专利名称：分泌型高产戊二酰－7－氨基头孢烷酸酰化酶的新菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及头孢菌素酰化酶，尤其是关于一种重组戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶基因和含有该基因的重组表达质粒以及该基因在大肠杆菌中的分泌表达。
7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid，7-ACA)是医药工业合成大多数头孢菌素衍生物的起始原料。7-ACA可以通过发酵产物头孢菌索C(cephalosporin C，CPC)的化学去氨酰化得到。由于化学方法诸如亚胺醚和亚硝酰氯法包括多个造价昂贵的步骤，所以人们一直试图探索用酶法来解决这个问题[Vandamme E J，Voets J P.Adv Appl Micrbiol，1974，17311]。目前已经发现两类头孢菌素酰化酶(cephalosporin acylase，CA)，分别为戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶(glutaryl-7-ACA acylase，GL-7ACA酰化酶)和头孢菌素C酰化酶(cephalosporin C acylase，CPC酰化酶)，它们分别催化GL-7ACA和CPC的水解反应，又因为CPC可以在D-氨基酸氧化酶催化下(D-AAO)很容易地生成GL-7ACA[Isogai T et al J Biochem，1990，1081063]。所以GL-7ACA酰化酶和CPC酰化酶一样，在酶法合成7-ACA上具有重要的应用价值(见图1)。
根据已有的报道，现已有10个头孢菌素酰化酶的基因被克隆[见MatsudaA，Komatsu KI.JBacteriol，1985，1631222；Yang Y et al.Chin JBiotech，1991，799；Ishii Y et al.JFerment Bioeng，1994，77591；Matsuda A et al，JBacteriol，1987，1695815；Matsuda A et al.JBacteriol，1987，1695821；Ishiye M，Niwa M.Biochim Biophys Acta，1992，1132233；Aramori I et al.，J Ferment Bioeng，1991，72232；Aramori I et al.J Bacteriol，1991，1737848]。杨蕴刘等从假单胞菌中克隆到GL-7-ACA酰化酶的基因[YangY et al.JBacteriol，1991，799]，并测定了其全序列。该酰化酶与GK16酰化酶[MatsudaA，Komatsu K I.J Bacteriol，1985，1631222]和C430酰化酶[Ishii Y et al.JFerment Bioeng，1994，77591]很相似，这三个酶基因具有95％左右的同源性。酶分子量均为70千道尔顿，由两个亚基组成，β-亚基分子量为54千道尔顿、α-基为16千道尔顿；它们最引人注目的特点是在很宽的pH值范围内(pH6.5-9.0)对GL-7ACA都有很高的水解活力；这一点在工业生产上是十分有利的，因为GL-7ACA水解过程中生成戊二酸，反应液的pH值变化较大。
GK16酰化酶基因最先被一家日本公司克隆[Tsuzuki K et al.NipponNougeikagaku Kaishi，1989，631847]，但是该基因只有公开报道的α-亚基的全部序列和β-亚基的部分序列。随后日本另一家公司克隆了C430酰化酶基因，并公开发表了全基因序列[Ishii Y et al.J Ferment Bioeng，1994，77591]。由于酶基因在假单胞菌中表达量极低，这两家日本公司都对酶基因在大肠杆菌中进行了不同程度的高表达工作，得到的高表达菌株产酶量比原宿主菌(假单胞菌)高出许多倍。杨蕴刘等从假单胞菌克隆的酰化酶基因片段约为3.5kb(kb表示DNA的长度为1000个碱基对)，该基因在假单胞菌中表达极低，即使在大肠杆菌中表达量也很低，粗抽液比活力仅为每毫克蛋白0.42单位(0.42u/mg)[周宏伟等.微生物学报，1997，37196]，需要经过复杂的五步才能纯化。李勇等采用基因工程方法改造此酶基因，改造后的基因在大肠杆菌中得到高表达，菌株产酶量达到每克湿菌2040单位酶，粗抽液酰化酶比活力为每毫克蛋白3.5单位，而且粗抽液经过简单的两步层析柱纯化后比活力就已达到每毫克蛋白12单位[Yong Li et al.ProteinExpression and Purification，1998，12233-238]。
但以上高表达基因的方法都采用了非分泌型的表达菌株，不可避免的要涉及到酶的分离纯化以及固定化酶等一系列生产上难以应付的问题，其结果是对技术、仪器设备要求很高，使生产成本大大提高。为此，陈剑峰等借助Pseudomonas sp.130表达元件以及信号肽构建了GL-7ACA的分泌型表达质粒pTrcCAlS和pKKCAlS，该表达元件介导GL-7ACA酰化酶基因在大肠杆菌中获得了高表达，表达产物在信号肽的引导下被转运到周质空间，测得完整细胞的酰化酶比活力分别为每克菌体23.9单位和每克菌体18.3单位[陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998，30(4)393-396]。由于GL-7ACA酰化酶的底物GL-7ACA和产物7-ACA都可以自由进出周质空间，可以通过在培养基中加入底物而获得产物，从而有可能简化生产工艺，降低生产成本。但这两个质粒有一个共同缺点，即它们带有氨苄青霉素抗性，具有β-内酰氨酶基因。尽管β-内酰氨酶对GL-7ACA和CPC水解活力极低，但在大批量的工业生产中，还是有可能破坏底物(GL-7ACA和CPC)。因此本发明特构建了不带β-内酰氨酶基因的分泌表达质粒，使其在大肠杆菌中获得高表达，以便在7-ACA的酶法生产过程中发挥重要作用。
本发明目的是提供一种重组GL-7ACA酰化酶基因及其表达元件和信号肽，和含有该重组基因及其表达元件和信号肽的带卡那霉素抗性分泌型高表达重组质粒，以及将该重组分泌表达质粒转化到特定大肠杆菌中成为能高分泌表达该酰化酶的基因工程菌株。
本发明提供一种从假单胞菌中克隆的并经基因工程方法改造的长为2.5kb的重组GL-7ACA酰化酶基因及其表达元件和信号肽，它们的全序列见图3以及图6、图7。用该重组GL-7ACA酰化酶基因切成的两个片段与NcoⅠ和HindⅢ酶切后大肠杆菌带卡那霉素抗性的表达载体pET-28a(+)连接成为重组分泌表达质粒pETCAlS，再将该重组分泌表达质粒pETCAlS转化到大肠杆菌BL21(DE3)中得到分泌型高表达基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS。
1．重组GL-7ACA酰化酶基因以及其表达元件、信号肽的克隆GL-7ACA酰化酶基因以及其表达元件、信号肽由杨蕴刘等克隆[杨蕴刘等，生物工程学报，1991，7(2)99-107]，但未公开发表它们的序列。杨蕴刘等构建的质粒pMR24，它带有来自假单胞菌长为3.5kb片段的GL-7ACA酰化酶基因。将pMR24以限制性内切酶BamHⅠ酶切后，得到0.7kb的片段，它包含有GL-7ACA酰化酶α-亚基的相应核苷酸序列以及该酶的表达原件、信号肽。表达元件介导GL-7ACA酰化酶基因在大肠杆菌中获得高表达，信号肽引导GL-7ACA酰化酶分泌到周质空间。将该0.7kb片段与经限制性内切酶BamHⅠ酶切后的载体pBluescript SKⅡ连接成重组质粒pBlue3。陈剑峰等利用pBlue3以及pKKCAl[Yong Li al.Protein Expression and Purification，1998，12233-238]构建了重组分泌表达质粒pKKCA1S[陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998，30(4)393-396]，它包含有长为2.5kb的重组GL-7ACA酰化酶基因，但未公开发表其序列。
2．重组分泌型表达质粒pETCAlS的构建将上述表达质粒pKKCAlS用限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ双酶切后，可以将该质粒中包含的重组GL-7ACA酰化酶基因切成长度分别为1.0kb和1.5kb的两个片段。将1.5kb的片段与经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后的大肠杆菌表达载体pET-28a(+)连接成过渡性质粒pETCAlS-B。pETCAlS-B依次经NcoⅠ酶切和牛肠碱性磷酸酶去磷酸化后，与1.0kb的片段连接成重组分泌型表达质粒pETCAlS(如图2所示)。在该质粒中，酰化酶基因依靠大肠杆菌表达载体pET28-a(+)的T7启动子、自身的表达元件以及转录终止子和终止密码子而表达，然后依靠信号肽引导GL-7ACA酰化酶分泌到周质空间。
3．基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS的获得将pETCAlS转化到大肠杆菌BL21(DE3){遗传特征为hsdSgal(λcIts857indl Sam7 nin5 lacUV5-T7 genel)}中，得到的转化子BL21(DE3)/pETCAlS即为本发明的基因工程菌株(菌种保藏号CGMCC NO.0473，日期2000年7月11日，保藏地北京，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。虽然质粒pETCAlS具有lacⅠ基因，但由于T7启动子的特异性及宿主菌BL21(DE3)能高表达T7RNA聚合酶，在不加IPTG诱导的条件下也能高表达。
4．完整细胞GL-7ACA酰化酶活力测定完整细胞GL-7ACA酰化酶活力的测定参照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981，45(10)，2225-2229.]进行。酶活力单位(unit)定义为37℃、pH7.0时每分钟水解GL-7ACA产生1微摩尔的7-ACA所需要的酶量。酶的比活力定义为每克菌体所具有的酶活力单位。该菌株在普通TB培养基中于30℃培养至对数后期，测得比活力为每克菌体82个单位(这个数据是八次实验的平均值)，高于TGl／pTrcCAlS(每克菌体23.9个单位)和TGl/pKKCAlS(每克菌体18.3个单位)。
5．周质空间蛋白质的初分级、SDS-PAGE及粗酶的酶活力测定周质空间蛋白的初分级根据Molecular CloningA Laboratory Manual介绍的方法进行(Sambrook，J et al.1989，Molecular CloningA LaboratoryManual.Cold Spring Harbor， New York843)。得到的粗抽液浓缩5倍后，再进行SDS-PAGE和测定粗抽液的酶活力。粗抽液的酶活力测定参照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981；45773]进行，测得每毫升粗抽液的酶活力为1.35单位。
6．稳定性实验在含卡那霉素浓度达到10微克/毫升的LB平板上划线培养，连续传代达50次，测定第10、20、30、40、50的比活力，活力稳定，可见该基因在大肠杆菌中很稳定(见图5)。
本发明的优点本发明是一种高产GL-7ACA酰化酶，分泌型及带有卡那霉素抗性的新型基因工程菌。从假单胞菌中克隆并经基因工程方法改造的长度为2.5kb的重组GL-7ACA酰化酶基因及其分泌表达元件。用该重组GL-7ACA酰化酶基因与NcoⅠ和HindⅢ酶切后的带有卡那霉素抗性的大肠杆菌表达载体pET-28(+)连接成为重组表达质粒pETCAlS，再将该质粒pETCAlS转化到大肠杆菌BL21(DE3)中得到高表达GL-7ACA酰化酶的基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS。与JMl09/pKKCA1，TGl/pKKCAlS及TGl/pTrcCAlS相比，它有以下优点1．分泌表达相比JM109/pKKCAl[Yong Li et al.Protein Expression and Purification，1998，12233-238]，由于它是非分泌表达菌株，一旦用于生产就不可避免要涉及到酶的分离纯化以及固定化酶等复杂的技术问题，生产成本大大提高。而由于本发明使用了GL-7ACA酰化酶的信号肽，得到的基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS是分泌表达菌株，表达的GL-7ACA酰化酶在信号肽的引导下直接分泌到周质空间，而且GL-7ACA及7-ACA都能自由进出周质空间，所以完全可以采用传统发酵法生产，从而大大降低生产成本。
2．不带β-内氨酰酶基因虽然TGl/pTrcCAlS及TGl/pKKCAlS[陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998，30(4)393-396]都是分泌表达菌株，由于质粒为氨苄青霉素抗性，都带有β-内氨酰酶基因，尽管β-内酰氨酶对GL-7ACA和CPC水解活力极低，但在大批量的工业生产中，仍有可能破坏底物(GL-7ACA和CPC)。本发明菌株用卡那霉素抗性取代了氨苄青霉素抗性，克服了这一缺点。
3．不需要使用诱导剂TGl/pTrcCAlS虽然可以分泌高表达GL-7ACA酰化酶，但需要昂贵而有毒的IPTG诱导。本发明菌株不需要添加任何诱导剂，降低了成本，避开了导入有毒物质。
4．分泌表达产量有很大提高李勇和陈剑锋构建的基因工程菌株的表达产量比起始构建的基因工程菌已提高很多[Yong Li et al.Protein Expression and Purification，1998，12233-238；陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998，30(4)393-396]。但本发明中构建的BL21(DE3)/pETCAlS具有特异的T7启动子，使含该质粒的转化子中GL-7ACA酰化酶的表达量大大提高，完整细胞的比活力可达到每克菌体82单位，约为TGl/pTrcCAlS(每克菌体23.9个单位)的3.4倍、TGl/pKKCAlS(每克菌体18.3个单位)的4.5倍。
5．本发明菌株易培养且表达稳定本发明菌株在普通TB培养基中于30℃培养24小时即可。本发明菌株表达GL-7ACA酰化酶极稳定，传代50代未见表达产量下降和酶活丧失。
通过以下附图和实施例对本发明作进一步阐述。
图1是GL-7ACA酰化酶和CPC酰化酶所催化的反应示意图。CPC头孢菌素C；D-AAOD-氨基酸氧化酶；7-ACA7-氨基头孢烷酸；GL-7ACA戊二酰-7-氨基头孢烷酸。
图2是重组分泌表达质粒pETCAlS的构建示意图。
图3是本发明2.5kb的重组GL-7ACA酰化酶基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。
图4是周质空间蛋白的SDS-PAGE图。
图中1.蛋白质分子量标准，分子量分别为66、43、31、20千道尔顿(kD)；2.周质空间粗抽液；3.BL21(DE3)/pETCAlS菌株的完整细胞裂解液；4.BL21(DE3)菌株完整细胞裂解液对照。
图5是稳定性实验第1、10、20、30、40、50代GL-7ACA酰化酶活力。
图6是表达元件核苷酸序列。
图7是信号肽的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列。
实施例1重组分泌型表达质粒pETCAlS的构建质粒pKKCAlS[陈剑峰等，生物化学与生物物理学报，1998，30(4)393-396]经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后，重组GL-7ACA酰化酶基因被切成两段，其中1.5kb的长片段具有NcoⅠ和HindⅢ粘性末端，1.0kb的短片段两端都带有NcoⅠ粘性末端。大肠杆菌表达载体pET28-a(+)[为Novagen公司产品]长度为5369bp，它包含有一个特异性的强T7启动子、NcoⅠ到XhoⅠ的多克隆位点、lacI操纵子，lacZ核糖体结合位点AGGA和起始密码子ATG；为了避免不稳定的复制，在多克隆位点的下游紧接着一个强转录终止子即T7终止子；该载体带有一个卡那霉素抗性基因，因此具有卡那霉素抗性；该质粒具有ColE1和fl两个复制子。用T4DNA连接酶将1.5kb片段与NcoⅠ和HindⅢ双酶切后的表达载体pET28-a(+)连接，得到过渡性质粒pETCAlS-B。pETCAlS-B依次经NcoⅠ单酶切和牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理后，与1.0kb的小片段连接成分泌表达质粒pETCAlS(见图2)。
实施例2基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS的获得将大肠杆菌BL21(DE3){遗传特征为hsdSgal(λcIts857 indl Sam7 nin5lacUV5-T7 genel)}用氯化钙法(Sambrook，J et al.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual.Cold Spring Harbor，New York)制备成感受态细胞(转化率为106pfu)。将pETCAlS转化到该细胞中，得到的转化子命名为BL21(DE3)/pETCAlS，即为本发明的基因工程菌株。在普通TB培养基(超级肉汤培养基，每升培养基的配制在900毫升去离子水中加入12克细菌培养用胰化蛋白胨、24克细菌培养用酵母抽提物、4毫升甘油，在1.034×105帕斯卡高压下蒸汽灭菌20分钟，然后使该溶液降温至60℃或60℃以下，再加入100毫升经灭菌的017摩尔/升磷酸二氢钾、0.72摩尔/升磷酸氢二钾溶液而成)于30℃培养24小时后，离心收集菌体并测GL-7ACA酰化酶活力，测得比活力为每克菌体82个单位。
实施例3完整细胞的酶活力测定完整细胞的GL-7ACA酰化酶活力的测定参照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981，45(10)，2225-2229.]进行。酶活力单位(unit)定义为37℃、pH7.0时每分钟水解GL-7ACA产生1微摩尔的7-ACA所需要的酶量。酶的比活力定义为每克菌体所具有的酶活力单位。在普通TB培养基(同实施例2)中于30℃培养24小时后，取4毫升菌液，8000转/分钟离心10分钟收集菌体，沉淀悬浮于3毫升pH7.0、0.1摩尔每升的磷酸钠缓冲液中。取100微升菌液于37℃预热5分钟，加入100微升已同时于37℃预热了5分钟的16毫摩尔/升的GL-7ACA，于37℃混合保温30分钟；加入600微升终止液(20％的醋酸和50毫摩尔每升的NaOH以2∶1的体积比混合)混合，15000转每分钟离心10分钟，取上清；最后加入100微升0.5％的对二甲氨基苯甲醛(Merk公司，美国)显色；测定最终混合液在415纳米处的光吸收值，即可算出水解产物7-ACA的量。此外，取菌液作适当稀释，测在600纳米处的光吸收值。以7-ACA产量对菌质量即可算出比活力。
实施例4周质空间酰化酶粗提、SDS-PAGE及粗酶的酶活力测定周质空间蛋白的初分级根据Molecular CloningA Laboratory Manual介绍的方法进行(Sambrook，J et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor，New York843)。取50毫升菌液，4℃时13000转每分钟离心3分钟沉淀细胞；沉淀悬浮于5毫升溶菌酶裂解液中(溶菌酶1毫克每毫升、质量体积比为20％的蔗糖、30毫摩尔pH8.0的Tris.Cl、1毫摩尔pH8.0的EDTA)，冰浴10分钟；然后于4℃时13000转每分钟离心3分钟沉淀细胞，收集上清；上清装入透析袋中对聚乙二醇浓缩5倍后，再进行SDS-PAGE(见图4)和测粗活。周质空间粗抽液和完整细胞裂解液都可见到54kD的β-亚基条带；α-亚基由于分子量过小，只在周质空间粗抽液有模糊条带16KD可见。粗活测定参照Ichikawa等人的方法[Ichikawa et al.Argric Biol Chem，1981；45773]进行。酶活力定义为37℃、pH7.0时每分钟水解GL-7ACA产生1微摩尔的7-ACA所需要的酶量。测活体系为600微升，反应缓冲液为100毫摩尔/升、pH7.0的磷酸钠缓冲液，底物浓度为16毫摩尔/升；加入适量的酶，于37℃保温20分钟；加入1.8毫升的终止液(20％的醋酸与50毫摩尔每升的NaOH以2∶1的体积比混合)终止反应；最后加入100微升0.5％的对二甲氨基苯甲醛(Merk公司，美国)显色；测定最终混合液在415纳米处的光吸收值，即可算出水解产物7-ACA的量。测得每毫升粗抽液的酶活力为1.35单位。
权利要求
1.一种重组戊二酰-7-氨基头胞烷酸酰化酶基因，其特征在于它编码GL-7ACA酰化酶的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列如下1CTGGCCGAGCCGACCTCGACGCCGCAGGCGCCGATTGCGGCCTATAAACCGAGAAGCAATGAGATCCTG 691LeuAlaGluProThrSerThrProGlnAlaProIleAlaAlaTyrLysProArgSerAsnGluIleLeu 2370 TGGGACGGCTACGGCGTCCCGCACATCTACGGGGTCGACGCGCCCTCAGCCTTCTACGGCTACGGCTGG 13824 TrpAspGlyTyrGlyValProHisIleTyrGlyValAspAlaProSerAlaPheTyrGlyTyrGlyTrp 46139 GCCCAGGCGCGCAGCCACGGCGACAATATCCTGCGCCTGTATGGAGAAGCGCGGGGCAAGGGGGCCGAA 20747 AlaGlnAlaArgSerHisGlyAspAsnIleLeuArgLeuTyrGlyGluAlaArgGlyLysGlyAlaGlu 69208 TACTGGGGCCGGATGACGAACAGACGACCGTCTGGCGTCTGACCAACGGCGTGCCGGAG CGTGCCCAG 27670 TyrTrpGlyProAspAspGluGlnThrThrValTrpArgLeuThrAsnGlyValProGluArgAlaGln 138277 CAGTGGTATGCGCAGCAGTCGCCTGATTTCCGCGCCAACCTCGACGCCTTCGCGGCGGGCATCAACGCC 345139 GlnTrpTyrAlaGlnGlnSerProAspPheArgAlaAsnLeuAspAlaPheAlaAlaGlyIleAsnAla 207346 TATGCGCAGCAGAACCCCGACGACATCTCGCCCTGACTGCGGCAGGTGCTGCCGGTCGCCGGCGCCGAC 414208 TyrAlaGlnGlnAsnProAspAspIleSerProAspValArgGlnValLeuProValAlaGlyAlaAsp 276415 GTGGTGGCCCACGCCCATCGCCTGATGAACTTCCTCTATGTCGCGTCGCCCGGCCGCACCCTGGGCGAG 483277 ValValAlaHisAlaHisArgLeuMetAsnPheLeuTyrValAlaSerProGlyArgThrLeuGlyGlu 345484 GGCGACCCGCCGGACCTGGCCGATCAGGGATCCAACTCCTGGGCTGTGGCGCCGGGCAAGACGGCCAAT 552346 GlyAspProProAspLeuAlaAspGlnGlySerAsnSerTrpAlaValAlaProGlyLysThrAlaAsn 414553 GGGAACGCCCTGCTGCTGCAGAACCCGCACCTGTCCTGGACGACGGACTACTTCACCTACTACGAGGCG 621415 GlyAsnAlaLeuLeuLeuGlnAsnProHisLeuSerTrpThrThrAspTyrPheThrTyrTyrGluAla 483622 CATCTCTTCACGCCGGACTTCGAAATCTATGGCGCGACCCAGATCGGCCTGCCGGTCATCCGCTTCGCC 690484 HisLeuPheThrProAspPheGluIleTyrGlyAlaThrGlnIleGlyLeuProValIleArgPheAla 552691 TTCAATCAGCGGATGGGCATCACCAATACCGTCAACGGCATGGTGGGGGCCACCAACTATCGGCTGACG 759553 PheAsnGlnArgMetGlyIleThrAsnThrValAsnGlyMetValGlyAlaThrAsnTyrArgLeuThr 621760 CTTCAGGGCGACGGCTATCTGTATGACGGTCAGGTGCGGCCGTTCGAGCGGCGTCAGGCTTCGCATCGC 828622 LeuGlnGlyAspGlyTyrLeuTyrAspGlyGlnValArgProPheGluArgArgGlnAlaSerHisArg 690829 CTGCGTCAGGCGGACGGGTCGACGGTCGACAAGCCGTTGGAGATCCGTTCCAGCGTCCATGGCCCGGTC 897691 LeuArgGlnAlaAspGlySerThrValAspLysProLeuGluIleArgSerSerValHisGlyProVal 759898 TTCGAGCGCGCGGACGGCACGGCCGTCGCCGTTCGGGTCGCCGGTCTGGATCGGCCGGGCATGCTCGAG 966760 PheGluArgAlaAspGlyThrAlaValAlaValArgValAlaGlyLeuAspArgProGlyMetLeuGlu 828967 CAGTATTTCGACATGATCACGGCGGACAGCTTCGACGACTACGAAGCCGCTATGGCGCGGATGCATGTG 1035829 GlnTyrPheAspMetIleThrAlaAspSerPheAspAspTyrGluAlaAlaMetAlaArgMetHisVal1036 CCGACCTTCAACATCGTCTACGCCGACCGCGAAGGGACCATCAACTACAGCTTCACGGCGTGGCGCCCA 1104ProThrPheAsnIleValTyrAlaAspArgGluGlyThrIleAsnTyrSerPheThrAlaTrpArgPro1105 AACGGGCCGAGGGCGACATCGCCTTCTGGCAGGGGCTCGGCCGGGCCATTCCTCGCGTTACTGTGGACT 1173AsnGlyProArgAlaThrSerProSerGlyArgGlySerAlaGlyProPheLeuAlaLeuLeuTrpThr1174 GAGACACACCCCTGGACGATCTGCCGCGCGTCACCAATCCGCCGGCCCGCTTCGTGCAGAACTCCAATG 1242GluThrHisProTrpThrIleCysArgAlaSerProIleArgArgProAlaSerCysArgThrProMet1243 ATCCGCCGTGGACGCCGACCTGGCCCGTCACCTACACGCCCAGGGACTTCCCCTCCTATCTGGCGCCCC 1311IleArgArgGlyArgArgProGlyProSerPROThrArgProGlyThrSerProProIleTrpArgPro1312 AGACGCGCACTCCCTGCGCGCTCAGCAAAGCGTGCGTCTGATGTCGAGAACGACGACCTGAGGCTGGAA 1380ArgArgAlaLeuProAlaArgSerAlaLysArgAlaSerAspValGluAsnAspAspLeuArgLeuGlu1381 CGCTTCATGGCGCTGCAGTTGAGCCACCGCGCCGTCATGGCCGACCGCACCTTGCCGGACCTGATCCCG 1449ArgPheMetAlaLeuGlnLeuSerHisArgAlaValMetAlaAspArgThrLeuProAspLeuIlePro1450 GCCGCCCTGATCGACCCCGATCCCGAGGTCCAGGCGGCGGCGCGCCTGCTGGCGGCGTGGGATCGTGAG 1518AlaAlaLeuIleAspProAspProGluValGlnAlaAlaAlaArgLeuLeuAlaAlaTrpAspArgGlu1519 TTCACCAGCGACAGCCGCGCCGCCCTGCTGTTCGAGGAATGGGCGCGTCTGTTCGCCGGCCAGAATTTC 1587PheThrSerAspSerArgAlaAlaLeuLeuPheGluGluTrpAlaArgLeuPheAlaGlyGlnAsnPhe1588 GCCGGCCAGGCGGGTTTCGCCACGCCCTGGTCGCTGGATAAGCCGGTCAGCACCCCCACGGCGTCCGCT 1656AlaGlyGlnAlaGlyPheAlaThrProTrpSerLeuAspLysProValSerThrProTyrGlyValArg1657 GACCCCAAGGCCGCCGTCGATCAACTGCGGACCGCCATCGCCAACACCAAGCGCAAATACGGCGCGATC 1725AspProLysAlaAlaValAspGlnLeuArgThrAlaIleAlaAsnThrLysArgLysTyrGlyAlaIle1726 GACCGCCCGTTCGGCGACGCCTCGCGCATGATCCTGAACGATGTGATTGTTCCGGGCGCCGCCGGCTAC 1794AspArgProPheGlyAspAlaSerArgMetIleLeuAsnAspValIleValProGlyAlaAlaGlyTyr1795 GGCAACCTGGGTTCCTTCCGGGTCTTCACCTGGTCCGATCCTGACGAAAACGGGGTTCGCACGCCCGTC 1863GlyAsnLeuGlySerPheArgValPheThrTrpSerAspProAspGluAsnGlyValArgThrProVal1864 CACGGCGAGACGTGGGTGGCGATGATCGAGTTCTCCACCCCGGTGCGGGCCTATGGCCTGATGAGCTAC 1932HisGlyGluThrTrpValAlaMetIleGluPheSerThrProValArgAlaTyrGlyLeuMetSerTyr1933 GGCAATTCTCGCCAGCCGGGCACGACGCACTACAGCGATCAGATCGAACGCGTGTCGCGGGCCGACTTC 2001GlyAsnSerArgGlnProGlyThrThrHisTyrSerAspGlnIleGluArgValSerArgAlaAspPhe2002 CGCGAGCTGTTGCTGCGGCGAGAGCAGGTCGAGGCCGCCGTCCAGGAACGCACGCCCTTCAACTTCAAG 2070ArgGluLeuLeuLeuArgArgGluGlnValGluAlaAlaValGlnGluArgThrProPheAsnpheLys2071 CCATGAAAGGCCTGACCATGACACGACGGATTGGGTATTCGGCGGGCGCGGCGTCTCTGGCGCTGATGG 2139ProTCGCCGCCTCTGGAGCGGCGGCGGGCGAGCCGGCCTTCACTTCGGTTCAGGTCGAGGGCTTTTCGGTACCGGGCGCGCTGTCGAAGGCCTGGGCCGACTTCGACAACGACGGCGACCTGGACCTGGCCGTCTCCTGGAAGAGCGGCGAAGTTCGCCTCTATCTCAACGACGGCGGCGCTTTCGTCAACATCGGCCCGGAGATGGGCTGCCTACCTCGGGCATCGAGATTCGCGGGTTGAGCTGGGGCGACTTCGACGGCGATGGGTTCGTCGAC
2．权利要求1所述重组GL-7ACA酰化酶基因的表达元件，其特征在于该表达元件的核苷酸序列如下ATCCGTGGTTCGTACGCGCCGCCTACAAGTGGTGATCTAGGGGAACGTTCCGGGGGCGTCGCTTCAACGGCGTCTCCGGATCTGGGTGAGAGGGGAAATCC
3．权利要求1所述重组GL-7ACA酰化酶基因的信号肽，其特征在于该信号肽的核苷酸序列以及相应的氨基酸序列如下ATGCTGAGAGTTCTGCACCGGGCGACGTCCGCCCTGGTTATGGCGACTGCGATCGGCCTTGCGCCCGGCMetLeuArgValLeuHisArgAlaThrSerAlaLeuValMetAlaThrAlaIleGlyLeuAlaProGlyGTCGCCCTTGCGValAlaLeuAla
4．含有权利要求1，2和3所述的重组GL-7ACA酰化酶基因以及其表达元件、信号肽的重组表达质粒，其特征在于该表达质粒是由所述的带表达元件、以及信号肽的相应核苷酸序列的重组GL-7ACA酰化酶基因与NcoⅠ和HindⅢ酶切后的大肠杆菌表达载体pET28-a(+)构建而成的带卡那霉素抗性的重组分泌表达质粒pETCAlS。
5．含有权利4所述的重组分泌表达质粒pETCA1S的基因工程菌株，其特征在于该菌株是将重组分泌表达表达质粒pETCA1S转化到大肠杆菌BL21(DE3)中得到的保藏号为CGMCC No.0473的基因工程菌株BL21(DE3)/pETCAlS。
全文摘要
本发明提供了一种从假单胞菌中克隆并经基因工程改造得到的长为2.5kb的重组GL－7ACA酰化酶基因及其表达元件和信号肽的序列。构建了该基因的高分泌表达重组质粒pETCA1S,该质粒转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3),得到的基因工程菌株BL21(DE3)/pETCA1S在普通的TB培养基中,无需添加诱导剂即能高效分泌表达GL－7ACA酰化酶,比活力可达到每克菌体82个单位。
文档编号C12N15/55GK1283696SQ0012510
公开日2001年2月14日 申请日期2000年9月8日 优先权日2000年9月8日
发明者王恩多, 郑勇刚, 陈剑峰, 姜卫红, 赵国屏 申请人:中国科学院上海生物化学研究所