一种提取棉花线粒体及其蛋白质的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提取棉花线粒体及其蛋白的方法。

背景技术：

线粒体蛋白质的提取主要分为线粒体分离和蛋白质提取两个环节。目前，用于高等植物线粒体分离提取的方法主要有差速离心法和密度梯度离心法等。差速离心法，虽然操作简单，是目前应用最广的方法，但所提取的线粒体纯度低、容易受核杂质污染，对后续的研究工作造成很大困难；密度梯度离心法，得到的线粒体纯度高，但操作复杂、耗时，长时间高速离心对离心机要求很高，对材料的需求量大，同时线粒体提取产量低。

线粒体具有相对独立的遗传物质，植物细胞中，线粒体蛋白质仅占总蛋白质的约5％，因此，分离出高纯度的线粒体蛋白质，对于研究线粒体的蛋白组等都是必需的。和其他作物相比，棉花线粒体dna，rna和蛋白质的提取都较为困难，目前还没有关于棉花线粒体蛋白质提取方法的报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种提取植物线粒体蛋白的方法。

本发明提供的提取植物线粒体蛋白的方法包括如下步骤：

(1)将植物样品进行匀浆，过滤，收集滤液；将所述滤液进行差速离心，收集沉淀；

(2)洗涤步骤(1)获得的沉淀，得到体系a，将所述体系a进行差速离心，收集沉淀；

(3)向步骤(2)获得的沉淀中加入bufferb溶液，进行蔗糖密度梯度离心，收集梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，即得到线粒体；

所述蔗糖密度梯度离心的蔗糖密度梯度为将60％蔗糖溶液、52％蔗糖溶液、36％蔗糖溶液和20％蔗糖溶液分层制备，得到蔗糖密度梯度；

(4)从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白。

上述方法中，所述从步骤(3)获得的线粒体中提取蛋白包括如下步骤：

1)向步骤(3)获得的线粒体中加入裂解液，裂解反应，得到裂解反应产物；

2)向所述裂解反应产物中加入苯酚抽提液，反应，离心，弃沉淀，收集上清液；

3)将步骤2)获得的上清液与5倍体积的乙酸铵/甲醇溶液混匀，反应，离心，弃上清液，收集沉淀；

4)用乙酸铵/甲醇溶液洗涤步骤3)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉 淀；

5)用80％丙酮溶液洗涤步骤4)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；

6)重复步骤5)；

7)用体积分数为70％乙醇洗涤步骤6)获得的沉淀，静置，离心，弃上清液，收集沉淀；并将所述沉淀悬浮于体积分数为80％的丙酮中，静置过夜；

8)离心步骤7)获得的产物，弃上清液，收集沉淀，得到的沉淀即为线粒体蛋白。

上述方法中，

所述60％蔗糖溶液、所述52％蔗糖溶液、所述36％蔗糖溶液、所述20％蔗糖溶液的体积比为4:5:5:3；

所述20％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1mph为8.0的tris-hcl，所述蔗糖在所述20％蔗糖溶液中的浓度为0.2g/ml；

所述36％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1mph为8.0的tris-hcl，所述蔗糖在所述36％蔗糖溶液中的浓度为0.36g/ml；

所述52％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1mph为8.0的tris-hcl，所述蔗糖在所述52％蔗糖溶液中的浓度为0.52g/ml；

所述60％蔗糖溶液的溶质为蔗糖，溶剂为0.1mph为8.0的tris-hcl，所述蔗糖在所述60％蔗糖溶液中的浓度为0.6g/ml。

上述方法中，所述步骤(3)和步骤(4)间还包括如下纯化的步骤：用bufferb⁺溶液洗涤梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层，离心，弃上清液，收集沉淀，得到的沉淀即为线粒体。

上述方法中，所述洗涤的次数为4次。

上述方法中，

所述步骤(1)的匀浆过程中使用匀浆缓冲液，所述匀浆缓冲液的溶剂为水，溶质及其在匀浆缓冲液中的浓度为：蔗糖100-500mm、edta-na25-10mm、kcl5-20mm、kh2po410-20mm、bsa0.5-1g/l、二硫苏糖醇0.77-1.54g/l、β-巯基乙醇0.5-1ml/l；所述匀浆缓冲液的ph值为7.5-8.5；

所述步骤(2)的洗涤过程中使用洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液的溶剂为水，溶质及其在洗涤缓冲液中的浓度为：蔗糖100-500mm、edta-na25-10mm、kcl5-20mm、kh2po410-20mm、tris-hcl5-20mm；

所述bufferb⁺溶液为在所述洗涤缓冲液中添加bsa得到的溶液；所述bsa在所述bufferb⁺溶液中的质量分数为0.05-0.1％；

所述步骤(1)中，所述差速离心的步骤为：将滤液进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为 500-2000×g离心5-15min；所述高速离心的条件为10000-15000×g离心30-60min；

所述步骤(2)中，所述差速离心的步骤为：将体系a进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为500-1000×g离心10-20min，所述高速离心的条件为15000-18000×g离心30-60min；

所述步骤(3)中，所述蔗糖密度梯度离心的条件为50000-100000×g，4℃离心60-120min；

所述纯化步骤中，所述离心的条件为50000-100000×g离心25-30min。

上述方法中，

所述匀浆缓冲液的溶剂为水，溶质及其在匀浆缓冲液中的浓度为：蔗糖300mm、edta-na27.5mm、kcl10mm、kh2po420mm、bsa1g/l、二硫苏糖醇1.54g/l、β-巯基乙醇1ml/l；所述匀浆缓冲液的ph值为7.5；

所述洗涤缓冲液的溶剂为水，溶质及其在洗涤缓冲液中的浓度为：蔗糖300mm、edta-na25mm、kcl10mm、kh2po420mm、tris-hcl10mm；

所述bufferb⁺溶液为在所述洗涤缓冲液中添加bsa得到的溶液；所述bsa在所述bufferb⁺溶液中的质量分数为0.1％；

所述步骤(1)中，所述差速离心的步骤为：将滤液进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为1000×g离心10min；所述高速离心的条件为12000×g离心45min；

所述步骤(2)中，所述差速离心的步骤为：将体系a进行低速离心，弃沉淀，取上清液；将所述上清液进行高速离心，弃上清液，收集沉淀；所述低速离心的条件为1000×g离心15min，所述高速离心的条件为18000×g离心30min；

所述步骤(3)中，所述蔗糖密度梯度离心的条件为75600×g，4℃离心90min；

所述纯化步骤中，所述离心的条件为75600×g离心25min或75600×g离心30min。

上述方法中，

所述裂解液的溶剂为水，溶质及其在所述裂解液中的浓度分别为tris-hcl0.005-0.02mol/l、edta-na20.01-0.05mol/l、ctab1.0-3.0g/l、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/l、nacl1.0-1.8mol/l；

所述苯酚抽提液是将ph8.0的tris饱和酚与等体积提取缓冲液混匀得到的溶液；

所述提取缓冲液的溶剂为水，溶质及其在所述提取缓冲液中的浓度分别为tris-hcl0.05-0.1mol/l、sds15-25g/l、蔗糖200-400g/l、β-巯基乙醇1-2ml/l；

所述乙酸铵/甲醇溶液的溶剂为甲醇，溶质为乙酸铵，所述乙酸铵在所述甲醇中的浓度为0.05-0.2mol/l；

所述步骤1)中，所述裂解反应的条件为65℃裂解10-30min；

所述步骤2)中，所述反应的条件为4℃反应30min；所述离心的条件为2000-5000×g，4℃离心20-40min；

所述步骤3)中，所述反应条件为-20℃过夜；所述离心的条件为2000-5000×g，4℃离心20-40min；

所述步骤4)、5)和7)中，所述静置的条件为-20℃静置20min；所述离心的条件为8000-12000×g，4℃下离心20-40min；

所述步骤8)中，所述离心的条件为18000-20000×g离心2-10min。

上述方法中，

所述裂解液的溶剂为水，溶质及其在所述裂解液中的浓度分别为tris-hcl0.01mol/l、edta-na20.02mol/l、ctab2.0g/l、聚乙烯吡咯烷酮2.0g/l、nacl1.4g/l；

所述提取缓冲液的溶剂为水，溶质及其在所述提取缓冲液中的浓度分别为tris-hcl0.05mol/l、sds20g/l、蔗糖300g/l、β-巯基乙醇2ml/l；

所述乙酸铵/甲醇溶液的溶剂为甲醇，溶质为乙酸铵，所述乙酸铵在所述甲醇中的浓度为0.1mol/l；

所述步骤1)中，所述裂解反应的条件为65℃裂解10min；

所述步骤2)中，所述反应的条件为4℃反应30min；所述离心的条件为3000×g，4℃离心30min；

所述步骤3)中，所述反应条件为-20℃过夜；所述离心的条件为3000×g，4℃离心30min；

所述步骤4)、5)和7)中，所述静置的条件为-20℃静置20min；所述离心的条件为12000×g，4℃下离心20min；

所述步骤8)中，所述离心的条件为20000×g离心2min。

上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为棉花，所述棉花具体为棉花黄化苗；所述棉花黄化苗具体为苏棉20黄化苗。

本发明的优点：

(1)本发明改进了传统的差速离心法提取棉花线粒体的过程，通过更改试剂、利用蔗糖密度梯度层、调整离心次数和时间、增加抽提洗涤次数等优化提取条件，分离得到高纯度的线粒体；

(2)本发明利用ctab-苯酚抽提法提取蛋白质，有效的除掉了多糖、dna等杂质的污染，得到了高纯度的线粒体蛋白。

本发明针对目前分离线粒体的方法中存在的不足以及缺乏线粒体蛋白提取方法的现状，通过更改试剂、利用蔗糖密度梯度层、调整离心次数和时间、增加抽提洗涤次 数等优化分离和提取条件，提供了一种分离高纯度的棉花线粒体及其蛋白的方法。该方法的具体步骤为：结合差速离心法以及蔗糖密度梯度法，分离出高纯度的棉花线粒体；并利用ctab裂解线粒体，提取其线粒体蛋白，填补了植物线粒体蛋白提取的空缺。本发明的方法对线粒体机械损伤程度最小，可以有效的除去线粒体以外的核组分、质体组分，以及酚类、多糖类物质，降低污染率，提高线粒体蛋白质的纯度和质量。满足了棉花基因组研究、线粒体蛋白组及代谢调控网络等研究工作的实验技术需求，拓宽了相关研究工作的领域。

附图说明

图1为蔗糖密度梯度。

图2为sds-page图。

图3为sds-page图。

图4为sds-page图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的离心，如果没有注明温度，均4℃条件下离心。

下述实施例中的1.5mtris-hcl的制备方法如下：将tris18.17g加入到80mlddh2o中，用浓hcl调ph到8.0，用水定容至100ml。

下述实施例中的0.1mph为8.0的tris-hcl的制备方法如下：将tris1.211g加入到80mlddh2o中，用浓hcl调ph到8.0，用水定容至100ml。

下述实施例中的体积分数为80％丙酮溶液的制备方法如下：将400ml丙酮加入无菌三角瓶，用ddh2o定容至500ml，混匀后-20℃保存。

下述实施例中的体积分数为70％乙醇溶液的制备方法如下：350ml无水乙醇加入无菌三角瓶，用ddh2o定容至500ml，混匀-20℃保存。

下述实施例中的sdssamplebuffer的制备方法如下：将1ml1mtris-hcl(ph6.8)，4ml10％(w/v)sds和2ml甘油用水定容至10ml，4℃保存。

实施例1、一种棉花线粒体及其蛋白质的方法

一、棉花线粒体的分离

1、将100g徐244(苏棉20)黄化苗与1000mlbuffera溶液混匀，进行匀浆，用4-6层纱布过滤，收集滤液；将滤液在1000×g下低速离心10min，弃沉淀，取上清液；将上清液在12000×g下高速离心45min，弃上清液，收集沉淀。

上述buffera溶液的溶剂为水，溶质及其在buffera溶液中的浓度为：蔗糖300 mm、edta-na27.5mm、kcl10mm、kh2po420mm、bsa1g/l、二硫苏糖醇1.54g/l、β-巯基乙醇1ml/l；ph值为7.5，其中bsa、二硫苏糖醇和β-巯基乙醇为高温高压灭菌后加入。

2、向步骤1获得的沉淀中加入40mlbufferb溶液，刷起沉淀后转移到100ml离心管中，继续用约80mlbufferb溶液洗涤，在1000×g下离心15min，弃沉淀，取上清液；将上清液转移到新的50ml离心管中，在18000×g下离心30min，弃上清液，收集沉淀。

上述bufferb溶液的溶剂为水，溶质及其在bufferb溶液中的浓度为：蔗糖300mm、edta-na25mm、kcl10mm、kh2po420mm、tris-hcl10mm，高温高压灭菌。

3、向步骤2的沉淀中加入1mlbufferb溶液，刷起沉淀后转移到4℃预冷的蔗糖密度梯度中，再贴壁缓慢匀速加入1mlbufferb溶液洗涤，在4℃，75600×g下离心90min，收集梯度36％与梯度52％之间的黄色液体层(图1)。黄色液体层中即为分离得到的线粒体。

上述蔗糖密度梯度的制备方法如下：将质量与体积百分比为60％蔗糖溶液、质量与体积百分比为52％蔗糖溶液、质量与体积百分比为36％蔗糖溶液和质量与体积百分比为20％蔗糖溶液进行70℃水浴溶解；将8ml的质量与体积百分比为60％蔗糖溶液、10ml的质量与体积百分比为52％蔗糖溶液、10ml的质量与体积百分比为36％蔗糖溶液和6ml的质量与体积百分比为20％蔗糖溶液混匀，得到蔗糖密度梯度；

上述20％蔗糖溶液为6.0g蔗糖用0.1mph为8.0的tris-hcl定容至30ml；

上述36％蔗糖溶液为18.0g蔗糖用0.1mph为8.0的tris-hcl定容至50ml；

上述52％蔗糖溶液为26.0g蔗糖用0.1mph为8.0的tris-hcl定容至50ml；

上述60％蔗糖溶液为24.0g蔗糖用0.1mph为8.0的tris-hcl定容至40ml。

4、向淡黄色液体层中加入30mlbufferb⁺(bufferb⁺的制备方法如下：bufferb溶液在灭菌后加入0.1％(质量/体积)的bsa)，在75600×g下离心30min，弃上清液，收集沉淀；

5、用30mlbufferb⁺洗涤步骤4获得的沉淀，在75600×g下离心25min，弃上清液，收集沉淀；

6、重复步骤5两次后，收集沉淀，得到的沉淀即为纯化后的线粒体。

二、棉花线粒体蛋白质的提取

1、向实施例1获得的线粒体中加入2.0ml65℃预热的裂解液，65℃裂解10min，期间轻柔颠倒2-3次；

上述裂解液的制备方法如下：将0.01moltris-hcl、0.02moledta-na2、2.0g ctab、2.0g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和1.4molnacl用水定容至1升。

2、向步骤1的产物中加入7.0ml苯酚抽提液，在4℃环境下颠倒混匀30min后，在4℃，3000×g下离心30min，弃沉淀，收集上清液。

上述苯酚抽提液的制备方法如下：将ph8.0的tris饱和酚与等体积提取缓冲液混匀(使用时加入2％(质量分数)β-巯基乙醇)。上述提取缓冲液的制备方法如下：16.7ml1.5mtris-hcl(ph值为8.0)、10.0gsds、150.0g蔗糖、1mlβ-巯基乙醇用水定容至500ml。

3、向步骤2获得的上清液中加入5倍体积的乙酸铵/甲醇溶液，颠倒混匀后，-20℃过夜；将过夜沉淀后的溶液在4℃，3000×g下离心30min，弃上清液，收集沉淀；

上述乙酸铵/甲醇溶液的制备方法如下：将2.3124g乙酸铵溶于300ml甲醇溶液，-20℃保存备用。

4、用-20℃预冷的乙酸铵/甲醇溶液洗涤步骤3获得的沉淀，超声波震荡(超声波震荡的条件：功率300w，10s/次，间隔10s，20min)充分混匀后，-20℃静置20min，静置后在4℃，12000×g下离心20min，弃上清液，收集沉淀；

5、用-20℃预冷的体积分数为80％丙酮溶液洗涤步骤4获得的沉淀，-20℃静置20min，在4℃，12000×g离心20min，弃上清液，收集沉淀。

6、用体积分数为80％丙酮溶液重复清洗上述步骤5获得的沉淀。

7、用-20℃预冷的体积分数为70％乙醇再次洗涤步骤4获得的重复清洗后的沉淀，超声波震荡(超声波震荡的条件：功率300w，10s/次，间隔10s，20min)充分混匀后，-20℃静置20min，在4℃，12000×g下离心20min，弃上清液，收集沉淀，并将沉淀悬浮于10ml-20℃预冷的体积分数为80％丙酮溶液中，-20℃静置过夜。

8、振荡蛋白，使其在丙酮溶液中充分悬浮，取400μl到1.5ml离心管，在常温，20000×g下离心2min，弃上清液，收集沉淀，即为线粒体蛋白质。

9、待丙酮挥发完全后，加入40μlsdssamplebuffer溶解蛋白。

将获得的线粒体蛋白质进行sds-page检测，检测结果如图2、图3、图4所示。从图中可以看出，获得的线粒体蛋白质主条带大小与总蛋白质及叶绿体蛋白质主条带存在明显差异，说明用本发明提供的方法提取的线粒体蛋白质较纯净，质量较高，能满足继续的相关分子试验。