灌注生物反应器平台的制作方法

本公开要求于2014年10月29日提交的美国临时申请系列号62/072039的优先权，该申请通过引用全文纳入本文。

本公开涉及用于培养细胞的设备、系统和方法。

技术背景

可保持的活细胞密度(vcd)决定生物反应器容器的生产能力和成本的一个主要变量。在生物反应器中，实现最高的可能vcd的一个限制是随着袋子越摇越快或为了适应培养物中的细胞高密度而提高了的营养物和气体交换要求而提高叶轮转速时细胞所经历的剪切力。另外，对于以附着依赖性细胞为产品的应用，例如对于生产用于筛选、细胞疗法或可再生医疗应用的细胞，可能难以从反应器中收获细胞。

近年来，一直致力于在稳定的状态下以连续灌注的模式运行生物反应器，以尝试大大降低生产成本，同时保持自动化工艺中的一贯品质。虽然该方法显示是保持高细胞密度的一种有效方法，但其在商业生产治疗性蛋白质的适应性上存在困难。一种风险是一段延续时间培养后表达水平的不稳定，会随时间选择显示最快速的生长潜能的细胞，而不是那些表达感兴趣蛋白质的细胞。

因此，需要能够提供提高感兴趣细胞的稳定性、方便收获附着依赖性细胞、或者提高活细胞密度中一种或多种特点的新颖细胞培养设备。

发明概述

根据本公开的各种实施方式，描述了具有一个或多个可堆叠的板材的细胞培养设备。这些板材具有确定结构化表面的主表面。结构化表面确定多个孔，可在这些孔中培养细胞。这些孔可具有微米尺度的尺寸，且可配置成促进球状细胞簇的形成。本文所述的设备还具有多个间隔物以保持堆叠板材之间的空间。在一些实施方式中，这些间隔物包括从主表面沿着板材长度延伸的分隔轨道。多个流动通道在相邻板材和/或轨道之间形成，用以灌注细胞培养介质。结构化表面可承载细胞密度很高的细胞生长，所述细胞生长可通过球体形成而得到增强。球体形成还应当增强细胞的功能稳定性，因为相对于单层中生长的细胞，球状体能够保持表示更好的类活体内反馈的分化细胞功能。在一些实施方式中，培养细胞的孔不粘附细胞，这能够有助于细胞的收获。在本文所述的各种实施方式中，将设备设计成允许代谢气体被动扩散，这能够允许更低的介质灌注速率，从而使被培养的细胞经历更小的剪切。

在各种实施方式中，本公开描述了一种细胞培养设备。细胞培养设备包含一个或多个具有第一主表面和相对的第二主表面的板材。第一主表面包含确定多个孔的结构化表面。各孔具有确定上开口和最低点的内表面，且各孔的上开口的直径尺寸在200微米～500微米范围内，或者在100微米～2000微米的范围内。该设备还包含多个从第一主表面沿第一主表面的长度延伸的分隔轨道(间隔物)，多个流动通道确定于相邻轨道之间。

在一些实施方式中，本文提供了用于生产蛋白质(例如诸如治疗性抗体或抗体片段的治疗性蛋白质)的方法，该方法包括：a)在本文所述的细胞培养设备的孔中培养表达蛋白质的细胞；以及b)从细胞分离蛋白质。

在一些实施方式中，孔(例如微孔)具有接近正弦波的截面形状。在这些实施方式中，孔的底部是圆形(例如半球状圆形)，侧壁的直径从孔的底部向顶部增加，且孔之间的边界也是圆形的。因此，孔的顶部不以直角终止。在一些实施方式中，孔在底部与顶部的中点具有直径d(也称为d半高)、在孔的顶部具有直径d顶部，且从孔的底部至顶部的高度为h。在这些实施方式中，d顶部大于d。其他实施方式示于图15，其中，孔的宽度大于连续孔之间的屏障宽度。这种实施方式允许在培养表面的给定区域内存在大量的孔。

在以下的详细描述中提出了本

技术实现要素：
的附加特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言根据所作描述即容易理解，或者通过实施包括以下详细描述、权利要求书以及附图在内的本文所述的本发明内容而被认识。

应理解，前面的一般性描述和以下的详细描述给出了本发明内容的实施方式，用来提供理解要求保护的本发明内容的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对本发明的主题的进一步理解，附图并入本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本发明的主题的各种实施方式，并与说明书一起对本发明的主题的原理和操作进行阐述。此外，附图和说明书仅仅是示例性的，并不试图以任意方式限制权利要求的范围。

附图的简要说明

当结合以下附图阅读时，能对本发明下文的具体实施方式的详细描述有最好的理解，附图中相同的结构用相同的附图标记表示，其中：

图1是具有结构化表面的基材的一种实施方式的示意性的侧视图，所述结构化表面具有用于培养细胞的孔。

图2是结构化表面的孔的一种实施方式的示意性横截面图。

图3是结构化表面的孔的一种实施方式的示意性横截面图。

图4是具有结构化表面的基材的一种实施方式的图像。

图5是在结构化表面的一种实施方式的孔中生长的细胞的示意性俯视图。

图6a～c是板材和轨道实施方式的示意性透视图。

图7是细胞培养设备的一种实施方式的示意性横截面图。

图8是细胞培养设备的一种实施方式的示意性侧视图。

图9a～b是歧管(9a)和扩张器扩张器(9b)的一种实施方式的一个面的示意图。

图10a～b是以批处理模式(10a)和连续模式(10b)运行的系统的一个实施方式的示意图。

图11a～b是孔的实施方式的示意性截面视图。

图12是板材和轨道的堆叠单元的实施方式的示意性截面视图。

图13是板材和轨道的堆叠单元的实施方式的示意性剖切透视图。

图14是细胞培养设备的一种实施方式的示意性侧视图。

图15a显示了一种细胞培养设备600的示意性的剖切透视图，其中，孔由可透气材料形成。在这种示例性的实施方式中，介质经由入口625进入设备的一端，在(经由出口635)离开之前循环通过整个设备，逆流通过各腔室。图15b显示了一种用于控制流体通过图15a所示的细胞培养设备的系统。

图16a显示了一种细胞培养设备600的示意性的剖切透视图，其中，孔由可透气材料形成。在这种示例性的实施方式中，介质经由入口625进入，并且(经由入口歧管620)向所有区室分布，然后经由依附于出口635的出口歧管630离开相反端。图16b显示了一种用于控制流体通过图16a所示的细胞培养设备的系统。

图17a和b是孔100阵列的一种示例性实施方式的示意图。图17a是其剖面图。图17b是孔阵列的示例性实施方式的从图17a的线b-b截取的俯视图。

图18a和b是孔100阵列的另一种示例性实施方式的示意图。图18a是其剖面图。图18b是孔阵列的示例性实施方式的从图18a的线b-b截取的俯视图。

图19a～c是孔100的阵列的另一种示例性实施方式的示意图。图19a是其剖面图。图19b是孔的阵列的示例性实施方式的从图19a的线b-b截取的俯视图。图19c是具有正弦曲线或抛物线形状的孔的阵列的图。

发明详述

下面将对本发明的主题的各种实施方式进行更详细的描述，其中的一些实施方式例示于附图中。附图中所使用的相同的编号表示相同的组件、步骤等。然而，应当理解的是，使用数字表示给定附图中的组件并非旨在对另一幅附图中标有相同数字的组件进行限制。另外，使用不同数字表示组件并非旨在表示标有不同数字的组件不能与其它编号的组件相同或相似。

本公开除了其它方面以外还描述了具有多个堆叠板材的细胞培养设备，各堆叠板材具有第一主表面和相对的第二主表面。第一主表面包含确定多个微孔的结构化表面。在一个实施方式中，结构化表面是具有微孔阵列的基材。各孔具有确定上开口和最低点的内表面，且各孔的上开口的直径尺寸在200微米～500微米的范围内，或者在100微米～2000微米的范围内。该设备还包含多个用于使堆叠板材之间保持间隙的间隔物。间隔物可包含多个从第一主表面沿第一主表面延伸的分隔轨道。多个流动通道确定于相邻轨道之间。

在一些实施方式中，可对孔进行配置，以使在孔中培养的细胞形成球状体。例如，孔的内表面可不粘附细胞，以使孔中的细胞彼此相联而形成球状体。球状体可膨胀至受到孔的几何构造限制的尺寸。在一些实施方式中，孔可涂覆有超低粘合材料以使孔不粘附细胞。

与细胞在表面形成单层的二维细胞培养物截然不同的是，形成诸如球状体这样的三维(3d)细胞团块能够提高在细胞培养设备中生长的细胞密度。提高的细胞密度可导致代谢负荷升高。在本文所述的各种实施方式中，代谢气体的扩散在板材材料之间发生，而不依赖于本文所述的细胞培养介质的流动。这些设备能够更适合高密度培养的细胞的代谢需求。

经过三维培养的细胞(例如球状体)可展现出相比于在作为单层的二维培养中更类似活体内的功能性。在二维细胞培养系统中，细胞可附着于培养细胞的基材。然而，当细胞在三维方向上生长(例如球状体)时，细胞会彼此相互作用，而不是附着于基材。在三维方向上培养的细胞在细胞通信和胞外基质的形成方面与活体组织更加接近。因此，球状体能够提供细胞迁移、分化、存活和生长的优异模型，且因此能够提供更好的用于研究、诊断和药物疗效、药理学和毒性测试的系统。

在一些实施方式中，对装置进行配置，以使在装置中培养的细胞形成球状体。例如，细胞生长的孔可不粘附细胞，以使孔中细胞彼此相联而形成球体。球状体可膨胀至受到孔的几何构造限制的尺寸。在一些实施方式中，孔可涂覆有非粘附性材料。在一些实施方式中，非粘附性材料是超低粘合材料，使孔不粘附细胞。

非粘附性材料的例子包括全氟化聚合物、烯烃或类似的聚合物或其混合物。其它例子包括琼脂糖、诸如聚丙烯酰胺的非离子型水凝胶、诸如聚环氧乙烷的聚醚、以及诸如聚乙烯醇的多元醇或类似的材料或其混合物。在一些实施方式中，这些材料可以是超低粘合材料。例如非粘附性孔、孔的几何构造(例如尺寸和形状)和/或重力的组合诱导孔中培养的细胞自发组成球状体。相对于单层中生长的细胞，一些球状体能够维持分化细胞功能，显示更好的类似活体内的反应。另一些细胞类型，例如间充质干细胞，在作为球状体培养时保持其多能性。

在一些实施方式中，本文所述的系统、装置和方法包含一种或多种细胞。在一些实施方式中，细胞是冷冻保存的。在一些实施方式中，细胞在三维培养物中。在一些这样的实施方式中，系统、装置和方法包含一种或多种球状体。在一些实施方式中，一种或多种细胞在活跃分裂。在一些实施方式中，系统、装置和方法包含培养介质(例如包含营养物(例如蛋白质、肽、氨基酸)、能量(例如碳水化合物)、必需金属和矿物质(例如钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐)、缓冲剂(例如磷酸盐、醋酸盐)、ph变化指示剂(例如酚红、溴甲酚紫)、选择剂(例如化学试剂、抗微生物剂)等)。在一些实施方式中，系统、装置和方法中包含一种或多种测试化合物(例如药物)。

可对多种细胞种类进行培养。在一些实施方式中，球状体含有单一的细胞种类。在一些实施方式中，球状体含有多于一种细胞种类。在一些实施方式中，在培养多于一个球状体的情况下，各球状体由相同种类的细胞形成，而在另一些实施方式中，培养两种或更多种不同种类的球状体。生长成球状体的细胞可以是天然细胞或者经过改变的细胞(例如，包含一种或多种非天然基因改变的细胞)。在一些实施方式中，细胞是体细胞。在一些实施方式中，细胞是处于任何所需的分化状态下(例如多能性、多功能性、决定命运的(fatedetermined)、不死化等)的干细胞或祖细胞(例如胚胎干细胞、诱导的多能性干细胞)。在一些实施方式中，细胞是疾病细胞或疾病模型细胞。例如，在一些实施方式中，球状体包含一种或多种癌细胞或可被诱导进入过度增殖状态的细胞(例如转化细胞)。细胞可来自或衍生自任何所需的组织或器官类型，包括但不限于肾上腺、膀胱、血管、骨、骨髓、脑、软骨、子宫颈、角膜、子宫内膜、食管、胃肠道、免疫系统(例如t淋巴细胞、b淋巴细胞、白细胞、巨噬细胞和树突状细胞)、肝、肺、淋巴、肌肉(例如心肌)、神经、卵巢、胰腺(例如胰岛细胞)、垂体、前列腺、肾、唾液、皮肤、肌腱、睾丸和甲状腺。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞(例如人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、鸡、山羊、马等)。

经过培养的细胞可用于多种研究、诊断、药物筛选以及测试、治疗和工业应用中。

在一些实施方式中，细胞被用于生产蛋白质或病毒。用于同时培养大量球状体的系统、装置和方法在蛋白质生产上特别有效。三维培养实现了每平方厘米细胞生长表面积上提高了的细胞密度和更高的蛋白质产率。用于生产疫苗所需的任何蛋白质或病毒都可在细胞中生长并为了所需的用途而分离或纯化。在一些实施方式中，蛋白质是细胞的天然蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是非天然的。在一些实施方式中，蛋白质被重组表达。优选地，使用非天然的启动子过表达蛋白质。蛋白质可被表达为融合蛋白。在一些实施方式中，纯化或检测标记被表达为感兴趣的蛋白质的融合伙伴(fusionpartner)，以帮助其进行纯化和/或检测。在一些实施方式中，融合物与可切割的接头一起表达，以允许在纯化后对融合伙伴进行分离。

在一些实施方式中，蛋白质是治疗性蛋白质。这种蛋白质包括但不限于具有以下作用的蛋白质和肽：替代有缺陷或异常的蛋白质(例如胰岛素)；增强现存通道(例如抑制物或激动剂)；提供新颖的功能或活性；干扰分子或有机体；或者传递其它化合物或蛋白质(例如放射性核素，细胞毒性药物，效应蛋白等)。在一些实施方式中，蛋白质是任意种类(例如人源化，双特异性，多特异性等)的免疫球蛋白，例如抗体(例如单克隆抗体)。治疗性蛋白质的分类包括但不限于：基于抗体的药物、fc融合蛋白、抗凝血剂、抗原、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化的蛋白质支架、酶、生长因子、激素、干扰素、白细胞介素和血栓溶解剂。治疗性蛋白质可用于预防或治疗癌症、免疫失调，代谢紊乱，先天性基因失调，感染以及其它疾病和病况。

在一些实施方式中，蛋白质是诊断性蛋白质。诊断性蛋白质包括但不限于抗体、亲和力结合伴侣(例如与受体结合的配体)、抑制剂、拮抗剂等。在一些实施方式中，诊断性蛋白质可与可检测基团一起表达或者就是可检测基团(例如，荧光基团、发光基团(例如荧光素酶)、发色基团等)。

在一些实施方式中，蛋白质是工业蛋白质。工业蛋白质包括但不限于食品成分、工业酶、农业蛋白质、分析酶等。

在一些实施方式中，细胞被用于药物研发、表征、功效测试和毒性测试。这种测试包括但不限于：药理作用评估，致癌性评估，医学成像剂特性评估，半衰期评估，辐射安全性评估，遗传毒性试验，免疫毒性试验，生殖和发育测试，药物相互作用评估，剂量评估，吸收评估，沉积评估，代谢评估，清除研究等。特定的细胞种类可用于特定的测试(例如肝细胞用于肝毒性测试，肾近曲小管上皮细胞用于肾毒性测试，血管内皮细胞用于血管毒性测试，神经元和神经胶质细胞用于神经毒性测试，心肌细胞用于心脏毒性测试，骨骼肌细胞用于横纹肌溶解测试)。可对经过处理的细胞的任意数量的参数进行评估，包括但不限于：膜的完整性，细胞代谢物含量，线粒体功能，溶酶体功能，凋亡，遗传改变，基因表达差异等。

在一些实施方式中，细胞培养装置是更大的系统中的一个组件。在一些实施方式中，系统包含多个(例如2、3、4、5、……、10、……、20、……、50、……、100、……、1000等)这样的细胞培养装置。在一些实施方式中，系统包含用于将培养装置保持在最佳培养条件(例如温度、气氛、湿度等)下的培养箱。在一些实施方式中，系统包含用于绘制细胞图像或分析细胞的检测器。所述检测器包括但不限于：荧光计，光度计，相机，显微镜，读板机(例如珀金埃尔默公司(perkinelmer)的envision读板机；珀金埃尔默公司的viewlux读板机)、细胞分析仪(例如通用电气公司(ge)的incell分析仪2000和2200；thermo/cellomicscellnsight高含量筛选平台(highcontentscreeningplatform)和共焦成像系统(例如珀金埃尔默公司的operaphenix高通量成分筛选系统(highthrougputcontentscreeningsystem)；通用电器公司的incell6000细胞成像系统(cellimagingsystem))。在一些实施方式中，系统包含灌注系统或其它用于向经过培养的细胞供给、再次供给和循环培养介质或其它组分的组件。在一些实施方式中，系统包含机器人组件(例如移液器、机械臂、板材移动器等)以实现培养装置的操作、使用和/分析的自动化。

现在参考图1，图1显示了板材110或其一部分的一种实施方式的示意性侧视图，其具有第一主表面112和相对的第二主表面114。第一主表面112确定用于培养细胞的结构化表面。第一主表面112的结构化表面是具有多个孔115的基材。显示球状体200位于孔115内。

本文所述的板材的结构化表面可确定任意数量的可具有任意合适尺寸和形状的孔。这些孔基于它们的尺寸和形状来确定体积。在许多实施方式中，这些孔中的一个或多个围绕着纵轴对称。在一些实施方式中，一个或多个或所有孔的纵轴彼此平行。这些孔可被均匀或不均匀分隔。在一些实施方式中，这些孔被均匀分隔。一个或多个或所有孔可具有相同的尺寸和形状，或者具有不同的尺寸和形状。

现在参考图2和图3，描述了孔115的一些实施方式的示意性横截面图。如上文对图1的描述所述，孔115由板材110的结构化表面确定。第二主表面114或板材110的非培养表面可具有任意合适的形状。如图2所示，形成孔115的板材110具有沿着孔的基本上恒定且相对较薄的厚度。相比之下，图3中的确定孔115的板材110的厚度沿着孔变化，以使最接近孔的上开口118的厚度相对较大，而在最低点116处的厚度相对较薄。

在一些实施方式中，孔115可使气体穿透板材110，即，穿透孔壁。穿透板材110至第二主表面114的孔115的可透气性将会部分取决于板材的材料以及板材沿孔的厚度。在其它条件都相同的情况下，图2中的孔会比图3中的孔更利于气体的穿透。然而，取决于所使用的材料以及所采用的厚度，具有图2或图3中的形状的板材110可具有足够的可透气性以在本公开中使用。

在一些实施方式中，孔115的穿透板材110的透氧率为2000毫升/米²/天或更大。在一些实施方式中，孔穿透板的气体穿透率为3000毫升/米²/天或更大。在一些实施方式中，孔穿透板的气体穿透率为5000毫升/米²/天或更大。

板材110可由任意在孔的至少一部分上具有合适的可透气性的材料形成。合适的材料的例子包括聚二甲基硅氧烷(pdms)、(聚)4-甲基戊烯(pmp)、聚乙烯(pe)和聚苯乙烯(ps)。pdms可具有高水平的可透气性，且能够在厚达3至4厘米的厚度下实现足够的可透气性。pmp能够在不超过约0.03英寸的厚度下实现足够的可透气性。在一些实施方式中，使用厚度在约0.001英寸～约0.025英寸范围内的pmp来形成孔。pe或ps能够在不超过0.005英寸(例如0.003英寸或更薄)的厚度下实现足够的可透气性。一些更薄的板材可能不具有足够的结构完整性。为了弥补较差的结构完整性，可使用开放框架、支架(standoffs)等来从底部支承板材或其结构化表面的部分。

在一些实施方式中，在孔115不允许气体穿透板材110的情况下，可使用更厚的或不可透气材料。用于形成本文所述的板材或其它细胞培养组件的合适的材料的例子包括：聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、聚苯乙烯共聚物、含氟聚合物、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯丁二烯共聚物、完全氢化的苯乙烯聚合物、聚碳酸酯pdms共聚物、以及聚烯烃，例如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚丙烯共聚物和环烯烃共聚物等。

仍然参考图2和3，孔115具有深度d，其定义为由最低点116至上开口118的高度。孔115还具有直径尺寸w，其定义为横跨由上开口118确定的孔的例如直径、宽度等。孔可具有任意合适的深度d和直径尺寸w。在一些实施方式中，深度d、直径尺寸w和孔的形状、以及形成孔的材料一起确定可供细胞生长的体积。

在一些实施方式中，孔115的内表面不粘附细胞。孔可由非粘附性材料形成，或者可涂覆有非粘附性材料以形成非粘附的孔。非粘附性材料的例子包括全氟化的聚合物、烯烃或类似的聚合物或它们的组合。其它例子包括琼脂糖、诸如聚丙烯酰胺这样的非离子型水凝胶、诸如聚环氧乙烷这样的聚醚、以及诸如聚乙烯醇这样的多元醇或类似的材料或它们的混合物。例如非粘附性孔、孔的几何构造以及重力的组合可引发细胞在孔中的培养，以自发组成球状体。相对于单层中生长的细胞，一些球状体能够保持更像活体内反应的分化的细胞功能。

例如非粘附性孔、孔的几何构造以及重力的组合能够确定限制空间，在该限制空间中，在孔中培养的细胞的生长受到限制。

在一些实施方式中，一个或多个孔具有凹陷表面，例如半球形表面、具有圆底的圆锥形表面、以及类似的表面几何构型或它们的组合。孔和孔底部可最终在有助于球形的圆形或弯曲表面上终结、终止或形成底部，所述表面例如浅凹、深坑以及类似的截头圆锥形浮凸表面或它们的组合。允许气体穿透的球状体－凹陷孔的其它形状和构造在共同受让的美国专利申请号14/087906中有所描述，该申请通过引用全文纳入本文，其与本公开的内容不冲突。

在一些实施方式中，孔底部是平坦的或向一点会聚。孔底部可具有任意其它合适的形状或尺寸。

在一些实施方式中，本文所述的孔115的直径尺寸w在约200微米～约500微米的范围内，例如200、250、300、350、400、450或500微米，包括任意上述数值之间的范围。这些直径尺寸能够控制其中生长的球状体的尺寸，以使球状体内部的细胞保持健康状态。在一些实施方式中，孔115的深度d可在约200微米～约500微米的范围内，例如200、250、300、350、400、450或500微米，包括任意上述数值之间的范围。当然，也可采用其它合适的尺寸。

在一些实施方式中，确定孔的结构化表面包含六边形的紧密排布的孔结构阵列。具有这样的结构化表面的第一主表面112的一种实施方式的图像示于图4中，显示了形成孔115的表面112。图5是显示在具有第一主表面112的板材的一种实施方式的孔115中生长的细胞200的示意图，所述第一主表面112包含确定六边形紧密排布孔结构的结构化表面。在一些实施方式中，各孔115内的细胞200形成单一球状体。

可用任何合适的物质形成本文所述的结构化表面。例如，可对板材或膜进行模塑或雕刻以形成结构化表面。在另一个例子中，可对经过模塑的板材施用经过加热的再成形工具。

可将如本文所述的具有结构化表面的板材结合入细胞培养设备中。可对这些板材进行堆叠以形成细胞培养设备。在一些实施方式中，堆叠的板材被轨道分隔，并且在相邻轨道之间的结构化表面上形成有流动通道。

现在参考图6a～c，图6a～c显示了具有轨道300a、300b、300c、300d和板材110的一个可堆叠单元500的实施方式的示意性透视图。轨道300a、300b、300c、300d从板材110沿板材的长度延伸。在相邻轨道之间形成流动通道400a、400b、400c。在图6a所示的实施方式中，轨道300a、300b、300c、300d设置在板材110的第一主表面上。在图6b所示的实施方式中，轨道300a、300b、300c、300d在板材的第一主表面下方延伸。在图6c所示的实施方式中，板110和轨道300a、300b、300c、300d形成统一的组件。轨道和板材可以任意合适的方式组装。例如，板材和轨道可被模塑成单一组件。在一些实施方式中，板材或其一部分被重叠模塑以形成轨道。在一些实施方式中，板材和轨道被焊接(例如热焊接、激光焊接、长红外或紫外焊接等)、粘着、溶剂结合等。板材和轨道可形成单元500，其可在组装本文所述的细胞培养设备的过程中被堆叠。

现在参考图7，图7显示了具有多个堆叠单元500a～l的细胞培养设备600的一种实施方式的示意性的横截面图。各单元包含板材110和多根轨道300。流动通道400形成于相邻的轨道300之间，且位于板材110的第一主表面112上方以及上方堆叠单元的相邻板材110相对的第二主表面114的下方。顶板610可设置于最顶部单元500a的上方。各单元具有多个孔115。

现在参考图8，图8显示了具有确定入口625的入口歧管620和确定出口635的出口歧管630的细胞培养设备600的一种实施方式的示意性侧视图。设备600包含多个堆叠单元500(例如单元具有图6a～c和图7中所示的板材和轨道)。各单元的每一个流动通道都经由歧管620与入口625流体连通，并且经由歧管630与出口635流体连通。在一些实施方式中，可使用具有入口625的扩张器而非歧管。在一些实施方式中，可使用具有出口635的限缩器而非歧管。设备的顶面也以610表示。

以图9a～b为例，图9a～b显示了歧管620(图9a)的一种实施方式的内表面和歧管620(图9b)的一种实施方式的顶面622的示意图。图9a中的歧管620确定多个开孔621，这些孔中的每一个都可与各自的流动通道对齐并焊接以形成液体的紧密密封。图9b显示了具有入口625的歧管的顶面。或者，因为组装的单元的一个面可大致形成与各流动通道接通的歧管，可使用一种简化的扩张器620来将细胞培养液经由入口递送至流动通道。

入口和出口可连接至管线，其可连接至用于将细胞培养介质递送至细胞培养设备的流动通道的泵。

可以任意合适的方式对本文所述的细胞培养设备进行最终组装。例如，单元可被焊接、结合、粘合或连接在一起。歧管、限缩器或扩张器可被焊接、结合、粘合或连接在一起。例如，可将单元插入套筒中，入口和出口歧管连接至该套筒上；可组装和重叠模塑堆叠和歧化的单元；可使袋子热收缩以在堆叠单元周围紧密贴合；将单元堆叠和封装入成型的腔室或成型的袋子中等等。

现在参考图10a～b，图10a～b显示了采用本文所述的细胞培养设备600的实施方式的系统的实施方式示意图。图10a所示的图例显示了采用批处理模式的系统。介质流经由入口625进入培养装置600中。介质通过可选的氧合器660充氧。通过可操作地连接至细胞培养介质源的循环泵650来产生和控制流动力。介质经由出口635流出培养设备600。流动(例如流速)通过控制器640来控制(例如通过对阀门的控制)。控制器还可控制气体流向氧合器，并且控制所需或要求的补充的营养物流或ph调节剂的流动。通过将介质从出口635导向细胞收集盒670来收获经过培养的细胞。各组件由管线、通道(例如微通道)或任何其它的所需流体连通来连接。图10b中的图例显示了采用连续模式的系统。系统还包含入口流动通道680和出口流动通道690，流体经由入口流动通道680流入细胞培养设备600中，并且经由出口流动通道690流出细胞培养设备600。在下文所述的一些实施方式中，在细胞培养设备配置成允许代谢气体扩散的情况下，可省去氧合器。

在板材的结构化表面的孔的内表面不粘附细胞的实施方式中，可提高细胞培养介质通过设备600的流动通道的流速，将可能是球状体的经过培养的细胞从将要装载细胞培养介质流的孔中驱赶至细胞收集盒。可使用较低的流速来使细胞生长并保持在孔内。应当理解的是，可调整孔的形状和尺寸，以改变流速，用以将细胞保持在孔内或将细胞从孔内驱赶出来。

以图11a～11b为例，图11a～11b显示了替代性的孔的几何形状的示意性截面视图。图11b中的孔115比图11a中的孔115更深，因此，图11b中的孔115中的球状体200比图11a中的孔115中的球状体200更深。因此，图11b中的孔115允许较高的流速通过细胞培养设备而不会将球状体200驱赶出来。类似地，图11a中的孔115允许以较低的流速将球状体200驱赶出来以帮助收获。如上所述，本文所述的板材的结构化表面可具有任意合适的几何构造。可调整孔的形状和尺寸以实现调整细胞性质(例如球状体的形成)，帮助进行细胞的驱赶，确保经过培养的细胞具有足够的营养物和气体分布等目的，这取决于用户的需求。

在一些实施方式中，气体流动通道可形成于与板材一同延伸的轨道中。在这些实施方式中，轨道可由具有足够厚度以允许代谢气体从与轨道相邻的流动通道交换的可透气材料形成。合适的可透气材料和厚度的例子如上所述。在一些实施方式中，轨道由pdms形成，其相对允许气体穿透。例如，轨道可由具有从其中穿过的空气通道的挤出pdms形成。pdms既可以是热固性pdms也可以是热塑性pdms，例如购自瓦克化学有限公司(wacker)的geniomer145，其相比于热固性pdms具有更高的气体交换速率。然而，众所周知的是，pdms会结合小分子，这对于细胞培养而言是不希望的。这可以通过进行多层挤出、重叠模塑、涂覆或其它处理以形成用于阻止吸收的屏障来避免，所述屏障还能够起到非粘附细胞的层的作用。轨道内的空气通道可穿过轨道的长度或高度。多条空气通道可形成于轨道内。

以图12为例，图12显示了堆叠单元500a、500b、500c、500d的示意性截面图，这些单元中的每一个都具有板材110和轨道300，且轨道300具有(例如如上所述的)形成于轨道之间的流动通道400。显示了球状体200和板材110的结构化表面的孔115。在所示的实施方式中，轨道300确定了穿过轨道长度的空气通道310。通道310与相邻介质流动通道400之间的轨道300的厚度足够小，以允许代谢气体通过轨道材料交换。

现在参考图13，图13显示了堆叠单元500a、500b、500c、500d的示意性剖切透视图，这些单元中的每一个都具有板材110和轨道(例如轨道300a～d)，且这些轨道具有(例如如上所述的)形成于轨道之间的流动通道400。在该实施方式中，各轨道(例如轨道300a～d)形成多个沿轨道高度延伸的空气通道310。调整各轨道(例如轨道300a～d)的空气通道310的朝向，以使当堆叠单元500a、500b、500c、500d时，空气通道310对齐。当单元500a、500b、500c、500d堆叠时，轨道形成从最底部单元(例如单元500d)至最顶部单元(例如单元500a)的壁350。从而，由轨道(例如轨道300a～d)形成的对齐了的空气通道310的柱能够沿着组装好的设备的高度延伸。

无论空气通道采用何种朝向(例如如图12所示的那样沿着轨道的长度，或者是如图13所示的那样沿着轨道的高度)，空气通道都能够连接至歧管、扩张器或限缩器以形成单一离开设备的补给和排出口。在一些实施方式中，单独的歧管、扩张器或限缩器可连接至设备空气通道的两端以控制气流通过堆叠单元。

以图14为例，图14显示了包含第一排出歧管370和第二排出歧管380的细胞培养设备600的一种实施方式的示意性的侧视图。图14的设备中所示的许多组件都示于图8中，并且在上文中参考图8对它们进行了描述。图14中所示的设备600可看成具有如图13所示单元的组装件，其中，轨道形成壁，所述壁形成沿装置的高度延展的空气通道队列。排出歧管370和380分别形成排出口375和385。这些排出口可排出至大气，或者可连接至管线以向设备提供受控的气体环境。

现在参考图15a，图15a显示了一种细胞培养设备600的示意性剖切透视图，其中，孔由可透气材料形成。在该示例性的实施方式中，介质经由入口625进入设备的一端，循环通过整个设备，并且对留在微孔115中的球状体200提供养料，然后逆流通过各腔室(经由出口635)离开。腔室/容器还可具有支承轴套(boss)或柱(未图示)以维持适当的结构。空气通道310沿着可透气的孔底部设置，允许空气交换以供养孔中的球状体。轨道300允许形成各种空气通道310。图15b显示了图15a的细胞培养设备。并且具体显示了气体是如何经由空气通道310(其排布在设备前方)渗透进入装置中的。对此，如图15b所示，不需要氧合器，因为空气通道310(也称为导管空间)能够提供穿透可透气材料的气体交换。图15b还显示了用于管理介质的系统组件。控制器泵1600将新鲜的介质从新鲜的介质源1610泵入细胞培养装置600。废料储罐1620收集使用过的介质。在介质离开设备的同时，还使用阀门1630来收集介质和收获可能存在于介质中的化合物。

现在参考图16a，其显示了一种细胞培养设备600的示意性剖切透视图，其中，孔由可透气材料形成。在该示例性的实施方式中，介质经由入口625进入，分布到所有区室(通过入口歧管620)，然后经由依附于出口635的出口歧管630从相反端离开。空气通道310沿着可透气孔底部设置，允许空气交换以供养孔中的球状体。轨道300允许形成各种空气通道310。图16b显示了图16a的细胞培养设备。并且具体显示了气体是如何经由空气通道310(其排布在设备前方)渗透进入装置中的。对此，如图16b所示，不需要氧合器，因为空气通道310(也称为导管空间)能够提供穿透可透气材料的气体交换。图16b还显示了用于管理介质的系统组件。控制器泵1600将新鲜的介质从新鲜的介质源1610泵入细胞培养装置600。废料储罐1620收集使用过的介质。

其他实施方式和几何构造示于图18、19和20。图17是孔100的阵列的一种示例性实施方式的示意图，其显示单独的孔115。在图17所示的实施方式中，孔115具有孔嘴101。孔嘴101位于孔顶部与孔115的顶部开口111相邻的区域，其在孔收缩以形成孔底部(细胞在孔底部沉积形成球状体)之前提供了更加开阔的区域。在一些实施方式中，孔嘴101可以是圆锥形的(孔嘴顶部比孔嘴底部更宽)和环形的(如图17a和图18a所示，其中的孔是圆形的)。在其他实施方式中，例如如图19a所示，孔具有圆形开口，但具有抛物线形状，孔嘴101可以是抛物线形状的。

在一些实施方式中，孔的几何构造包含在孔壁中的毛细结构(包括例如孔嘴、脊缝、圆形或抛物线形状的顶部开口等)，以帮助空气在将液体引入孔中以后逸出。图17b是截取自图17a的线b-b的俯视图，显示了脊170。如图17b所示，该脊是从孔的孔嘴101或侧壁113上产生的隆起或凸起。在一些实施方式中，脊沿着微孔的长度方向从顶部开口111向孔底部116延伸。在附加的实施方式中，脊从孔嘴111的顶部向孔嘴112的底部延伸。脊170的两侧上所形成的锐角对液体流体上产生毛细作用力，以使流体在没有空气截留的条件下进入微孔。

图18b是图18a以横截面显示的孔100的阵列的俯视图。图18b显示了裂缝270。如图18b所示，该裂缝是孔115的侧壁113上的压痕。裂缝270的两侧上所形成的锐角形成了毛细作用力，以使液体流体流入微孔。

图20a和b是孔100的阵列的另一种示例性实施方式的示意图。图19a是其横截面图。图19b是截取自图19a的线b-b的孔阵列的示例性实施方式的俯视图。图19a和b显示各孔115可具有多于一个脊170或裂缝270，且脊170或裂缝270可以阵列排布于孔115内。如图19a和b所示，在一些实施方式中，可设想脊和/或裂缝的径向分布。毛细结构的数量不限于每个微孔一个。在一些实施方式中，更多数量的毛细管提高了流体进入微孔中的速率。

图19a～c显示了在单一孔中包含多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、16、20、24、28、32或它们之间的任意范围)垂直取向的毛细结构。特征可有规律地间隔(如图19所示)，无规律地隔开，分组/集束等。在一些实施方式中，毛细结构从孔的顶部开口向孔底部延伸。当单一孔中存在多个毛细结构时，这些多个特征可以是不同种类的(例如脊线和/或裂缝)并且可具有不同的形状(例如正方形、圆形等)。

图19c显示了孔100的阵列可具有正弦曲线或抛物线的形状。该形状形成了圆形的顶部边缘或孔边缘，其在一些实施方式中减少了空气在孔顶部以锐角或90度角被捕获。该正弦曲线或抛物线的孔形状、或圆形的顶部孔边缘也是毛细结构。如图19c所示，孔115具有顶部直径为d顶部的顶部开口，从孔底部116至孔顶部的高度h和在孔的顶部与孔的116之间一半位置处的孔直径d半高。

可为了所需的培养条件而对孔的相对和绝对尺寸进行选择。对于球状体的生长，直径d优选是将要在孔中培养的3d细胞聚集体的所需直径的1～3倍。高度h优选是d的0.7～1.3倍。直径d顶部优选是d的1.5～2.5倍。d优选为100微米(μm)～约2000微米(例如100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800或2000微米，包括上述数值中的任意两个之间的范围(例如200～1000μm、200～750μm、300～750μm、400～600μm等))。然而，也可采用其他相对或绝对尺寸。例如，d可以是细胞聚集体的所需直径的1～10倍(例如2、3、4、5、6、7、8、9倍)或上述数值之间的任意数值和范围(例如，1、1～1.5、1～2、2、1～2.5、1～3、2～3、1～5、3～5、2～7等)。d可以是100μm～10000μm或它们之间的任意数值(例如100、200、500、1000、2000、5000)或范围(例如100～2000、200～1000、300～700、400～600、500等)。h可以是d的0.5～10倍(例如0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10倍或上述数值之间的任意值或范围)。d顶部可以是d的1.5～5倍(例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5倍或上述数值之间的任意值或范围)。

在某些实施方式中，本公开的可透气细胞培养设备(例如球状体灌注生物反应器)允许对各培养区室中各表面上的所有球状体进行连续的介质补充和气体交换。通常，对于各培养区室中的所有球状体而言，介质补充和气体交换将会是等价的，或大致等价的。在孔/区室中采用形成球状体的几何构造允许添加至这些生物反应器中的细胞形成全部具有大致相同尺寸的球状体。由于培养区室的可透气性，对于生物反应器而言，这种系统将不再需要通常所需要的氧合器以进行最佳运行。

在某些实施方式中，可透气细胞培养设备允许在很小的面积内生长大量细胞。例如，一个直径400微米的球状体可在3d方向平均含有30000个细胞。在一个直径400微米的2d表面，可附着约305个细胞。因此，在3d中生长的细胞比在相同单元面积的2d中生长的细胞多约100倍。在紧凑空间中生长如此众多的细胞需要更多营养物，且会产生更多需要被移除的废料产物。本文所述的灌注系统能够提供这样一种不需要持续干预的方案。而且，在3d中生长的细胞的品质通常更高，因为它们的功能与活体中更加相似。

在某些实施方式中，生物反应器腔室/孔可由可透气材料模塑或热成型得到，或者通过可透气和不可透气材料组合来构建。结构支承可以是多种形势，包括例如轴套或柱。腔室/孔可经由将新鲜介质均匀分布至所有腔室的歧管来平行地接收新鲜介质，或者，可通过从一个腔室逆流至下一个腔室来依次对腔室进行给料。

通常，容器中的细胞的气体交换需求决定了灌注速率，且通结构的可透气材料来满足呼吸需求，能够使灌注速率显著降低。这允许降低作用于球状体上的剪切流动，使得更容易地维持基材中的球状体的球状体形成/保留特性。

在孔不粘附细胞的实施方式中，在本文所述的设备中培养的细胞可通过倒置设备通过重力使细胞离开孔来进行收获。或者，可如上所述地提高流体通过介质流动通道的流速，以将细胞从孔中驱赶出来。

除非另外说明，否则本文所使用的所有科学和技术术语的含义具有本领域通用的含义。本文所提供的确定是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本公开的范围构成限制。

除非上下文另外清楚地说明，否则，本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该/所述”包括复数指代。因此，例如，所述“结构化表面”包括具有两个或更多个此类“结构化表面”的例子，除非文中另行明确指明。

如本说明书和所附权利要求书所用，除非文中有明确的相反表示，否则“或”字通常在其包括“和/或”的含义上使用。术语“和/或”表示所列出的要素中的一个或全部或者所列出的要素中的任何两个或多个元素的组合。

如本文所用，“具有”、“含有”、“拥有”、“包括”、“包含”、“含”、等在其开放含义上使用，通常表示“包括但不限于”。

“可选的”或“可选地”表示随后描述的事件、情形或组分可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件、情形或组分发生的实例和所述事件或情形不发生的实例。

术语“优选”和“优选地”是指能够在特定条件下产生某些益处的本公开的实施方式。然而，在相同或其他条件下，其它实施方式也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方式的描述并不意味着其他实施方式不是有用的，并且不旨在将其他实施方式排除在具有创造性的技术的范围之外。

本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，例子包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成另一方面。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相结合以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。

另外，在本文中，利用端点所进行的数字范围的描述包括将该范围内的所有数字包括在内(例如1～5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。在数值范围是“大于”一个特定值、“小于”一个特定值等的情况下，该数值包括在该范围之内。

本文所涉及的任意方向，例如“顶部”、“底部”、“左侧”、“右侧”、“上”、“下”、“上方”、“下方”以及其它方向和朝向在本文中都是为了参考附图进行简明描述所用，并非旨在限制实际装置或系统或该装置或系统的使用。本文所述的许多装置、制品或系统可在多种方向和朝向上使用。本文所使用的涉及细胞培养设备的方向描述符号经常是指当为了在设备中培养细胞而调整设备朝向时的方向。

除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其它权利要求中所述的任何其它特征或方面或与任一项或多项其它权利要求中所述的任何其它特征或方面置换。

还要注意本文中涉及将部件“配置成”或“使其适于”的描述以特定的方式起作用。就这方面而言，使这样一个组件“配置成”或“使其适于”是为了具体表现特定的性质，或者以特定的方式起作用，这样的描述是结构性的描述，而不是对预期应用的描述。更具体而言，本文所述的将组件“配置成”或使其“适于”的方式表示该组分现有的物理条件，因此可以将其看作该组件的结构特征的限定性描述。

虽然会用过渡语“包含”来公开特定实施方式的各种特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代实施方式。因此，例如，细胞培养设备的隐含的替代性实施方式包含确定结构化表面的板材、一个或多个轨道、顶部和一个或多个歧管，包括以下实施方式，其中，细胞培养设备由确定结构化表面的板材、一个或多个轨道、顶部和一个或多个歧管组成，以及包括以下实施方式，其中，细胞培养设备基本上由确定结构化表面的板材、一个或多个轨道、顶部和一个或多个歧管组成。

对本领域技术人员显而易见的是，可以在不偏离本文所述的具有创造性的技术的范围和精神的情况下对本公开进行各种修改和变动。因为本领域的技术人员可以想到所述实施方式的融合了本文所述的具有创造性的技术的精神和实质的各种改良组合、子项组合和变化，应认为本文所述的具有创造性的技术包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。