本发明涉及萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其盐在制备抗肿瘤药物上的应用，属于抗肿瘤药物领域。
背景技术：
萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮(NFD)是海榄雌属海榄雌科衍生中重要的活性成分，Chiu等在肝癌细胞HCC、Hep3B、HepG2及Huh-7中，同时测定的抗增殖活性，发现化合物NFD能抑制此类肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡(Cancer Letters,2010,295(1):92-99)；Tsai等在乳腺癌细胞MDA-MB-231中进行活性抑制试验，发现NFD可能是通过抑制Src介导的细胞通路阻断MDA-MB-231细胞侵袭与转移，而不影响细胞凋亡或生长停滞(Molecular and Cellular Biochemistry,2014,387(1-2):101-111)；Tsai等发现NFD抑制HGF诱导的乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁徙与侵袭，可能是抑制酪氨酸激酶c-Met磷酸化，控制PI3K与Akt的活化，负调控(NF)-kB及MMP-9的活性，从而在乳腺癌细胞迁移早期达到干预作用(Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology(2014)41,716–726)。Hsieh等选用表皮生长因子(EGF)作为乳腺癌细胞MDA-MB-231的诱导物，发现NFD能抑制EGF介导的c-Jun与c-Fos的蛋白水平，负调控EFGR、PI3K/Akt的磷酸化水平，降低MMP-9的表达和活性，达到抑制肿瘤细胞侵袭与迁移的作用(Toxicology in Vitro,2013,27(1):1-10)。值得重视的是，在抑制EGF诱导MDA-MB-231侵袭与迁移的过程中，NFD并无明显细胞毒作用。但是我们在研究中发现NFD的水溶性很差，在水中几乎不溶，影响其成药性，而且其活性有待进一步提高活性
技术实现要素：
本发明基于天然产物萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮(NFD)的结构，通过结构修饰，发现一类活性好、水溶性高的萘并[1,2-b]-呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物。
本发明的技术方案是，提供一种萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其在药学上可接受的盐，所述萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物的化学结构式如式(I)所示：
其中：
R1、R2、R3、R4分别独立地选自氢、卤素；
R5独立地选自氢、卤素、1-5个碳烷基、芳基。
进一步地，所述R1、R2、R3、R4均为氢。
进一步地，所述R5为氢或甲基。
进一步地，所述盐中的阳离子选自碱金属离子、碱土金属离子、铵离子。
进一步地，化学结构式为：
本发明进一步地提供萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其在药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物的制备方法如下：在萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮衍生物的醋酸和醋酐的混合溶液中，加入浓硫酸的醋酸稀释液，发生磺化反应，反应时间为0.5-24h，反应温度为-10℃～100℃；反应完全，调pH至4-5；柱层析分离即可得到的萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物。
进一步地，将萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物与碱发生酸碱中和反应得其相应的磺酸盐。
进一步地，所述的萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其在药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物上的应用，肿瘤优选为乳腺癌。
本发明的内容涉及萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮-2-磺酸衍生物及其在药学上可接受的盐，其结构式分别为通式(I)和通式(II)；通式(I)和通式(II)化合物的制备方法。
其制备方法如下反应路线所示
a):alph-卤代酮或醛,KI,KOH；b):H2SO4,(AcO)2O,AcOH；c):碱
第一步反应：该步反应环化反应，以市售2-羟基萘醌(A)为原料，按照文献方法 (Toxicology in Vitro,2013,27(1):1-10)和alph-卤代酮或醛反应，制备得到中间体B，反应中，加入碘化钾或碘化钠，可提高反应速度。最终得到化合物B。
第二步反应：该步磺化反应，化合物B在醋酸和醋酐混合溶剂中，发生磺酸化反应，得到相应的磺酸(I)。柱分离得到纯品。洗脱液为甲醇和乙酸乙酯的混和体系。醋酸和醋酐的比例1：1～5，浓硫酸和化合物B的比例为1：1～3，反应温度为0-50℃。醋酸和醋酐的最佳比例1：1～2，浓硫酸和化合物B的比例为1：1～1.5，反应温度为0度至25度。比例均为体积比。
第三步反应：成盐反应。在有机溶剂中，磺酸(I)与无机碱或有机碱发生酸碱中和反应，得到通式(II)的磺酸盐。常用的无机碱有氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸锂、甲醇钠、甲醇钾、乙醇钠、乙醇钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾；常用有机碱为一级胺、二级胺、三级胺、氨基酸。无机碱优选为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、。
选取肿瘤细胞株，通过肿瘤活性筛选方法，测定本发明的化合物对肿瘤细胞的抑制活性。本发明的化合物比天然母体化合物具有更好的抗肿瘤细胞增殖活性，其活性是其母体结构萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮(NFD)的3-5倍。
本发明的有益效果是，通过对母体化合物的结构修饰，使得化合物的水溶性显著提高，其中化合物4,5-二氧代-4,5-二氢-萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸和化合物3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氢萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸的在水中的溶解度大于20mg/mL,化合物4,5-二氧代-4,5-二氢萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸钠和3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氢萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸的溶解度均大于50mg/mL。同时具有更好的抗肿瘤活性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述发明。应理解为，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。
实例1
萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮的制备
单颈瓶中加入氯乙醛3.64mL，浓盐酸1mL，40℃加热活化后待用。2-羟基-1,4-萘醌 0.13g(0.75mmol)，氯乙醛0.26mL(1.6mmol)，碘化钾25mg(0.15mmol)，1mol/L的氢氧化钾溶液1.5mL部分溶解后，80℃回流，TLC检测原料完全消失后，停止反应，加入水30mL稀释，用二氯甲烷萃取反应液(50mL×3)，合并有机层加入无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，过柱纯化(PE/EA＝15:1)，得红色固体B1120mg，产率14％。mp 213-215℃,1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝7.7Hz,1H),7.77(dd,J＝11.6,5.9Hz,1H),7.69(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.54(d,J＝2.0Hz,1H),7.51(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),6.90(d,J＝2.0Hz,1H).
实例2
4,5-二氧代-4,5-二氢-萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸的制备
冰浴条件下，单颈瓶中加入化合物萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮20mg(0.1mmol)，混合溶液3mL(醋酸:醋酐＝3:4)溶解完全，加入浓硫酸40μL(0.1mmol)的醋酸稀释液，室温反应过夜后，TLC监测反应完全，停止反应，加饱和碳酸钠溶液调pH值为7.6，旋干溶剂中的水，加入乙醇0.2mL溶解，过柱纯化(MeOH/EA＝1:4)，得红棕色固体12mg，产率40％。mp 229-240℃,1H NMR(400MHz,D2O)δ7.81(d,J＝7.7Hz,1H),7.62–7.57(m,2H),7.42(m,1H),7.02(s,1H)；13C NMR(125MHz,D2O)δ180.3,175.3,161.6,154.2,136.3,131.6,130.1,128.5,126.7,123.2,120.2,108.6；HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd.For C12H6O6S,277.9885,found:279.1597.
实例3
3-甲基萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮的制备
封管中加入2-羟基-1,4-萘醌125mg(0.72mmol)，溴丙酮150mg(1mmol)，醋酸铵56mg(0.72mmol)，甲苯10mL溶解完全，避光条件下，120℃封管回流24h后，停止反应，旋干甲苯，残渣用1mol/L的盐酸溶液溶解后，加入水30mL稀释，加入二氯甲烷萃取 (50mL×3)，合并有机层加入无水硫酸钠干燥，旋干溶剂，过柱纯化(PE/EA＝15:1)，得红色固体10mg，产率6％。mp 168-169℃1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.92(d,J＝7.6Hz,1H),7.72–7.71(m,3H),7.53(td,J＝7.5,1.4Hz,1H),2.19(d,J＝1.1Hz,3H).
实例4
3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氢萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸的制备
冰浴条件下，单颈瓶中加入实例3所得的3-甲基萘并[1,2-b]呋喃-4,5-二酮22mg(0.1mmol)，混合溶液3mL(醋酸/醋酐＝1:2)溶解完全，加入浓硫酸40μL(0.1mmol)的醋酸稀释液，室温反应过夜后，TLC监测反应完全，停止反应，加饱和碳酸钠溶液调pH值为7.6，旋干溶剂中的水，加入乙醇0.2mL溶解，过柱纯化(MeOH/EA＝1:5)，得红棕色固体414mg，产率48％。mp 185-186℃,1H NMR(500MHz,D2O)δ7.74(d,J＝7.7Hz,1H),7.58(t,J＝7.5Hz,1H),7.51(d,J＝7.6Hz,1H),7.40(t,J＝7.6Hz,1H),2.26(s,3H)；13C NMR(125MHz,D2O)δ180.0,175.5,159.5,149.4,136.4,131.3,130.0,128.0,126.4,122.9,121.7,120.0,22.4.
实例5
4,5-二氧代-4,5-二氢萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸钠的制备
冰浴条件下，单颈瓶中加入实例2所得的4,5-二氧代-4,5-二氢萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸28mg(0.1mmol)，加入1mL乙醇溶解，加入0.1mmol乙醇钠，室温搅拌1小时，旋干溶剂，加入乙醚，有固体析出，过滤，得产品。EI-MS：277(M-Na)+。
实例6
3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氢萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸钠的制备
冰浴条件下，单颈瓶中加入实例4所得的3-甲基-4,5-二氧代-4,5-二氢萘并[1,2-b]呋喃-2-磺酸29mg(0.1mmol)，加入1mL乙醇溶解，加入0.1mmol氢氧化钠，室温搅拌1小时，旋去部分溶剂，加入乙醚，有固体析出，过滤，得产品。EI-MS：291(M-Na)+。
化合物抗肿瘤活性测试
实验方法
1.收集对数期乳腺癌MCF-7细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至4000个每孔，(边缘孔用无菌PBS填充)。
2.于5％二氧化碳，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，在前一天下午铺板，次日上午加药。5-7个浓度梯度，每孔100μL，设3-5个复孔。
3.于5％二氧化碳，37℃孵育16-48h，倒置显微镜下观察细胞生长情况。
4.每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)
8.将各复孔OD值取平均值，计算细胞成活率和抑制率
成活率＝药物组OD值取平均值/对照组OD值取平均值×100％
抑制率＝100％－成活率
根据每个化合物的测试浓度及其对应的抑制率，计算出该化合物的IC50值。
测试结果
表1本发明通式I所示化合物结构和对人类乳腺癌MCF-7细胞株的IC50值化合物对MCF-7细胞(乳腺癌)抑制活性如表1所示：
表1化合物的结构及其抗肿瘤活性