螺原体病原微生物的PCR快速检测技术的制作方法

本发明涉及病原微生物的分子生物学检测技术领域，尤其是一种螺原体病原微生物的PCR快速检测技术。

背景技术：

螺原体是20世纪70年代发现的寄生于植物和昆虫的病原微生物，近年我们在河蟹和小龙虾体内发现了此病原微生物，用螺原体16S RNA基因的特异性引物在病蟹和病虾体内扩增出271bp条带，经过测序和在GenBank比对，确认它们均为螺原体类微生物。

目前，常规的聚合酶链反应(PCR)检测过程中，通常采用苯酚法或试剂盒进行被检样品的DNA提取，这些方法繁琐、费时，苯酚法需要的样品量大，DNA损耗多，不适宜微量检测及动物的活体血液检测；试剂盒则成本较高，而且使用范围较局限，通常一种试剂盒只能针对一两种不同来源的样品进行模板提取。此外，现有的病原微生物的PCR检测只是能定性，而不能定量。

技术实现要素：

本发明的目的是针对最新发现的水产养殖中的重要微生物病原体——螺原体，建立一种简易、快速、敏感的分子生物学检测技术。本发明还进一步提供了对螺原体病原微生物的PCR半定量快速检测技术。

本发明的技术方案是：

b.用Chelex-100法提取检测样本中的模板DNA；

c.用螺原体的16S rDNA特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)；

d.扩增产物经电泳检测，出现目标电泳条带即可确定检测样本中有螺原体存在，所说的目标电泳条带是指271bp处。

本发明优选的技术方案是，在步骤d后还有步骤e：半定量螺原体浓度，具体是将所说的目标电泳条带与不同梯度的稀释标准样品的电泳条带之亮度进行比较，得到检测样本的螺原体浓度。

本发明中所说的检测样本可以是底泥、分离培养的病原菌、寄主组织(包括肌肉、内脏组织、血液等)。针对不同的检测样本，在提取模板DNA前进行相应地前处理，以达到洗涤和浓综缩的目的，能进一步提高检测效果。

本发明步骤d中所说的电泳检测推荐琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺电泳。

本发明的有益效果是：首先，采用简易、敏感的Chelex-100 DNA提取方法，其成本只有常规提取方法的1/10。其次，该技术的敏感度极高，可以从活体抽取极其微量的血液进行测定，从而实现活体检测的目的，此外，该技术还能从虾蟹栖息的底泥中检测出病原体，可检测出病原体的最低浓度达10^-8(既每毫升体积中一个菌)，敏感度远远大于光镜和电镜等技术。本发明敏感、便捷、快速，成本低，能在2-4小时出明确诊断。该发明不仅可以运用于水产养殖中的螺原体病害的快速检测，还可以运用于任何与螺原体病害相关的检疫和检测。

附图说明

图1是聚丙烯酰胺电泳检测图；

图2是琼脂糖电泳检测图。

具体实施方式

实施例1：检测环境底泥

2004年7月，在安徽全椒一螃蟹颤抖病爆发的池塘里采集底泥样少许，带回检测。具体操作如下：

a)前处理：取约两药匙待测泥样溶于50mL水中数小时，期间搅拌数次，使彻底混匀→定量滤纸过滤，除去泥样残渣→将滤液置于50mL离心管中，12000rpm，4℃，离心1小时→小心的去掉上清，将底部液体移至1.5mLEppendorf管中→8000rpm 4℃，离心1小时→小心移去上层液体，留下层约0.1mL于管中；

b)模板提取：(1)向管中加入5％Chelex-100 150-200μL，剧烈振荡10秒；(2)56℃水浴20分钟，期间混匀数次；(3)取出剧烈振荡10秒，99℃水浴8分钟(严格控制)；(4)取出剧烈振荡10秒后，13000rpm，4℃，离心5分钟；(5)转移上清(DNA模板)至另一支干净的Eppendorf管，-20℃保存，尽快扩增。

c)用螺原体的16S rDNA特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)，反应总体积设为25μL，PCR混合物成分(每管)：去离子水14.85μL；STR 10XBuffer 2.5μL(Mg2+，dNTP，等混合物，购于Promega公司)；两种引物混合物2.5μL(浓度为2μmol/L)，Taq DNA Polymerase(0.75u)0.15μL，模板5μL。循环设置参数为：96℃，2分钟→94℃，1分钟；65℃，1分钟；72℃，1.5分钟(30个循环)→72℃10分钟；

d)聚丙烯酰胺电泳检测：有目标条带(271bp)出现，如图1所示，其中第1道是从泥样中检测出的目标条带(大小271bp)，第2道是实验室纯培养的螺原体中扩增出的条带，M、Marker，从上往下依次为350bp，222bp，179bp。检测到泥样里含有颤抖病的致病菌螺原体；和电镜负染的结果一致。

实施例2：检测分离培养的病原菌

取1mL实验室纯培养的螺原体病原菌培养物，稀释到螺原体浓度为10⁶个/mL，13000rpm，4℃，离心30分钟，去上清；模板提取、PCR反应同实施例1、2％琼脂糖电泳如图2第6道所示。图2中M，Marker，从下往上依次为100bp，200bp，300bp，400bp等，螺原体特异性条带出现在200bp和300bp之间，为271bp。

按上述方法分别检测螺原体浓度为10⁴个/mL、10²个/mL的样本，结果分别如图2第7道和第8道所示。

实施例3：检测寄主血液

2004年夏天高温时，采集患颤抖病的螃蟹数只，

a)前处理：活体抽取其血液约10μL，混于少量PBS(pH＝7.0)中，混匀，移入1.5mL Eppendorf管中。

b)模板提取：(1)向装有样品的管中加入5％Chelex-100 150-200μL，蛋白酶K(终浓度为100μg/mL)混匀；(2)5 6℃水浴1.5-2小时，期间混匀数次；(3)取出剧烈振荡10秒，99℃水浴8分钟(严格控制)；(4)取出剧烈振荡10秒，13000rpm，4℃，离心5分钟；(5)转移上清(DNA模板)至另一支干净的Eppendorf管，-20℃保存，尽快扩增。

c)PCR反应同实施例1，

d)2％琼脂糖电泳检测：有目标条带出现，如图2第1道所示。

e)半定量螺原体浓度：如图1，1道的亮度在6道和7道之间，结果显示螺原体浓度约为10⁵个/mL。和光镜和电镜的观察结果一致。

利用现在市场上广泛使用的华舜提取小量组织、细胞、血液DNA的试剂盒(W6501)，来检测相同螃蟹的血液，如图2中第2道所示，电泳显示没有目标条带出现，说明了这种方法的灵敏性不如本专利的方法，且局限性明显。

实施例4：检测寄主肢肌

取一只患病的螃蟹附肢肌肉少许，置于1.5mL Eppendorf管中，用剪刀尽量剪碎，模板提取、PCR反应、电泳检测与实施例3相同，检测到有目标条带出现，如图2中第3道所示，半定量其螺原体浓度的结果显示病原其浓度大约10⁶个/mL，表明螺原体已侵入肌肉组织，电镜切片也显示肌肉组织中含有较多的螺原体。

利用华舜试剂盒(W6501)从相同螃蟹的肢肌中检测出的螺原体条带，如图2中第4道所示，检测浓度和Chelex-100符合。

实施例5：阴性对照实验

检测样本为健康螃蟹个体的组织、血液，大肠杆菌，人血液分离的白细胞，检测方法与实施例3基本相同，结果均没有出现目标条带，如图1中的第5泳道所示。