本发明涉及一种hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法及其在膀胱癌治疗药物中的应用。
背景技术：
肿瘤是危害人类健康的顽症之一，尽管除了手术、放疗和化疗，还有导向治疗、肿瘤疫苗和基因治疗等多种新的疗法，但目前效果仍不尽人意。众所周知，人体的免疫反应具有抗肿瘤作用，它通过细胞免疫机能捕获和消灭机体内新生的肿瘤细胞。而引起肿瘤发生的最终因素都可以归结为机体免疫效应细胞在数量和质量上不足以激发起有效的抗肿瘤免疫应答。因此，从治疗上讲，有效的抗肿瘤策略：(1)增强机体抗肿瘤免疫反应，主要是提高肿瘤局部活化的免疫效应细胞的数量，其中主要组织相容性复合物(MHC)限制性的细胞毒T细胞(CTL/Tc,即杀伤性T细胞)是最重要的免疫监视和效应细胞。(2)采取有效手段直接杀死肿瘤细胞。
膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，超过70％的膀胱癌为表浅性膀胱癌，经尿道膀胱肿瘤切除术是表浅性膀胱癌的标准治疗方法，但术后易复发，高达60％～92％。有资料表明膀胱肿瘤局部的淋巴细胞不能被有效活化，进而无法有效地监视肿瘤，造成肿瘤细胞免疫逃逸，是膀胱肿瘤复发的重要原因。因此，如何寻找一种合理有效的生物制剂来达到靶向治疗膀胱癌，以期能够增强膀胱肿瘤局部的免疫功能、杀灭膀胱肿瘤细胞、有效预防膀胱肿瘤复发的效果，是每一个科研工作者及临床医生所面临的以及需要迫切解决的重要问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，提供一种对膀胱肿瘤具有生物学干预作用，能够抑制其生殖、分化，诱导其凋亡的hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法及其在膀胱癌治疗药物中的应用。
本发明的hTERT/HRE－Ad－SEA复合物的制备方法包括以下步骤：
a.抗膀胱癌单克隆抗体BDI-1Fab段的制备及纯化：BDI-1加木瓜蛋白酶和β-巯基乙醇，反应得Fab，用磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline，下称PBS)透析后上蛋白G柱纯化，收集流出峰,超滤离心浓缩,加双蒸水和1M Bacine，PH为9.0，得PH8.5含BDI-1Fab的Bacine混合体系备用；
b.用化学连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)制备BDI-1Fab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原：将肠毒素A(SEA)和上述步骤a所得Bacine混合液分别以6、10倍过量的摩尔比加入连接剂SPDP，反应得SEA-PDP和Fab-PDP，分别离心取上清，加醋酸钠缓冲液超滤浓缩3次；SEA-PDP中加入1M的二硫代苏糖醇(DTT)反应得SEA-SH，离心，上清加醋酸钠缓冲液，超滤浓缩3次后，加入5倍摩尔过量的Fab-PDP，混合，4℃摇床偶联过夜，得含有BDI-1Fab-SEA的偶联混合物；
c.抗膀胱癌靶向超抗原的纯化：BDI-1Fab-SEA的偶联混合物，离心，取上清，过surperdex-200柱，以蛋白质液相层析系统(High performance Liquid Chromatography,下称HPLC)纯化并收集产物；
d.超抗原SEA基因克隆：以产SEA金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565为模板，根据GenBank已知的SEA基因序列设计1对引物进行PCR扩增后，得到771bpDNA片段；
e.携带超抗原SEA基因的hTERT/HRE-1双调控增殖型溶瘤腺病毒载体 pSG502-SEA的构建、重组和滴度测定：应用PCR技术将引入SpeI和SalI酶切位点的超抗原SEA基因片段连接到经SpeI和SalI双酶切后的非增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218中，将鉴定正确的非增殖溶瘤腺病毒载体命名为PDC318–SEA；PDC318–SEA经SpeI和SalI双酶切后将超抗原SEA基因片段连接到同样经SpeI和SalI双酶切后的增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒PENTR-12中，将鉴定正确的携带SEA基因增殖溶瘤腺病毒载体命名为PENTR12-SEA；将携带SEA基因的增殖溶瘤腺病毒载体PENTR12-SEA与病毒骨架质粒PPE3重组，得到重组腺病毒-SEA质粒PPE3-SEA；将PPE3-SEA与hTERT/HRE-1双调控增殖腺病毒质粒pSG502共转染至293细胞，共转染后9～14d出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定，经鉴定正确的hTERT/HIF-1双调控溶瘤腺病毒命名为SG502-SEA。
本发明利用超抗原本身强大的活化T淋巴细胞杀伤膀胱肿瘤细胞作用及病毒载体在肿瘤细胞内扩增带来的溶瘤效应并加以靶向改造使之最大限度地减少毒副作用。将肿瘤特异性启动子-人端粒酶逆转录酶启动子hTERT和缺氧诱导因子HRE-1分别插入腺病毒复制所必需的E1A、E1B基因删除的腺病毒质粒，并插入超抗原SEA基因，成功构建携带超抗原SEA基因的双调控的肿瘤特异性增殖溶瘤腺病毒hTERT/HRE－Ad－SEA复合物，使其能够高效的靶向膀胱肿瘤细胞，既具有在肿瘤细胞内特异性增殖能力又具有强大细胞毒T淋巴细胞刺激能力，进而对膀胱肿瘤细胞产生强大的杀伤作用。通过体外实验证实hTERT/HIF－Ad－SEA复合物具有强大的特异性刺激T细胞增殖和直接溶解肿瘤细胞的双重抗瘤能力；通过建立小鼠膀胱肿瘤模型，通过膀胱灌注的方法证实hTERT/HIF－Ad－SEA复合物直接靶向到达肿瘤局部并限制其仅在瘤区发挥作用，检测膀胱肿瘤组织中E1A、E1B蛋白含量，并观察hTERT/HIF－Ad－SEA复合物对原位膀胱癌小鼠的肿瘤杀伤效应，显示出满意的 靶向叠加抑癌效果。通过各项免疫学指标的分析，合理的解释其抗瘤作用的免疫学机制。为尝试解决超抗原临床应用的靶向性和特异性提供实验和理论依据，为靶向基因治疗膀胱癌提供技术平台。
具体实施方式
本发明的实施例的制备和检测步骤如下：
步骤1：
1.1抗膀胱癌单克隆抗体BDI-1Fab段的制备及纯化：BDI-1加木瓜蛋白酶和β-巯基乙醇，反应得Fab，用磷酸缓冲液(Phosphate Buffered Saline，下称PBS)透析后上蛋白G柱纯化，收集流出峰,超滤离心浓缩,加双蒸水和1M Bacine，PH为9.0，得PH8.5含BDI-1Fab的Bacine混合体系备用。
1.2用化学连接剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)制备BDI-1Fab-SEA抗膀胱癌靶向超抗原：将肠毒素A(SEA)和步骤(1.1)所得Bacine混合液分别以6、10倍过量的摩尔比加入连接剂SPDP，反应得SEA-PDP和Fab-PDP，分别离心取上清，加醋酸钠缓冲液超滤浓缩3次；SEA-PDP中加入1M的二硫代苏糖醇(DTT)反应得SEA-SH，离心，上清加醋酸钠缓冲液，超滤浓缩3次后，加入5倍摩尔过量的Fab-PDP，混合，4℃摇床偶联过夜，得含有BDI-1Fab-SEA的偶联混合物。
1.3抗膀胱癌靶向超抗原的纯化：BDI-1Fab-SEA的偶联混合物，离心，取上清，过surperdex-200柱，以蛋白质液相层析系统(High performance Liquid Chromatography,下称HPLC)纯化并收集产物。
1.4SEA-Fab偶联蛋白抗体活性的鉴定：以BIU-87细胞爬片为抗原片，偶联蛋白为一抗，抗SEA兔McAb为二抗，三抗为生物素化的抗兔二抗，DAB显色；分别 以LoVo细胞爬片代替抗原片、SEA代替一抗作为对照。
1.5SEA-Fab偶联蛋白促PBMC增殖活性鉴定：接种2×105个/孔PBMC于96孔培养板，加入相同摩尔浓度的SEA及偶联蛋白，以含10％胎牛血清的RPMI 1640为对照；每组设6个平行孔，培养72h后加10μl/7孔CCK-8，孵育4h上酶标仪测A450nm，以增殖指数(PI)表示增殖活性，PI＝实验组A值/对照组A值。
1.6SEA-Fab偶联蛋白促PBMC分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ活性鉴定：接种1×107个/瓶PBMC于25cm2的培养瓶，加入同摩尔浓度的SEA及偶联蛋白，以含10％胎牛血清的RPMI 1640为对照，培养48h后离心取上清，按ELISA试剂盒操作步骤进行，酶标仪测A450nm，画出标准曲线后求出待测样品值，重复3次。
1.7抗膀胱癌靶向超抗原对BIU-87、Lovo细胞体外增殖抑制作用的比较：实验分对照组、抗膀胱癌靶向超抗原及SEA实验组；以PBMC为效应细胞，BIU-87、Lovo为靶细胞。3×103/孔接种BIU-87、Lovo于96孔培养板A，终体积100ul；以10:1、20:1、40:1的效靶比接种PBMC于96孔培养板B,并分别给予0.036～3.6nM的SEA及抗膀胱癌靶向超抗原，终体积100ul；每组设6个平行孔,并设单独BIU-87、Lovo对照孔(T)和单独PBMC对照孔(E)，刺激48h；经6h肿瘤细胞贴壁后弃培养液A、B板混合再培养24h,CCK-8法测OD450nm，计算细胞增殖抑制率(抑制率＝[OD(E)+OD(T)-OD(实验组)]/OD(T)×100％)。
1.8CCK-8法检测单抗靶向SEA体外对膀胱癌细胞株BIU-87增殖的抑制作用：实验设对照组、SEA组及单抗靶向SEA组。以PBMC为效应细胞，BIU-87为靶细胞。每组均以3×103/孔接种BIU-87于96孔培养板A(终体积100μl)和10：1、20：1、40：1的效靶比接种PBMC于96孔培养板B，并在B板分别给予终浓度为0.36-36nmoL/L的SEA、单抗靶向SEA或全培养液(对照组)(终体积100μl)刺激48h。酶 标仪测吸光度(A)(450nm)，计算细胞增殖抑制率。
1.9Hochest 33258荧光染色法观察细胞凋亡形态学改变：将干净无菌的盖玻片置于30mm2培养皿，接种细胞后同浓度0.36nmol/L、效靶比10：l实验组处理；24h后吸尽培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍；以Hochest 33258(5mg/L)染色5min，封片；荧光显微镜下观察并随机拍照。
1.10CFSE/7-AAD双染流式细胞术检测凋亡率：每组均以6×104/孔接种BIU-87于6孔培养板A；并以2.5：1、5：1、10：1、20：1、40：1的效靶比接种PBMC于6孔培养板B，并给予终浓度为0.36nmol/L的SEA或单抗靶向SEA刺激48h，上流式细胞仪检测。
1.11Western印迹分析各组Bax、Bcl-2蛋白的表达：另设单独BIU-87细胞组，1×106/瓶接种BIU-87细胞于25cm2的培养瓶，终体积5ml。同浓度0.36nmol/L、效靶比10：1实验组处理。用凝胶成像分析系统计算条带的积分A值，以内参水平作为等量蛋白上样参照。
1.12各组共培养上清中IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度检测：吸取上述共培养12、24h上清少量，离心取上清，按ELISA试剂盒操作步骤进行，酶标仪测A450，画出标准曲线后求出待测样品值。
步骤2：表达金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控溶瘤腺病毒载体的构建、鉴定及其抗膀胱肿瘤作用。
2.1超抗原SEA基因克隆：以产SEA金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC13565为模板，根据GenBank已知的SEA基因序列设计1对引物(P1：5’-CCAATATGAAAAAAACAGCAT-3’,P2：5’-ATTGGACTTGTATATAAATATATA-3’)，行PCR扩增后，得到771bpDNA片段。
2.2携带超抗原SEA基因的hTERT/HRE-1双调控增殖型溶瘤腺病毒载体pSG502-SEA的构建、重组和滴度测定：应用PCR技术将引入SpeI和SalI酶切位点的超抗原SEA基因片段连接到经SpeI和SalI双酶切后的非增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒pSG218中，将鉴定正确的非增殖溶瘤腺病毒载体命名为PDC318–SEA。PDC318–SEA经SpeI和Sal I双酶切后将超抗原SEA基因片段连接到同样经SpeI和SalI双酶切后的增殖溶瘤腺病毒穿梭质粒PENTR-12中，将鉴定正确的携带SEA基因增殖溶瘤腺病毒载体命名为PENTR12-SEA。将携带SEA基因的增殖溶瘤腺病毒载体PENTR12-SEA与病毒骨架质粒PPE3重组，得到重组腺病毒-SEA质粒PPE3-SEA。将PPE3-SEA与hTERT/HRE-1双调控增殖腺病毒质粒pSG502共转染至293细胞，共转染后9～14d出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定，经鉴定正确的hTERT/HIF-1双调控溶瘤腺病毒命名为SG502-SEA。
2.3RT-PCR检测pSG502-SEA在肿瘤细胞内不同时段mRNA的表达：取膀胱癌EJ细胞胰酶消化离心，分别计数1×107个细胞加入3个培养瓶中培养细胞贴壁后分别在每个培养瓶中以5MOI感染病毒液，分别于12、24、48h计数1×107个细胞。提取EJ细胞总RNA后，行RT-PCR检测。
2.4免疫荧光定位SEA表达于肿瘤细胞及western blot测定蛋白表达：细胞消化、离心，取5×105个细胞，加入已沉入盖玻片的六孔板中加入适量培养液，待细胞贴壁后分别5MOI感染病毒液。12、24、48h分别取出盖玻片用多聚甲醛固定过夜，PBS冲洗2次，加入SEA抗体稀释液4℃过夜，抗体封闭液封闭，加入荧光二抗室温避光30min，荧光显微镜下观察。计数分别感染病毒12、24，36、48h的EJ细胞1×106个细胞，消化、离心，PBS冲洗3次，用400μl含有1％PMSF(100mmol/L)的RAPI裂解液4℃裂解细胞15min，离心将上清取出，取20μl上清液1：1加2× 上样缓冲液煮沸变性，8μl加样SDS-PAGE电泳、转膜、封闭。一抗用TBST1：1000稀释，二抗1：500稀释，一抗4℃孵育过夜，TBS冲洗2次，二抗室温孵育2h，DAB曝光，X光胶片冲洗。
2.5显微镜下动态观测淋巴细胞与肿瘤细胞共培养：分别计数EJ细胞1×107个细胞加入2个培养瓶中培养,待细胞贴壁后将其中一瓶细胞加入5MOI感染病毒液转染1瓶细胞。12h给细胞换液1次,取5ml新鲜血液加入无菌离心管与PBS 1:1混匀,平均缓慢加入两只装有5ml人淋巴细胞分离液的无菌离心管中,。1500r/min,20℃离心10min,用5ml注射器小心吸取白色雾状层,加入离心管,1000r/min离心5min,弃去上清,PBS洗一次,细胞计数1×106个细胞,分别加入2个细胞培养瓶中,动态观察细胞变化。
2.6ELISA检测TNF分泌：加一定48h细胞培养液样品0.1ml于已包被之反应孔中，置37℃孵育1h，然后洗涤。加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml，37℃孵育0.5～1h，洗涤。加底物液显色后终止反应，酶标仪上检测样本OD值。
步骤3：统计学处理，采用组间t检验。
本发明上述实施例的实验结果如下：
1、超抗原诱导细胞毒性T淋巴细胞抗膀胱肿瘤效应的研究和局部注射超抗原对小鼠膀胱癌抑癌效应的实验。
SEA刺激淋巴细胞增殖结果：10ng/L的SEA与2×105/孔的淋巴细胞共同培养48h后开始增殖，96h达高峰，之后开始下降。反应组与对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。
SEA激活淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞的杀伤效应：经SEA诱导后的细胞毒T 淋巴细胞对E-J膀胱肿瘤细胞有明显的杀伤作用，在E∶T＝5∶1、SEA为1μg/L时，肿瘤细胞死亡率最高,达85％。反应组与对照组比较有极显著性差异(P<0.01)。
SEA对T739小鼠膀胱癌的抑制效应：在相同时间内,实验组与对照组肿瘤的生长速度有显著性差异,实验组肿瘤重量明显小于对照组(P<0.01),显示SEA对活体肿瘤的生长有良好的抑制性，抑瘤率为84.7％。且SEA在提高机体免疫力的同时,尚有抗恶病质等恶性肿瘤并发症的效果。
SEA对T739荷瘤鼠生存时间的影响：给SEA局部注射后,实验组荷瘤鼠的存活时间比对照组明显延长(P<0.01),延长存活率达24.1％。本试验将SEA局部注射于肿瘤接种和生长部位,未发现荷瘤鼠有休克、全身感染等严重并发症出现,较有效地避免SEA使用时的毒副作用。
2、抗人膀胱癌单克隆抗体Fab段与超抗原偶联蛋白的制备及其对人膀胱癌细胞株的抑制作用。
抗膀胱癌靶向超抗原SDS-PAGE分析图谱分析：纯化后的第一峰样品电泳图显示目的产物得到了有效的纯化，分子量250kd左右。
膀胱癌单抗靶向超抗原SEA的抗膀胱癌抗体靶向活性检测：A.以抗膀胱癌靶向超抗原为一抗，BIU-87细胞的胞膜多可见棕黄色阳性染色(×400)；B.SEA代替一抗对照组胞膜未见阳性染色(×400)；C.PBS代替一抗对照组胞膜未见阳性染色(×400)；D.以Lovo细胞爬片代替抗原片对照组胞膜未见阳性染色(×400)，提示抗膀胱癌靶向超抗原具有与膀胱癌细胞特异性结合的靶向活性。
膀胱癌单抗靶向超抗原SEA促T淋巴细胞增殖活性的鉴定：抗膀胱癌靶向超抗原、SEA促PBMC增殖活性对比：抗膀胱癌靶向超抗原促PBMC增殖作用随浓度增大逐渐增强，在多个浓度组与SEA组差异无显著性(P≥0.05)，提示抗膀胱癌靶向超 抗原依然保留了SEA强大的促T细胞增殖作用。
抗膀胱癌靶向超抗原诱导T淋巴细胞分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ活性鉴定：抗膀胱癌靶向超抗原、SEA诱导PBMC分泌细胞因子活性对比：抗膀胱癌靶向超抗原组IL-2、TNF-α、IFN-γ均高于阴性对照(P﹤0.05)，但与SEA组差异无显著性(P≥0.05)，提示抗膀胱癌靶向超抗原完整保留了SEA诱导PBMC分泌细胞因子的作用。
抗膀胱癌靶向超抗原对BIU-87、Lovo细胞体外增殖抑制作用：抗膀胱癌靶向超抗原、SEA活化PBMC对BIU-87细胞株体外增殖抑制作用比较，同摩尔浓度、效靶比下偶联蛋白组均高于相应对照组及SEA组(P＜0.05)。提示在同浓度、效靶比下，抗膀胱癌靶向超抗原对膀胱肿瘤细胞的杀伤效应要强于SEA。抗膀胱癌靶向超抗原、SEA活化PBMC对LOVO细胞株体外增殖抑制作用比较，同摩尔浓度、效靶比下偶联蛋白组虽高于相应对照组，但与SEA组差异无显著性(P≥0.05)。提示在同浓度、效靶比下，抗膀胱癌靶向超抗原强于SEA的杀伤效应仅限于膀胱肿瘤细胞。SEA活化PBMC对BIU-87、LOVO细胞株体外增殖抑制作用比较，同浓度、效靶比下SEA对BIU-87、LOVO组间差异无显著性(P≥0.05)，排除了抗膀胱癌靶向超抗原对膀胱肿瘤细胞的杀伤效应要强于SEA系因SEA对不同细胞敏感性存在差异的可能。
单抗靶向SEA、SEA活化PBMC对BIU-87细胞株体外增殖抑制率:随浓度(0.36～36nmol/L)及效靶比(10：l～40：1)的增加，单抗靶向SEA对BIU-87的增殖抑制作用逐渐增强；同浓度、同效靶比下单抗靶向SEA对BIU-87细胞株的抑制作用显著高于对照组及SEA组(P<0.05)，仅在效靶比40：1、3.6nmol/L浓度组单抗靶向SEA与SEA组间差异无统计学意义(P>0.05)。
单抗靶向SEA对肿瘤细胞凋亡率的影响：Hochest 33258是一种亲核染料，可 被活细胞摄取。在荧光显微镜下，经340nm紫外光激发，对照组可见活细胞核呈均匀的蓝色荧光，未见凋亡细胞。实验组均可见较多凋亡细胞，胞核碎裂、浓缩边集于核膜下，出现凋亡小体，以单抗靶向SEA组更显著。
不同效靶比下单抗靶向SEA、SEA诱导BIU-87凋亡率：凋亡率检测结果：随浓度增加单抗靶向SEA显现出强大的活化PBMC诱导BIU.87凋亡作用，并显著高于对照组及SEA组。
相同效靶比/不同浓度下单抗靶向SEA、SEA诱导BIU-87凋亡作用:凋亡率检测结果：随效靶比的增加单抗靶向SEA显现出强大的活化PBMC诱导BIU-87凋亡作用，并显著高于对照组及SEA组。
单抗靶向超抗原组及各对照组Bax、Bcl-2蛋白的表达分析：与对照组比较，实验组上调Bax蛋白表达及Bax与Bcl-2比值(P<0.05)，且SEA组和单抗靶向SEA组间差异亦有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，实验组下调Bcl-2蛋白，但组间差异无统计学意义(P>0.05)。
单抗靶向超抗原组及各对照组培养上清中细胞因子的分泌分析：对照组虽存在自分泌现象，但与实验组差异有统计学意义(P<0.05)；而SEA组、单抗靶向SEA间差异则无统计学意义(P>O.05)。
3、表达金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控溶瘤腺病毒载体的构建、鉴定及其抗膀胱肿瘤作用。
SEA基因分析：DNA序列分析显示与GenBank已知SEA基因序列相一致
双调控溶瘤腺病毒靶向SEA在膀胱肿瘤EJ细胞中RNA水平成功表达分析：总RNA产物分光光度计检测为538μg/ml，取总RNA 1μl进行反转录,为cDNA，保存于-70℃.用SEA引物F：5'-TCTGAATTGCAGGGAGCAGCTTTA-3'R： 5'-ACCACCCGCACATTGATAACCATA-3'分别对12，24，36h反转录产物行PCR鉴定，结果显示SEA在膀胱肿瘤EJ细胞中RNA水平成功表达。
双调控溶瘤腺病毒靶向SEA于膀胱肿瘤细胞蛋白表达测定：免疫荧光定位：EJ细胞表面可以看到明显的荧光表达，可以确定SEA基因表达于膀胱肿瘤的细胞膜上，并且不同时段细胞表达荧光的亮度存在查别。SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色显示在27kDa附近可看到明显条带，而未转染细胞不存在.Western-blot，结果证实SEA蛋白的表达成功。
双调控溶瘤腺病毒靶向超抗原刺激后淋巴细胞与肿瘤细胞共培养分析：显微镜下动态观测淋巴细胞与肿瘤细胞共培养结果显示EJ细胞与淋巴细胞共同培养的过程中，转染SEA基因的肿瘤细胞相对未转染的细胞更易被淋巴细胞捕获杀伤，对淋巴细胞有一定的趋化作用。
双调控溶瘤腺病毒靶向SEA培养液中TNF分析：阳性组为转染细胞与淋巴细胞共培养中48h细胞因子状况，阴性组为转染细胞于淋巴细胞共培养48h细胞因子分泌状况，两者在TNF分泌中差异有统计学意义，转染组明显高于为转染组(t＝2.585P＝0.025<0.05)。