一种抗草甘膦转基因籼稻的制备方法与流程

文档序号:11061780阅读:来源:国知局

技术特征:

1.筛选培养基,其用于筛选抗草甘膦的愈伤组织,其包含N6培养基的大量元素、10倍B5培养基的微量元素和50-400mg/L草甘膦,

任选地,所述筛选培养基含有100-400mg/L的草甘膦;任选地,所述筛选培养基含有100-300mg/L的草甘膦;任选地,所述筛选培养基含有150-300mg/L的草甘膦;任选地,所述筛选培养基含有150-200mg/L的草甘膦;任选地,所述筛选培养基含有200-300mg/L的草甘膦;

任选地,所述筛选培养基还包含250mg/L羧苄青霉素;任选地,所述筛选培养基还包含N6培养基的铁盐;任选地,所述筛选培养基还包含B5培养基的有机质;任选地,所述筛选培养基还包含200-600mg/L谷氨酸;任选地,所述筛选培养基还包含300-800mg/L脯氨酸;任选地,所述筛选培养基还包含2-3mg/L 2,4-D;任选地,所述筛选培养基还包含30g/L麦芽糖;任选地,所述筛选培养基还包含7g/L琼脂;任选地,所述筛选培养基的pH值为5.8。

2.培养基组合,其包括权利要求1的筛选培养基和用于共培养农杆菌和愈伤组织的共培养基,所述共培养基包含3/10倍MS培养基的大量元素和1/2倍MS培养基的微量元素;

任选地,所述共培养基还包含N6培养基的铁盐;任选地,所述共培养基还包含N6培养基的有机质;任选地,所述共培养基还包含800mg/L水解酪蛋白;任选地,所述共培养基还包含2-3mg/L 2,4-D;任选地,所述共培养基还包含20g/L麦芽糖;任选地,所述共培养基还包含10g/L葡萄糖;任选地,所述共培养基还包含200mg/L乙酰丁香酮;任选地,所述共培养基还包含7g/L琼脂;任选地,所述共培养基的pH值为5.2。

3.如权利要求2所述的培养基组合,其还包括悬浮培养基,所述悬浮培养基包含AA培养基的大量元素、微量元素、铁盐、甘氨酸、 肌醇和烟酸硫胺素,

任选地,所述悬浮培养基还包含100-300mg/L天冬氨酸;任选地,所述悬浮培养基还包含500-1000mg/L谷氨酸;任选地,所述悬浮培养基还包含100-300mg/L精氨酸;任选地,所述悬浮培养基还包含2mg/L 2,4-D;任选地,所述悬浮培养基还包含20g/L麦芽糖;任选地,所述悬浮培养基还包含10g/L葡萄糖;任选地,所述悬浮培养基还包含200mg/L乙酰丁香酮;任选地,所述悬浮培养基的pH值为5.2。

4.如权利要求2所述的培养基组合,其还包括诱导水稻愈伤组织的诱导培养基,其中所述诱导培养基包含N6培养基的大量元素和10倍B5培养基的微量元素;任选地,所述诱导培养基还包含N6培养基的铁盐;任选地,所述诱导培养基还包含B5培养基的有机质;任选地,所述诱导培养基还包含200-600mg/L谷氨酸;任选地,所述诱导培养基还包含300-800mg/L脯氨酸;任选地,所述诱导培养基还包含300-800mg/L水解酪蛋白;任选地,所述诱导培养基还包含2-3mg/L 2,4-D;任选地,所述诱导培养基还包含30g/L麦芽糖;任选地,所述诱导培养基还包含3g/L Phytagel;任选地,所述诱导培养基的pH值为5.8。

5.如权利要求2所述的培养基组合,其还包括对水稻愈伤组织进行继代培养的继代培养基,其中所述继代培养基包含N6培养基的大量元素和10倍B5培养基的微量元素;任选地,所述继代培养基还包含N6培养基的铁盐;任选地,所述继代培养基还包含B5培养基的有机质;任选地,所述继代培养基还包含200-600mg/L谷氨酸;任选地,所述继代培养基还包含300-800mg/L脯氨酸;任选地,所述继代培养基还包含300-800mg/L水解酪蛋白;任选地,所述继代培养基还包含2-3mg/L 2,4-D;任选地,所述继代培养基还包含30g/L麦芽糖;任选地,所述继代培养基还包含3g/L Phytagel;任选地,所述继代培养基的pH值为5.8。

6.如权利要求2所述的培养基组合,其还包括对继代培养后的水稻愈伤组织进行预培养的预培养基,其中所述预培养基包含N6培养基的大量元素和10倍B5培养基的微量元素;任选地,所述预培养基还包含N6培养基的铁盐;任选地,所述预培养基还包含B5培养基的有机质;任选地,所述预培养基还包含200-600mg/L谷氨酸;任选地,所述预培养基还包含300-800mg/L脯氨酸;任选地,所述预培养基还包含300-800mg/L水解酪蛋白;任选地,所述预培养基还包含2-3mg/L 2,4-D;任选地,所述预培养基还包含30g/L麦芽糖;任选地,所述预培养基还包含200mg/L乙酰丁香酮;任选地,所述预培养基还包含3g/L Phytagel;任选地,所述预培养基的pH值为5.8。

7.如权利要求2所述的培养基组合,其还包括对筛选后的抗草甘膦水稻愈伤组织进行分化培养的分化培养基,其中所述分化培养基包含N6培养基的大量元素、10倍B5培养基的微量元素和50-400mg/L草甘膦;任选地,所述分化培养基还包含250mg/L羧苄青霉素;任选地,所述分化培养基还包含N6培养基的铁盐;任选地,所述分化培养基还包含B5培养基的有机质;任选地,所述分化培养基还包含300-800mg/L脯氨酸;任选地,所述分化培养基还包含800-1000mg/L水解酪蛋白;任选地,所述分化培养基还包含2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤;任选地,所述分化培养基还包含2mg/L 6-糖基氨基嘌呤;任选地,所述分化培养基还包含0.2mg/L萘乙酸;任选地,所述分化培养基还包含0.2mg/L吲哚乙酸;任选地,所述分化培养基还包含20g/L麦芽糖;任选地,所述分化培养基还包含10g/L蔗糖;任选地,所述分化培养基还包含3g/L Phytagel;任选地,所述分化培养基的pH值为6.0。

8.如权利要求2所述的培养基组合,其还包括用于对分化培养获得的再生苗进行生根培养的生根培养基,其中所述生根培养基包含MS培养基的全部成分;任选地,所述生根培养基还包含20g/L蔗糖; 任选地,所述生根培养基还包含3g/L Phytagel;任选地,所述生根培养基的pH值为5.8。

9.抗草甘膦水稻愈伤组织的制备方法,包括以下步骤:

(1)利用包含抗草甘膦基因的农杆菌菌液在悬浮培养基中侵染水稻愈伤组织;

(2)将侵染后的愈伤组织转移到共培养基上进行共培养;

(3)将共培养后的愈伤组织转移到添加了草甘膦的筛选培养基上进行筛选培养,获得抗草甘膦的水稻愈伤组织;

任选地,所述水稻为籼稻;任选地,所述水稻为品种9311和/或品种明恢63;

任选地,所述农杆菌为农杆菌EHA105;任选地,所述抗草甘膦基因为Epsps-CP4基因;任选地,所述农杆菌还包含GFP基因;任选地,所述农杆菌包含与所述Epsps-CP4基因可操作地连接的Ubi启动子;任选地,所述农杆菌包含于所述GFP基因可操作地连接的35S启动子;任选地,其中侵染用农杆菌菌液浓度为OD600=0.05-0.8;任选地,侵染时间为10-15分钟;任选地,所述悬浮培养基为权利要求2所述的培养基组合中的悬浮培养基;

任选地,所述共培养基为权利要求2所述的培养基组合中的共培养基;任选地,所述共培养的条件为20-28℃暗条件下3-4天;

任选地,其中所述筛选培养基为权利要求1所述的筛选培养基;任选地所述筛选培养的条件为28℃暗条件下4-6周;

任选地,所述方法还包括在诱导培养基上诱导水稻愈伤组织;任选地,所述诱导培养基为权利要求4所述的培养基组合中的诱导培养基;任选地,所述诱导培养的条件为28-36℃暗条件下2-4周;

任选地,所述方法还包括将诱导得到的水稻愈伤组织在继代培养基上进行愈伤组织继代培养;任选地,所述诱导培养基为权利要求5所述的培养基组合中的继代培养基;任选地,所述继代培养的条件为28-36℃暗条件,每2周一个继代周期;

任选地,所述方法还包括将继代培养获得的愈伤组织转移到预培 养基上进行预培养;任选地,所述预培养基为权利要求6所述的培养基组合中的预培养基;任选地,所述预培养的条件为28℃暗条件下3-6天。

10.获得抗草甘膦的水稻幼苗的方法,其包括将通过权利要求9的方法获得的抗草甘膦水稻愈伤组织转入分化培养基进行分化培养,获得再生水稻幼苗;任选地,所述分化培养基为权利要求7所述的培养基组合中的分化培养基;任选地,所述分化培养的条件为28℃、16小时光/8小时暗;

任选地所述方法还包括将分化培养获得的再生苗转入生根培养基中培养,获得生根水稻幼苗;任选地,所述生根培养基为权利要求8所述的培养基组合中的生根培养基;任选地,所述生根培养的条件为16小时光/8小时暗的光周期。

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