本发明涉及医学生物工程技术领域，具体涉及一种抗Rfx2单克隆抗体，以及该单克隆抗体在用于抗白念珠菌感染中的应用。
背景技术：
RFX2基因编码一个含有RFX结构域的转录因子。RFX是真核生物中保守的DNA结合域。RFX2基因可以调节菌丝的生长和粘附；在启动子Wor1p的作用下，RFX2在不透明的白念珠菌细胞优先表达。RFX2基因缺失菌毒性降低，在口腔念珠菌感染小鼠实验中，缺失菌感染小鼠菌落富集量比野生型型菌株组显著减少。因此，Rfx2蛋白是一个很有前景的基于抗体治疗的抗真菌靶标。
目前尚无有关抗Rfx2单克隆抗体的文献报道，也无抗Rfx2单克隆抗体用于抗侵袭性念珠菌的感染的文献报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种抗白念珠菌蛋白Rfx2单克隆抗体、用于制备该单克隆抗体的多肽、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该单克隆抗体的应用。
本发明的第一方面，是提供一种用于制备抗白念珠菌蛋白(Rfx2)单克隆抗体的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的。
ATTGSTPRRG(SEQ ID NO：1)
本发明的第二方面，是提供一种抗Rfx2单克隆抗体，是由保藏编号为CCTCC No：C201483的杂交瘤细胞株分泌产生。
本发明的第三方面，是提供两株杂交瘤细胞株，其保藏编号为CCTCC No：C201483。
本发明的第四方面，是提供一种抗Rfx2单克隆抗体的制备方法，该方法的步骤如下：
a)合成氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽；
b)将上述多肽导入表达载体，表达并纯化，作为免疫原免疫小鼠；
c)取免疫鼠的脾细胞融合；
d)经多轮筛选出合成多肽反应阳性的细胞克隆，作为抗Rfx2单克隆抗体的杂交瘤细胞株CCTCC No：C201483；
e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗Rfx2单克隆抗体。
本发明的第五方面，是提供上述的用于制备抗Rfx2单克隆抗体的多肽在制备Western Blot或免疫组化检测白念珠菌感染的试剂或试剂盒中的应用。
以及，上述的抗Rfx2单克隆抗体在制备Western Blot或免疫组化检测白念珠菌感染的试剂或试剂盒中的应用。
以及，上述的杂交瘤细胞株在制备Western Blot或免疫组化检测白念珠菌感染的试剂或试剂盒中的应用。
进一步地，本发明还提供了上述的用于制备抗Rfx2单克隆抗体的多肽在制备预防或治疗白念珠菌感染药物中的应用。
以及，上述的抗Rfx2单克隆抗体在制备预防或治疗白念珠菌感染药物中的应用。
以及，上述的杂交瘤细胞株在制备预防或治疗白念珠菌感染药物中的应用。
本发明的具体技术方案如下：
1.针对抗Rfx2的编码框氨基酸全序列(GENBANK ID：3635658)设计并合成16个多肽，序列分别为：
多肽1 DPTTNSELKS(SEQ ID NO：2)
多肽2 SQQTQSNSQS(SEQ ID NO：3)
多肽3 FQQSETGVDD(SEQ ID NO：4)
多肽4 IKTEPVAGNP(SEQ ID NO：5)
多肽5 KRLGSRGESK(SEQ ID NO：6)
多肽6 LSHKRTSSKQ(SEQ ID NO：7)
多肽7 YPSASNTRNE(SEQ ID NO：8)
多肽8 SSLLSTTGGK(SEQ ID NO：9)
多肽9 FPNMEDKDNK(SEQ ID NO：10)
多肽10 ATTGSTPRRG(SEQ ID NO：1)
多肽11 VSALRQHQKN(SEQ ID NO：11)
多肽12 VNAENKRGNE(SEQ ID NO：12)
多肽13 LSPEPVSTGN(SEQ ID NO：13)
多肽14 LSHESHSVHT(SEQ ID NO：14)
多肽15 SGNNSSQLQS(SEQ ID NO：15)
多肽16 LHDTQPLTQQ(SEQ ID NO：16)
将上述多肽分别导入表达载体。
2.阳性克隆的鉴定，提取及表达菌转化。
3.大量诱导表达生产。
4.Ni柱亲和纯化，经过纯化，得到蛋白抗原用于免疫。
5.将成功获得的抗原混合免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，将3只小鼠的脾脏混合进行融合。
6.经多轮筛选出反应阳性的细胞克隆，作为抗鼠抗Rfx2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株5163-1RE-4M1234/4L17_111016。
7.通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗鼠抗Rfx2的单克隆抗体。
本发明提供了抗Rfx2的单克隆抗体，该单克隆抗体识别Rfx2蛋白氨基酸序列ATTGSTPRRG。这条多肽是上述的16条多肽表达纯化后免疫，最终选择到的产生效价比较高的抗体所针对的抗原表位。
本发明的单克隆抗体的获得采用了本技术领域常规的方法，即通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞并产生腹水抗体，取出腹水经纯化而得到。
本发明所制备的单克隆抗体是一种免疫球蛋白，可特异性结合白念珠菌的蛋白。
本发明还提供了上述抗Rfx2的单克隆抗体、杂交瘤细胞株在检测白念珠菌中的应用，具体是指在制备Western Blot或免疫组化检测试剂或试剂盒中的应用。本发明为抗Rfx2的临床抗真菌感染免疫治疗应用提供了新的思路。
附图说明
图1是单克隆抗体Western Blot检测白念珠菌蛋白的图。
图2是免疫荧光检测图，其中A是单克隆抗体免疫荧光检测与白念珠菌酵母态细胞结合的图；B是单克隆抗体免疫荧光检测与白念珠菌菌丝态结合的图。
图3是用ELISA法检测抗Rfx2单抗与真菌活细胞及细胞壁蛋白及细胞质蛋白的结合曲线图
图4是白念珠菌以1×105cells/鼠攻击剂量下，给予不同剂量单克隆抗体的保护作用图。
图5是白念珠菌以1×105cells/鼠攻击剂量下，给予1mg/kg单克隆抗体两次，对系统性白念珠菌感染保护的图。其中，A是小鼠存活率曲线；B是攻击后第60天小鼠肾脏载菌量。
本发明的杂交瘤细胞株，命名为5163-1RE-4M1234/4L17_111016，保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉 武汉大学）(简称CCTCC)，保藏日期2014年6月17日，保藏编号CCTCC No：C201483。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1.抗Rfx2的单克隆抗体的多肽序列选择和多肽的制备
多肽序列的选择
Rfx2蛋白有1111个氨基酸(GENBANK ID：3635658)，根据其氨基酸序列信息委托艾比玛特生物医药(上海)有限公司设计、筛选并合成了多肽序列用于多肽合成：ATTGSTPRRG
实施例2.抗Rfx2的单克隆抗体的制备和纯化
委托艾比玛特生物医药(上海)有限公司开展单抗的制备与纯化。
1.抗原的生产
多肽的全基因合成，基因序列参考白念珠菌基因数据库(Candida Genome Database)。表达载体构建；阳性克隆鉴定；阳性克隆质粒提取及表达菌转化；大量诱导表达生产；Ni柱亲和纯化；经过纯化，得到蛋白抗原用于免疫。
2.单克隆抗体的制备和纯化
将成功获得的抗原混合免疫鼠龄为8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，将3只小鼠的脾脏混合进行融合。
免疫反应最好的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，融合后的细胞经过适当稀释，分置于96孔培养板中培养，培养10-14天进行ELISA检测，挑选OD值高的孔中的细胞进行有限稀释法亚克隆。
具体方法如下：将有限稀释的细胞培养至96孔板中，待克隆生长到全孔的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔板中如上法所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100％，我们即认为此为单克隆。即我们通常认为的建株成功的细胞株。将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1-2×106/管进行冻存。同时收集细胞安排腹水制备。
细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10-14天收集腹水，ELISA检测腹水是否制备成功。腹水完成后采用Protein G柱纯化腹水。
实施例3.抗Rfx2的单克隆抗体的鉴定和检测应用
1.单克隆抗体的Western Blot检测应用
变性的白念珠菌细胞壁蛋白样品进行SDS-PAGE蛋白电泳；电泳结束后，进行半干法转膜。加封闭液于室温封闭至少1h；PBST洗液洗膜5次，用单克隆抗体作为一抗，4℃孵育过夜；孵育结束后用PBST洗液洗膜5次，加二抗DYLightTM800-Labeled Antibody to Mouse IgG(H+L)1:10000稀释后室温孵育2h，孵育过程中轻微的振荡；用PBST洗液洗膜5次，NC膜用Odyssey红外成像系统扫描。结果见图1。结果表明该单克隆抗体能较为特异地识别白念珠菌的细胞壁蛋白。
2单克隆抗体的免疫荧光检测应用
调整真菌酵母态细胞及菌丝态细胞浓度至一定浓度，PBS清洗3次，弃上清，加入1％BSA溶液1ml，室温封闭1h。离心弃上清，PBS洗3次。加入抗Rfx2抗体(用PBS稀释)，对照组加入PBS。在垂直旋转仪上，4℃孵育2h。离心弃上清，PBS洗3次。加入FITC标记的荧光二抗，4℃孵育1h。离心弃上清，PBS洗3遍，PBS重悬。取7μl菌液滴于载玻片上，用激光共聚焦显微镜在488nm激发光下观察荧光。图2.A是单克隆抗体免疫荧光检测与白念珠菌酵母态细胞结合的图，B是单克隆抗体免疫荧光检测与白念珠菌菌丝态细胞结合的图
结果表明，该单克隆抗体能较为特异地识别白念珠菌。
3单克隆抗体的ELISA检测应用
96孔酶联板每孔接种0.5μg白念珠菌SC5314细胞壁提取蛋白，或接种1×106cells/ml的白念珠菌活细胞，4℃包被过夜，用PBST洗3遍，每次5min，用封闭液封闭，每孔200μl，37℃孵育2h；PBST洗3次，每次5min；加入不同稀释度的抗Rfx2抗体100μl，抗体myc作为阴性对照，37℃孵育2h；PBST洗3次，每次5min；分别加入HRP conjugated的二抗IgG100μl,37℃孵育1h；PBST洗5次，每次5min；200μl的TMB，室温避光显色10min，370nm处测其吸光度表明；50μl的2M H2SO4终止反应，在450nm处测其吸光度。结果见图3.表明用ELISA抗Rfx2单抗与白念珠菌活细胞及细胞壁蛋白及细胞质蛋白的结合。
实施例4.抗Rfx2单克隆抗体针对白念珠菌感染的的保护
1)将Rfx2抗体以1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg预保护，2h后分别给予白念珠菌SC53141×105cells/只攻击小鼠，40d后小鼠存活率分别为40％、40％、40％、60％，结果见图4。结果表明，Rfx2抗体对侵袭性念珠菌感染小鼠具有一定保护作用。
2)将抗体以1mg/kg预保护，2h后给予白念珠菌SC53141×105/只攻击小鼠，5d后再次1mg/kg保护，60d后，小鼠存活率40％，结果见图5A。结果表明，多次给予抗体能提高感染小鼠存活率。第60d后，小鼠脱臼处死，各组小鼠肾脏菌落富集菌落数如下图5B。结果表明，Rfx2抗体对侵袭性念珠菌感染小鼠的肾脏富集菌落有显著的清除作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。