专利名称：测定血清中氨含量的液体单体试剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测氨含量的试剂，尤其涉及测定血清中氨含量的单体试剂，本发明进一步涉及该单体试剂的制备方法及其在检测血清中氨含量的应用，属于血清中氨含量的检测领域.
背景技术：
正常人体内游离血氨含量极低，正常值是(10-47) iimol/L。血氨按其来源可分为内源性氨和外源性氨。内源性氨主要来源于体内蛋白质在代谢过程中产生的氨基酸以及经脱氨作用分解而来的氨，外源性氨主要来源于蛋白质类食物在肠道内的细菌分解。肝脏是主要参与除氨的器官，因此，发生氨代谢障碍性疾病，如肝性昏迷、肝性脑病、重型肝炎、尿毒症等，由于氨不能正常代谢排出体外而引起血氨升高；高血氨含量有神经毒性，血氨的测定对于肝硬化门脉高压、肝昏迷、Reye's综合症及儿科的一些先天性代谢紊乱等病的诊断、观察和预后诊断有重要意义。测定血清中氨含量的实验方法通常有微量扩散法、比色法、离子交换法、氨电极法和酶法等。谷氨酸脱氢酶法较其他方法操作简便，适用于自动生化分析仪，其反应原理是氨在谷氨酸脱氢酶的作用下与a -KG和NADH反应，生成L-谷氨酸和NAD+，通过监测NADH的下降速率，与同样处理的校准液比较，可计算出血清中氨的含量。应用于临床诊断的AMM试剂盒多为谷氨酸脱氢酶法，存在单、双、三试剂等多种液体剂型及干片制剂。试剂盒的主要难点是试剂的稳定性，尤其是NADH的稳定性问题。NADH作为常用的还原性辅酶，在340nm有最强吸收峰，在体外诊断试剂中常被作为色原。但它在水溶液中不稳定，容易发生氧化还原反应，从而使试剂效期变短，难于在医院推广使用。血氨干片制剂很好地解决了液体剂型稳定性差的缺点，但试剂制备时需要冻干过程，应用时需要复溶过程，较为繁琐，也增加了试剂成本。申请号为200610030784. 8的中国发明专利公开了一种还原性辅酶复合稳定剂，涉及到缓冲液、稳定剂、有机溶剂、螯合剂、防腐剂和无机盐等复合稳定剂，对还原性辅酶NADH和NADPH具有高度稳定性；申请号为00111788. 2的中国发明专利公开了可稳定还原性辅酶I和还原性辅酶II的试剂，加入金属离子螯合剂，可在更宽PH值条件下，阻止NADH和NADPH的氧化。但在血氨检测的液体试剂尤其是单试剂中，单靠这些稳定剂的加入并不能保证水溶液中NADH或NADPH长时间(至少18个月)的稳定，难于在各大医院推广使用。申请号为200410043900.0的中国发明专利申请公开了一种酶法测定血氨的干粉试剂，稳定期达两 年；申请号为200410041963. 2的中国发明专利申请公开了一种液体试剂，采用不同的酶反应原理，但并未涉及到试剂的有效期。因此目前缺乏一种保存效期长的血氨检测液体单试剂
发明内容
本发明的主要目的是提供稳定性好、保存效期长的血氨检测液体单试剂；本发明的另一目的是提供一种制备所述血氨检测液体单试剂的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种血氨检测液体单试剂，包括缓冲液、谷氨酸脱氢酶、a -酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、稳定剂。血氨测定是NADH的降反应，谷氨酸脱氢酶控制此主反应的反应速度；应用谷氨酸脱氢酶反应系统，将还原性辅酶(NADH)氧化成氧化性辅酶(NAD+)，通过测定还原性辅酶在主波340nm下的下降率直接反应血氨含量。因还原性辅酶在溶液中稳定性不好，易被氧化成NAD+，导致试剂空白吸光度下降较快，效期变短，难于在临床上推广使用；有鉴如此，·本发明在血氨检测单试剂中引入NADH再生系统，使单体试剂中被氧化的NAD+再次转化为NADH，通过调节谷氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的酶活比例及反应时间，可使此再生反应不影响主反应进行，试剂测值准确，并能保持长时间的稳定。再生系统中葡萄糖脱氢酶的酶促反应会导致NADH浓度的升高，且葡萄糖脱氢酶对谷氨酸脱氢酶具有一定的抑制作用，因此不合适的酶比例会影响检测结果，控制两种酶的浓度比例是制备出测值准确且稳定性好的试剂的关键。本发明通过大量的试验最终确定，当单体试剂中谷氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶的酶活比例在3-3000 1的范围内，能够有效确保还原性辅酶在溶液中稳定性，进而保证最终测定结果的准确性。为了达到更好的技术效果，每I升单体试剂中各组分的用量或浓度优选为缓冲液50-200禮、谷氨酸脱氢酶500-40000 10-酮戊二酸2-30禮、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)O. 1-0.4 mM、葡萄糖1-500 mM、葡萄糖脱氢酶5-1000 U、稳定剂占单体试剂总体积的0. 05-5% ;余量为蒸馏水。所述缓冲液包括但不仅限于三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、3_(环己胺)-2_羟基-1-丙磺酸(CAPSO)缓冲液、3-(环己胺基)丙磺酸(CAPS)缓冲液、吗啉代丙烷磺酸(MOPS)缓冲液或N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液中的至少一种；所述缓冲液的浓度优选为50-200mM ;所述缓冲液的pH优选为7. 0-11. 0，更优选为8. 0-9. 6。本发明单体试剂中所述稳定剂包括但不限于牛血清白蛋白、乙二醇、甘油、EDTA钠/钾盐或TritonX-1OO中的任意一种或多种。本发明的另一目的是提供一种制备所述血氨检测液体单试剂的方法，包括以下步骤将缓冲液、谷氨酸脱氢酶、a-酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂溶解于蒸馏水中，其中，每I升单体试剂中各组分的用量或浓度控制为缓冲液50-200mM、谷氨酸脱氢酶500-40000 U、a -酮戊二酸2_30禮、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)O. 1-0.4 mM、葡萄糖1-500 mM、葡萄糖脱氢酶5-1000 U、稳定剂占单体试剂总体积的0. 05-5% ;余量为蒸馏水。本发明的另一目的是提供了一种应用所述血氨检测液体单试剂检测血清中血氨含量的方法，包括将待检测样品加入到血氨检测液体单试剂进行反应；将反应物置于紫外/可见分光光度计或半、全自动生化分析仪上，检测340nm波长下吸光度的下降，计算血
氨含量。其中待检测样品与血氨检测液体单试剂比例在1/100-1/10之间；所述的反应时间优选为1-20分钟，可在20-45°C范围内检测，最优温度为37°C。例如在奥林巴斯AU400全自动生化仪上，设定参数为样本与试剂比例为20:200，主波340nm，副波410nm，反应方向为降反应，读点设为1-10点，方法学为终点法。37°C和42°C加速破坏试验和临床相关性试验表明，本发明所制备的血氨液体单试剂稳定性良好，解决了冻干剂需要冻干和复溶的繁琐问题，可现配现用，(2-8) °C可稳定18个月，测值准确，适用于手动、半自动、自动检测系统，易于在各大医院推广使用。从临床相关性曲线可以看出，本发明所制备的血氨液体单试剂与Dialab试剂测值相关性良好，因此本发明所制备的血氨测定液体单试剂稳定，测值准确度高。
图1本发明实施例1所制备的血氨液体单试剂与Dialab试剂的临床相关性曲线。图2本发明实施例2所制备的血氨液体单试剂与Dialab试剂的临床相关性曲线。图3本发明实施例3所制备的血氨液体单试剂与Dialab试剂的临床相关性曲线。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1血氨检测液体单试剂的制备将Tris缓冲液、谷氨酸脱氢酶、a _酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂TritonX-1OO溶解于蒸馏水中；每I升单体试剂中各组分的用量或浓度为表I所示。表I
[SS
Tris 缓冲液(pH8. 5)50mM
a -酮戊二酸20mM
NADH0.25mM
葡萄糖5mM
谷氨酸脱氢酶8000U
葡萄糖脱氢酶200U
牛血清白蛋白0%
权利要求
1.一种测定血清中氨含量的液体单试剂，其特征在于，包括缓冲液、谷氨酸脱氢酶、 α -酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂。
2.按照权利要求1所述的液体单试剂，其特征在于谷氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶的酶活比例为3-3000 :1。
3.按照权利要求1所述的液体单试剂，其特征在于，每I升单体试剂中各组分的用量或浓度为缓冲液50-200mM、谷氨酸脱氢酶500-40000 U、α -酮戊二酸2_30禮、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸O. 1-0.4 mM、葡萄糖1-500 mM、葡萄糖脱氢酶5-1000 U、稳定剂占单体试剂总体积的O. 05-5% ;余量为蒸馏水。
4.按照权利要求1或3所述的液体单试剂，其特征在于所述缓冲液包括但不仅限于三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、3-(环己胺基)丙磺酸缓冲液、吗啉代丙烷磺酸缓冲液或N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸缓冲液中的任意一种或多种。
5.按照权利要求5所述的液体单试剂，其特征在于所述缓冲液的浓度为50-200mM。
6.按照权利要求4或5所述的液体单试剂，其特征在于所述缓冲液的pH为7.0-11.0， 优选为8. 0-9. 6。
7.按照权利要求1或3所述的液体单试剂，其特征在于所述稳定剂包括但不限于牛血清白蛋白、乙二醇、甘油、EDTA钠/钾盐或TritonX-1OO中的任意一种或多种。
8.一种制备权利要求1-3任何一项所述液体单试剂的方法，包括以下步骤将缓冲液、 谷氨酸脱氢酶、α -酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂溶解于蒸馏水中，即得。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于每I升单体试剂中各组分的用量或浓度控制为缓冲液50-200mM、谷氨酸脱氢酶500-40000 U、α -酮戊二酸2_30禮、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸O. 1-0.4 mM、葡萄糖1-500 mM、葡萄糖脱氢酶5-1000 U、稳定剂占单体试剂总体积的O. 05-5% ;余量为蒸馏水。
10.权利要求1-3任何一项所述液体单试剂在制备检测血清中氨含量试剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了测定血清中氨含量的液体单体试剂及其制备方法和应用。本发明单体试剂包括缓冲液、谷氨酸脱氢酶、α-酮戊二酸、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和稳定剂,其中,谷氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶的酶活比例为3-30001。37℃和42℃加速破坏试验表明，本发明血氨液体单试剂稳定性良好，解决了冻干剂需要冻干和复溶的繁琐问题，可现配现用，2-8℃可稳定18个月；临床相关性试验表明，本发明血氨测定单试剂稳定，测值准确度高，适用于手动、半自动、自动检测系统，易于在各大医院推广使用。
文档编号C12Q1/32GK102994612SQ20121056862
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者不公告发明人 申请人:北京利德曼生化股份有限公司