本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种托品酰胺人工抗原的制备方法。
背景技术：
托品酰胺(Tropicamide)又称托品卡胺或者托吡卡胺，属于抗胆碱药，有散瞳作用和睫状肌麻醉作用，具有作用快，时间短等优点，为眼科散瞳首选药，用于散瞳检查眼底，验光配镜，治疗虹膜睫状体炎和近视等。化学名为N-乙基-N-(4-吡啶甲基)-alpha-羟甲基-苯乙酰胺，其结构式为：
托品酰胺是一种副交感神经阻断剂，通常用来生产眼药水，但是，近几年，在俄罗斯和意大利，托品酰胺被通过自行静脉注射来达到娱乐的目的。其具有生理依赖性，心里依赖性和耐受性，滥用会导致包括口齿不清，持续性的瞳孔放大，无意识，幻觉，肾疼，烦躁不安，白日梦，过高热，颤抖，自杀倾向，抽搐，精神运动性激动，心动过速和头痛等症状。并且托品酰胺与其他毒品混用，可以增强其药效，所以它也引来了越来越多的吸毒者的青睐，因此必须严格管理。
目前，国内还没有对托品酰胺滥用的报道，因此针对托品酰胺的的检测很少，对于小分子的检测一般主要依靠高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱(GC)，薄层色谱(TLC)，质谱(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质(药物、激素、蛋白质、微生物等)的分析方法,该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的托品酰胺人工抗原的制备方法，制备的托品酰胺人工抗原可用于免疫制备具有特异性的托品酰胺抗体，进一步用于检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种托品酰胺人工抗原的制备方法，所制备的托品酰胺人工抗原可进行动物免疫，取得相应的托品酰胺抗体，可用于各种托品酰胺类免疫分析法的研究，为托品酰胺的检测提供更加方便快速准确的途径。
一种托品酰胺人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备人工半抗原：
(a)将托品酰胺与丁二酸酐以摩尔比为1:1.5加入单口圆底烧瓶中，用吡啶溶解，100℃油浴下，搅拌回流20小时；结束反应，冷却至室温，减压转干，并用少量乙醇共沸，浓缩后，经薄层色谱法分离得微黄色固体产物Ⅰ；薄层层析：层析液以体积比计为95％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.3；
(b)将产物Ⅰ与甘氨酸乙酯盐酸盐和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐以摩尔比为1:1.15:2溶于吡啶中，氮气气氛中，室温搅拌反应18小时；反应结束，转干，用少量乙醇共沸，得到的残渣加入PBS，用氯仿萃取两次，得到的有机相再用双蒸水洗，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状物Ⅱ；薄层层析：层析液以体积比计为95％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.7；
(c)将黄色油状物Ⅱ溶于四氢呋喃和甲醇中，加入1N的氢氧化钠水溶液，室温搅拌反应4小时；结束反应，蒸干溶剂，用1N的盐酸调pH＝3，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状残渣，经薄层色谱分离得黄色油状物Ⅲ即托品酰胺半抗原；薄层层析：层析液以体积比计为95％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.2；
(2)制备托品酰胺人工抗原：
(d)将托品酰胺半抗原Ⅲ溶于N,N-二甲基甲酰胺，随后加入三乙胺和氯甲酸乙丁酯，室温避光搅拌反应15小时，形成溶液A；
(e)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；
(f)将牛丙种球蛋白溶于PBS缓冲液中，浓度为5mg/ml，形成B液；
(g)将溶液A缓慢逐滴滴加到溶液B中，边滴边搅拌，A液与B液的体积比为1:5，室温搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(h)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：托品酰胺-牛丙种球蛋白。
由于托品酰胺的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必须将其与大分子载体比如牛丙种球蛋白连接形成托品酰胺抗原后，才能刺激机体产生相应的托品酰胺抗体。本发明在制备托品酰胺人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在托品酰胺半抗原和牛丙种球蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的托品酰胺人工抗原保持了托品酰胺的结构特异性，有利于相应托品酰胺抗体的产生。
本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以托品酰胺与丁二酸酐进行酰化反应得到含羧基的化合物，该化合物和甘氨酸乙酯盐酸盐经缩合反应和水解反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过混合酸酐法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备托品酰胺的人工抗原即托品酰胺-牛丙种球蛋白。其反应方程式如下：
本发明制备得到的托品酰胺人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制托品酰胺半抗原浓度为0,5,10,20,30,40μg/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知托品酰胺半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε＝吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε＝4816.39L/mol。
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0,20,40,60,80，100,120,160,200μg/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655nm处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得托品酰胺抗原的蛋白浓度为2.78mg/ml。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100μg/ml，在276nm处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1,A2,则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000)，本发明计算得γ≈25。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol),150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10-3为牛丙种球蛋白浓度(g/L)。
本发明的有益效果：本发明合成了托品酰胺的人工抗原，合成工艺先进，特异性强，得到的托品酰胺人工抗原用于免疫Balb/c小鼠，检测结果表明，托品酰胺人工抗原的免疫腹水的效价为1：92000，完全可用于免疫分析中，为托品酰胺的检测提供更加方便快速准确的途径。
附图说明
图1是托品酰胺人工半抗原的液相色谱图。
图2是托品酰胺人工半抗原的质谱图。
图3是托品酰胺人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
托品酰胺人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以托品酰胺与丁二酸酐进行酰化反应得到含羧基的化合物，该化合物和甘氨酸乙酯盐酸盐经缩合反应和水解反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过混合酸酐法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备托品酰胺的人工抗原即托品酰胺-牛丙种球蛋白。
实施例1
(1)人工半抗原的制备：
(a)将托品酰胺200mg(0.703mmol)与丁二酸酐106mg(1.06mmol)加入50ml单口圆底烧瓶中，用10ml吡啶溶解，100℃油浴下搅拌回流20小时；结束反应，冷却至室温，减压转干，并用10ml乙醇共沸，浓缩后，经薄层色谱法分离得微黄色固体产物Ⅰ224mg；薄层层析：层析液以体积比计为95％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.3。
(b)将产物Ⅰ224mg(0.583mmol)溶于10ml吡啶中，分别加入甘氨酸乙酯盐酸盐94mg(0.67mmol)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐224mg(1.166mmol)，氮气气氛中，室温搅拌反应18小时；反应结束，将溶剂转干，用12ml乙醇共沸，得到的残渣加入20mlPBS，用3*20ml氯仿萃取，得到的有机相再用30ml双蒸水洗，合并有机相并用0.6g无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状物Ⅱ188mg；薄层层析：层析液以体积比计为95％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.7。
(c)将黄色油状物Ⅱ188mg(0.4mmol)溶于4.5ml四氢呋喃和6.3ml甲醇中，加入7.8ml1N的氢氧化钠水溶液，室温搅拌反应4小时；结束反应，蒸干有机溶剂，用1N的盐酸调pH＝3，用3*25ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，用0.8g无水硫酸镁干燥，过滤，转干得黄色油状残渣，再经薄层色谱分离得黄色油状物Ⅲ173mg即托品酰胺半抗原；薄层层析：层析液以体积比计为95％乙醇:1,4-二氧六环:二氯甲烷:氨水＝8:1:10:1，产物Rf＝0.2；图1是托品酰胺人工半抗原的液相色谱图，图2是托品酰胺人工半抗原的质谱图。
(2)托品酰胺人工抗原的制备：
(d)将托品酰胺半抗原Ⅲ173mg(0.392mmol)溶于8.65mlN,N-二甲基甲酰胺，随后加入0.26ml三乙胺和0.17ml氯甲酸乙丁酯，室温避光搅拌反应15小时，形成溶液A。
(e)称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。
(f)称取牛丙种球蛋白230mg溶于46mlPBS缓冲液中，浓度为5mg/ml，形成B液。
(g)将溶液A缓慢逐滴滴加到溶液B中，边滴边搅拌，室温搅拌反应0.5小时，得到的混合液在4℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
(h)将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述PBS缓冲液透析7次，每次3小时，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：托品酰胺-牛丙种球蛋白。图3是托品酰胺人工抗原制备前后的紫外扫描图。
(3)托品酰胺人工抗原的鉴定：
偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率)的方法虽然很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱图迭加的性质。
摩尔吸收系数ε：配制托品酰胺半抗原浓度为0,5,10,20,30,40μg/ml的PBS溶液，通过紫外扫面图可知托品酰胺半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为ε＝吸光值/摩尔浓度。本发明计算得ε＝4816.39L/mol。
偶联物蛋白浓度的测定：配制浓度为0,20,40,60,80，100,120,160,200μg/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液1ml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30℃水浴温热5分钟，每个浓度做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例吸收，在655nm处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计算得托品酰胺抗原的蛋白浓度为2.78mg/ml。
偶联比测定：配制100μg/ml的牛丙种球蛋白PBS溶液，将偶联物用PBS稀释到100μg/ml，在276nm处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1,A2,则偶联比率γ为：γ＝[(A1－A2)/ε]/(100×10-3/150000),本发明计算得γ≈25。
其中ε为摩尔吸光系数(L/mol),150000为牛丙种球蛋白的分子量，100×10-3为牛丙种球蛋白浓度(g/L)。