一种调控两种细胞间距离的方法与流程

本发明涉细胞、材料等领域，是一种调控两种细胞间距离的方法。

背景技术：

在体内，组织的形成及其功能发挥都依赖于不同类型细胞间的相互作用。细胞之间的相互作用是通过细胞之间的相互接触和可溶性因子相互交换(旁分泌作用)介导的，其作用机制非常复杂，精细的调控机制能使“信号”在合适的时间合适的地点发挥作用[Bhatia SN,Balis UJ,Yarmush ML,Toner M.Effect of cell-cell interactions in preservation of cellular phenotype:cocultivation of hepatocytes and nonparenchymal cells.Faseb Journal.1999；13:1883-900.]。目前越来越多的研究发现在不同的时间和空间状态下，细胞之间的相互作用呈现不同的作用模式。当距离较近时，两种细胞之间既存在细胞之间相互接触介导的通讯，又存在旁分泌作用，因此目的细胞的功能[Hui EE,Bhatia SN.Micromechanical control of cell-cell interactions.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2007；104:5722-6.]、干细胞特性维持[Kim S,Ahn SE,Lee JH,Lim D-S,Kim K-S,Chung H-M,et al.A novel culture technique for human embryonic stem cells using porous membranes.Stem Cells.2007；25:2601-9.]和增殖[Kawada H,Ando K,Tsuji T,Shimakura Y,Nakmura Y,Chargui J,et al.Rapid ex vivo expansion of human umbilical cord hematopoietic progenitors using a novel culture system.Experimental Hematology.1999；27:904-15.]、分化能力等非常好；当距离较远时，两者之间只存在旁分泌，没有细胞之间相互接触进行的通讯，因此效果非常差；而对于不同类型的细胞，两种细胞之间的作用距离是不同的。因此，在体外研究不同类型细胞之间的作用距离在免疫学、发育生物学、神经科学和肿瘤转移研究中具有广阔的应用前景。

目前，调控两种细胞间距离的方法主要借助于商业化的带有多孔膜(transwell膜)的transwell小室实现。Transwell膜是固态多孔膜，材质主要 为聚酯(PET)和聚碳酸酯(PC)，膜厚为10μm左右[Kim MY,Li DJ,Pham LK,Wong BG,Hui EE.Microfabri cation of high-resolution porous membranes for cell culture.Journal of Membrane Science.2014；452:460-9.]。如果将两种细胞直接混合在一起，可认为两种细胞间距离为0μm(图1C)。若将一种细胞接种在培养板底部，另外一种细胞接种在transwell膜上(图1B)，两种细胞间的距离是transwell膜与培养板的距离，为1mm左右。如果将一种细胞接种在transwell膜正面，另外一种细胞接种在transwell膜的背面(图1A)，两种细胞间的距离是多孔膜的膜厚，为10μm。利用transwell膜调控两种细胞间的距离，存在以下几方面问题：一是细胞间距离的调控能力有限，仅为10μm和1mm；二是在培养板或凝胶膜上培养的细胞处于2D的生长方式。因此，急需研发一种可连续调控细胞之间距离的方法。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提出一种新型的可连续调控两种细胞之间距离的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

将一种细胞与含聚阴离子或聚阳离子聚合物溶液混合均匀后，加入到圆形玻片表面制备平板凝胶；然后将平板凝胶浸入到含聚阳离子或聚阴离子的聚合物溶液中反应得到聚电解质水凝胶膜；再将另外一种细胞接种在凝胶膜表面。

所述的平板凝胶为海藻酸钙凝胶、壳聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、胶原凝胶、透明质酸凝胶及硫酸纤维素凝胶中的一种或二种以上；

所述的海藻酸或壳聚糖包括经过细胞外基质主要成分来源的多肽及半乳糖基团化学修饰的海藻酸钠或壳聚糖；其中多肽包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)、苏氨酸-苏氨酸-丝氨酸-色氨酸-丝氨酸-谷酰胺(TTSWSQ)、缬氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-缬氨酸-亮氨酸-赖氨酸(VFDNFVLK)、苏氨酸-谷氨酸-天冬酰胺(TEN)中的一种或二种以上。

所述聚电解质水凝胶平板膜中的含聚阴离子的聚合物为海藻酸盐、透明质酸盐及纤维素硫酸盐、及上述聚阴离子的共聚物中的一种或二种以上，分子量在1kDa-2000kDa；

所述聚电解质水凝胶平板膜中的含聚阳离子的聚合物为壳聚糖及其衍生物，α或ε聚赖氨酸，聚鸟氨酸、聚精氨酸，聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亚胺及其衍生物中的一种或二种以上，分子量在1kDa-500kDa。

所述聚电解质水凝胶平板膜是通过聚阴离子聚合物与聚阳离子聚合物通过静电作用形成的。

所述步骤1)聚合物溶液还含有一定质量浓度(1mg/mL～6mg/mL)的细胞外基质主要成分，细胞外基质主要成分为胶原、弹性蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、Matrigel基质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素和硫酸角质素中的一种或两种以上。

所述水凝胶或凝胶膜的厚度在2μm-1000μm。

所述两种不同种类的细胞包括下述组合之一，多来源干细胞和多来源体细胞之间，多来源干细胞和转基因细胞或细胞系之间；不同种类多来源体细胞自身之间；多来源体细胞和转基因细胞或细胞系之间的共培养。

所述多来源干细胞，包括胚胎干细胞或成体细胞；多来源体细胞是指从动物或人的各种组织中通过分离、培养而得到的已分化成熟的细胞；转基因细胞是指导入了人工修饰基因的细胞，该细胞能够表达所修饰基因的特定功能；细胞系是指通过选择法或克隆形成法获得的具有特殊性质或标志物的永生化细胞。

所述两种细胞间距离在2μm-1000μm。

本发明具有如下优点：

1、成本低，避免使用昂贵材料和工艺；

2、聚阴离子(或聚阳离子)聚合物溶液或(/和)细胞外基质主要成分形成凝胶中的细胞处于三维的生长方式，可更好模拟体内细胞生长方式，从而能更好模拟体内细胞之间相互作用；

3、通过聚电解质络合形成的水凝胶膜理论上可实现膜厚的连续可控，可用于研究细胞间距离对共培养体系中细胞相互作用的影响。

附图说明

图1为Transwell膜调控两种细胞间距离的示意图。(A)细胞之间距离为transwell膜的膜厚，10μm；(B)细胞之间距离为transwell膜与培养板之间的距离，1mm左右；(C)两种细胞直接混合在培养板上，可认为细胞间距离 为0μm。

图2为用于调控细胞间距离的胶原/海藻酸钙-壳聚糖凝胶膜制备流程图。

图3为细胞之间距离对肝细胞功能的影响。(A)细胞间距离对肝细胞白蛋白分泌的影响；(B)细胞间距离对肝细胞尿素合成的影响。

具体实施方式

实施例1：一种调控肝细胞和成纤维细胞细胞间距离的方法

将15mg/mL的海藻酸钠溶液和3.6mg/ml胶原溶液按照体积比1：2进行混合均匀，使得海藻酸钠和胶原溶液的终浓度分别为5mg/mL和2.4mg/mL。再将人源成纤维细胞与已混匀的海藻酸钠和胶原溶液混合，调整细胞密度为2×10⁶cells/mL。将该细胞混悬液300μl缓慢加入到放在细胞培养板中的直径为3cm的圆形玻片上，放入细胞培养箱中2h，使得胶原凝胶化。再将1mL 100mM CaCl₂溶液加入到细胞培养板中，钙化20min，海藻酸钠与Ca²⁺螯合形成海藻酸钙凝胶，最终得到胶原/海藻酸钙凝胶。然后，加入1.5mg/mL壳聚糖(分子量65kDa，脱乙酰度90％)溶液，通过控制反应时间，可得到厚度为2μm，10μm，30μm和50μm的凝胶膜。再将其放入细胞培养箱中，采用成纤维细胞自身培养基培养1d后，将从大鼠肝脏分离的肝细胞分别接种在不同厚度的凝胶膜表面，进行共培养，制备过程见图2。其中，阳性对照组为将成纤维细胞和原代肝细胞接种在凝胶膜表面，两种细胞之间存在相互接触；阴性对照组为将已混入成纤维细胞的海藻酸钠和胶原混合液置于transwell膜上形成凝胶，再将原代肝细胞接种在平板凝胶膜上，两种细胞之间没有相互接触。每天进行换液，并对培养板中的培养基进行收集，用于测定白蛋白和尿素浓度。以白蛋白和尿素为考察指标，考察在不同细胞间距离，肝细胞的功能。实验结果见图3，结果显示，两种细胞间距离为2μm，10μm和30μm时，白蛋白分泌量和尿素合成量基本相同；与阳性对照组相比，当两种细胞间距离为2μm，10μm和30μm时，白蛋白分泌量和尿素合成量均没有显著性差异；各组均优于50μm组。这说明肝细胞功能的维持需要肝细胞和成纤维细胞之间的相互接触。为维持肝细胞的功能，两种细胞之间的距离需在30μm以内。

实施例2：一种调控人源胚胎干细胞(hES)和成纤维细胞细胞间距离的方法

首先，制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰的海藻酸钠。将海藻酸 钠(分子量430kDa，古罗糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)溶解于含有0.5M NaCl的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中(pH值6.5)，得到1％(W/V)海藻酸钠溶液。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)和RGD多肽，室温搅拌反应24小时。EDC和海藻酸钠摩尔比为1:20，EDC和sulfo-NHS摩尔比为2:1，RGD和海藻酸钠质量比为1:1000。然后进行透析并冷冻干燥，从而得到RGD修饰的海藻酸钠。

之后，称取5mg RGD修饰的海藻酸钠，将其溶于100mL生理盐水中，制备浓度为0.5mg/mL的海藻酸钠溶液。再将小鼠成纤维细胞与已制备的海藻酸钠溶液混合，调整细胞密度为2×10⁶cells/mL。将该细胞混悬液300μl缓慢加入到放在细胞培养板中的直径为3cm的圆形玻片上，静置5分钟，再将其浸于100mM CaCl₂溶液中，钙化20min，形成平板RGD修饰的海藻酸钙凝胶。然后，加入1.5mg/mL壳聚糖(分子量65kDa，脱乙酰度90％)溶液，通过控制反应时间，可得到厚度为2μm，30μm和50μm的凝胶膜。再将其放入细胞培养箱中，采用成纤维细胞自身培养基培养1d后，再将人源胚胎干细胞接种在不同厚度的凝胶膜表面，进行共培养。阴性对照组为将已混入成纤维细胞的海藻酸钠溶液置于transwell膜上形成凝胶，再将胚胎干细胞接种在平板凝胶膜上，两种细胞之间没有相互接触。每天进行换液，培养7d后，免疫荧光考察胚胎干细胞未分化标志物Oct4，SSEA-4,TRA-1-81和碱性磷酸酶(ALP)表达情况。另外，消化凝胶膜表面的胚胎干细胞并收集RNA，检测胚胎干细胞未分化基因Oct4，SSEA-4,TRA-1-81和碱性磷酸酶(ALP)基因表达情况。扫描电镜观察两种细胞间是否存在相互接触。RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果表明，当两种细胞间距离为2μm和10μm时，胚胎干细胞均表达Oct4，SSEA-4,TRA-1-81和碱性磷酸酶(ALP)且上述基因表达量没有显著性差异，而两种细胞间距离为30μm组及阴性对照组，胚胎干细胞不表达上述未分化基因。免疫荧光结果显示，当两种细胞间距离为2μm和10μm时，胚胎干细胞均表达Oct4，SSEA-4,TRA-1-81和碱性磷酸酶(ALP)相关标志物，与基因结果一致。扫描电镜结果显示，当两种细胞间距离为10μm时，两种细胞间存在细胞伪足的相互接触；当两种细胞间距离为30μm时，两种细胞间没有相互接触。这说明人源胚胎干细胞特性的维持需要胚胎干细胞和成 纤维细胞之间的相互接触。为维持胚胎干细胞特性，两种细胞之间的距离需在10μm以内。