一种用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法与流程

文档序号:11809724阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法,其特征在于,包括以下步骤:

S1对脑肿瘤现有抗原进行调研,归纳总结出可以用于靶向免疫治疗的相关抗原,并找到各个抗原的基因序列;

S2对相关抗原基因序列进行分析,采用了编写的序列分析程序local blast对各个抗原基因进行逐个碱基扫描,找到基因片段保守性较好的区域;

S3针对保守性较好的基因片段设计出各个抗原基因的特异性引物,并用其和人基因组进行比对,防止扩增中非特异产物的产生;

S4检测模板的获得,包括以下步骤:

S41组织样品RNA的提取:取适量RNAlater保存的组织样品,参照TRIzol裂解法提取组织样品RNA;以及

S42获得模板cDNA:以组织样品RNA为模板,oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA;

S5抗原基因的检测:采用qRT-PCR的方法,特异性检测各个抗原基因的表达情况,探知各相关肿瘤抗原在表达水平的变化,包括以下步骤:

S51以步骤S4获得的cDNA为模板,以水为阴性对照,设置空白对照,进行qRT-PCR扩增;以及

S52根据仪器扩增情况,直接观测各抗原特异性引物扩增情况,并根据脑组织中GAPDH的表达情况,得出各个抗原相对的表达情况;

S6检测结果的测序验证:qRT-PCR的产物直接测序验证qRT-PCR的检测结果。

2.根据权利要求1所述的用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法,其特征在于,在步骤S1中,相关抗原的基因包括:GAPDH、AIM2、Art-4、BCAN、BSG、CD133、CHI3L2、COX-1、COX-2、CSPG4、EphA2、Ezh2、FABP7、Fosl1、FOXP3、Glast、GnT-V、gp100、HB-EGF、HNRPL、HO-1、IDO1、IDO2、IGF2BP3、IL13-Rα2、IQGAP1、ITGAV、KIF1C、KIF21B、KIFC3、Lck、Mart-1、MELK、MRP3、NLGN4X、NrCAM、NY-ESO-1、OFA/iLRP、PCNA、PDL-1、PDL-2、PGE2、PIK3R1、Prame、PTH-rP、PTPRZ1、Sart-1、Sart-2、Sart-3、SEC61G、Sox10、Sox11、Sox-2、SPANX-B、STAT3、Survivin、TDO2、TNC、TRP-1、TRP2、Tyrosinase、Ube2V、Whsc2、WT1、YKL-40。

3.根据权利要求1所述的用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法,其特征在于,在步骤S41中,组织样品RNA的提取包括以下步骤:

S411组织样品的选取和制备:手术切下的肿瘤组织,切除边缘,选取中间完好的组织块在最短的时间内放置于RNAlater中在-80℃下保存,防止RNA降解;

S412取30mg RNAlater保存样品,加1ml TRIzol充分研磨,使组织块充分裂解,按200μl/ml TRIzol的比例加入氯仿,充分震荡混匀,4℃,12000rpm离心15分钟;

S413取上层水相于另一离心管中,加入等体积异丙醇沉淀RNA,4℃,12000rpm离心10分钟,收集沉淀的RNA;

S414用75%乙醇清洗沉淀得到的RNA,4℃,12000rpm离心10分钟;

S415弃掉乙醇,待乙醇挥发殆尽,适量DEPC水溶解组织样品RNA。

4.根据权利要求3所述的用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法,其特征在于,在步骤S42中,获得模板cDNA包括以下步骤:

S421准确测得组织样品RNA浓度;

S422按照高容量cDNA反转录试剂盒说明书严格在冰上配置好反转体系;

S423轻柔混匀反应体系,经PCR反应,获得模板cDNA;

S424用SYBR® Select Master Mix配置反应体系,引物为正向引物和反向引物,用人内参基因(GAPDH)进行qRT-PCR扩增各组织样品,以确保RNA的提取质量及获得的cDNA质量。

5.根据权利要求4所述的用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法,其特征在于,在步骤S52中,肿瘤相关抗原的qRT-PCR检测包括以下步骤:

根据qRT-PCR扩增情况,得到相应抗原基因的Ct值,根据该样品GAPDH的扩增情况,计算出相对该肿瘤样品GAPDH的相对表达,或采用2-ΔΔCt的计算方法计算出不同肿瘤相关抗原相对自身正常组织的表达情况,为特异抗原致敏DC的免疫治疗提供依据。

6.根据权利要求5所述的用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法,其特征在于:在步骤S424中,所述正向引物为SEQ ID NO:1 - SEQ ID NO:65,相对应的反向引物为SEQ ID NO:66 - SEQ ID NO:130。

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