌落PCR验证获得阳性克隆。将阳性克隆接种于含50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基进行扩培得到扩培产物。提取扩培产物中的质粒进行Hind III和 EcoR I双酶切验证，将验证完的质粒进行基因测序选出基因序列正确的表达载体。该表达载体命名为PET28-CPCAIII，其表达蛋白即三倍突变体命名为CPC-III。
c)将CPC-II通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含 50 μ g/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中平板进行过夜培养得到含野生型或突变型头孢菌素 C酰化酶载体的重组菌。
d)挑取重组菌中的单菌落接种于含浓度为50 μ g/ml硫酸卡那霉素的20ml的LB 液体培养基中进行扩培，于37°C培养8h得到扩培产物。将扩培产物以5%的接种量接种于 IOOml的TB培养基中进行发酵培养，先在37°C中发酵6h，再加入1%的乳糖并降温至25°C 进行乳糖诱导培养14h得到头孢菌素酰化酶。
e)将头孢菌素酰化酶发酵液于12，000rmp，4°C离心得到菌体，在菌体中加入IOml 温度为4°C的无菌生理盐水进行悬浮得到菌悬液，将菌悬液并用超声波破碎法破碎细胞，离心取上清液。将上清液上样至已活化并结合Ni+的IDA树脂上，用梯度浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统(Bio-Rad)进行实时监控，当计算机中出现目的蛋白峰时，开始收集头孢菌素酰化纯酶直到该峰消失为止。
对比例I
将野生型头孢菌素酰化酶按照实施例3的方法进行纯化步骤得到野生型头孢菌素酰化纯酶，命名为N176-CPC。
对比例2
将具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列，在288位点进行定点突变，将第288位点的缬氨酸突变为苯丙氨酸，其余步骤均与实施例I相同得到多倍突变体，命名为CPC-IV。
对比例3
将具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列，在296位点进行定点突变，将第296位点的组氨酸突变为丝氨酸，其余步骤均与实施例I相同得到多倍突变体，命名为CPC-V。
对比例4
将具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列，在417位点进行定点突变，将第417位点的组氨酸突变为甲硫氨酸，其余步骤均与实施例I相同得到多倍突变体，命名为CPC-VI。
对比例5
将具有序列表中SEQ ID NO. 2 的基因序列，在 270、215、296、416、417、261、271、 294、297、307、308和309等位点进行定点饱和突变，其余步骤均与实施例3相同得到多倍突变体，命名为CPC-VII。
对比例6
将具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列，在V121 a、G139 a、F58 β、175 β、 1176 β和S471 β等位点进行定点饱和突变，其余步骤均与实施例3相同得到多倍突变体， 命名为CPC-VIII。
对比例7
将具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列，在L677F和A675G位点进行双点突变， 其余步骤均与实施例3相同得到多倍突变体，命名为CPC-IX。
对比例8
将具有序列表中SEQ ID NO. 2的基因序列通过密码子优化技术降低基因序列中的 GC含量获得合成CPC酰化酶基因(sCPCAcy);基于sCPCAcy基因序列，把位于通道处675位点的Ala突变成Gly，其余步骤均与实施例3相同得到多倍突变体，命名为CPC-X。
头孢菌素酰化酶纯度检测将实施例I的头孢菌素酰化纯酶CPC-I进行SDS-PAGE 检测，图2为头孢菌素酰化纯酶的SDS-PAGE检测结果，其中M为标准蛋白分子量；1为发酵液菌体经破碎离心后的上清总蛋白，即粗酶样品；2为经固定化金属亲合层析后的头孢菌素C酰化酶纯酶样品。从图2中可知，未进过纯化的头孢菌素酰化酶其杂质较多，而经过纯化的头孢菌素酰化酶的样品中发现有2条非常单一的条带，其中α亚基和β亚基的大小分别为22KD和58KD。证明按照本发明的纯化方法得到的头孢菌素酰化酶的纯度明显提闻。
乳糖浓度梯度诱导实验将实施例3的突变体酶CPC-III做了乳糖浓度梯度诱导实验，乳糖浓度梯度(W/V)为O. 1%、0· 2%、0· 5%、1%、1· 5%和2%，其结果列于表I中。
表I实施例3的乳糖诱导实验结果表
权利要求
1.一种突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，将具有序列表中SEQ ID NO. I所述的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸位点取代得到的突变氨基酸序列；所述氨基酸取代位点为288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸中的一个或多个。
2.根据权利要求I所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突变氨基酸序列的编码基因为a e中的一种， a)具有序列表中SEQID NO. 4所述的基因序列； b)具有序列表中SEQID NO. 6所述的基因序列； c)具有序列表中SEQID NO. 8所述的基因序列； d)在严格条件下可与所述a、b或c任一项限定的基因序列杂交且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列； e)与所述a、b或c任一项限定的基因序列具有90%以上的同源性且编码具有头孢菌素C酰化酶活性的蛋白质的基因序列。
3.根据权利要求I所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突变氨基酸序列为将所述第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列。
4.根据权利要求I所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突变氨基酸序列为将所述第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将所述第417位的组氨酸突变为甘氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 5所述的氨基酸序列。
5.根据权利要求I所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述突变氨基酸序列为将所述第288位的缬氨酸突变为甲硫氨酸，将所述第296位的组氨酸突变为天然氨基酸和将所述第417位的组氨酸突变为甘氨酸。
6.根据权利要求5所述的突变型头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述第296位的组氨酸为突变为苯丙氨酸，具有序列表中SEQ ID NO. 7所述的蛋白质序列。
7.—种权利要求I至6中任意一项所述突变型头孢菌素C酰化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 a)将所述具有序列表中SEQID NO. 2所述的基因序列进行定点突变、定点饱和突变或多点突变步骤得到可编码SEQ ID NO. I所述氨基酸序列的突变基因； b)将所述突变基因插入到质粒中得到表达载体； c)将所述表达载体转化进入菌株中得到重组菌； d)将所述重组菌用1%乳糖诱导进行发酵得到头孢菌素C酰化酶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括纯化步骤，所述纯化步骤为将所述头孢菌素C酰化酶通过固定化金属亲和层析法进行纯化得到头孢菌素C酰化酶纯酶。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述质粒为pET28a(+)，所述菌株为E. coliBL21(DE3)。
10.一种头孢菌素C酰化酶转化成7-ACA的方法，其特征在于，将权利要求Γ6任意一项所述头孢菌素C酰化酶与CPC-Na底物进行转化反应l 3h，所述转化温度为2(T25°C，pH为 8. 2 8. 6。
全文摘要
本发明提供了一种突变型头孢菌素C酰化酶，将具有序列表中SEQ ID NO.1的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸位点取代得到的突变氨基酸序列；氨基酸取代位点为288位的缬氨酸、296位的组氨酸和417位的组氨酸中的一个或多个。解决了现有技术中突变型头孢菌素C酰化酶催化活性小，酶活性受外界影响大，存在产物抑制的技术问题。
文档编号C12P35/02GK102978192SQ20121056854
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者许岗, 黄斌, 曾红宇 申请人:湖南福来格生物技术有限公司