一种用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，具体来说，涉及一种用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法。

背景技术：

脑肿瘤是严重威胁人类健康的常见疾病，据统计，恶性脑肿瘤占所有已知癌症患者的2％，占儿童肿瘤发病率的25％-30％，是我国乃至全世界公关的重点疾病之一。近年来，对脑肿瘤的发生发展机制和病理改变都有了越来越多的认识，但临床应用依然以手术治疗、放疗和化疗为脑肿瘤的主要治疗手段，虽然综合了先进的技术，但脑肿瘤由于其存在的特殊性，导致了患者复发几率大，预后差，依然有较高的伤残率和死亡率。

对肿瘤发生发展机制的研究表明，经过手术，辅助放、化疗之后机体内残留的肿瘤细胞往往能逃脱出机体的免疫机制而继续生长。机体不能良好的识别和呈递抗原是免疫逃逸的因素之一。近年来发展起来的DC免疫治疗就是针对于肿瘤细胞表明特异性抗原的识别和呈递，来靶向呈递特异性肿瘤抗原，进而促使机体免疫系统杀死表达此抗原的肿瘤细胞。自1974年Ralph Marvin Steinman首次提出树突状细胞的概念，到2007年成功采用肿瘤裂解物负载DC的治疗方法治疗自己的胰腺癌，延长了生存期，也因此获得了2011年诺贝尔生理与医学奖。然而它的非靶向性也在一定程度上限制了它的疗效。近年发展起来的特异性抗原mRNA负载DC的治疗有效的解决了这个问题，但肿瘤抗原的选择和检测也就成了树立在我们面前的最大问题。

根据已有的脑肿瘤相关抗原信息，从中筛选了在肿瘤组织较正常组织会有表达差异的基因，如PTPRZ1等64个抗原基因，并设计出特异性的引物对每位患者进行特异性抗原的检测，找出每位患者肿瘤细胞高表达的抗原基因，进而采用高表达的抗原mRNA来负载DC，进行高度靶向性的抗肿瘤免疫治疗，提高DC呈递抗原的能力，并激活体内的免疫系统靶向的杀死表达特异性抗原的肿瘤细胞，以延长生存期。

如何准确、快速的检测出各肿瘤组织抗原的表达情况是免疫治疗靶向杀伤肿瘤细胞的关键因素，针对于肿瘤组织抗原表达的检测从肿瘤发现开始延续至今。采用的方法主要为RT-PCR、免疫组化、免疫印迹及近年来发展起来的全基因测序等。这些检测方法各有优势，但操作复杂，耗时较长、成本相对较大、检测结果不直观，一定程度上限制了这些方法的推广使用。

技术实现要素：

针对上述的相关技术问题，本发明提出了一种具有高灵敏度、高准确性，且耗时短、结果直观的肿瘤组织多抗原检测的方法。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法，包括以下步骤：

S1对脑肿瘤相关抗原进行调研，归纳总结出可以用于免疫治疗的肿瘤相关抗原，并找到各个抗原的基因序列；

S2对相关抗原基因序列进行分析，采用了编写的序列分析程序local blast对各个抗原基因进行逐个碱基扫描，找到基因片段保守性较好的区域；

S3针对保守性较好的基因片段设计出各个抗原基因的特异性引物，并用其和人基因组进行比对，防止扩增中非特异产物的产生；

S4检测模板的获得：采用qRT-PCR的方法检测各抗原基因的表达情况，更加灵敏、准确的探知各相关肿瘤抗原在表达水平的变化，有利于对其进行特异性的靶向治疗，包括以下步骤：

1)组织样品RNA的提取：取适量RNAlater保存的组织样品，参照TRIzol裂解法提取组织样品RNA；

2)获得模板cDNA：以组织样品RNA为模板，oligo dT为引物进行RNA的反转录得到组织样品cDNA；

S5抗原基因的检测：采用qRT-PCR的方法，特异性的检测各个抗原基因在肿瘤组织样品中的表达情况，包括以下步骤：

1)以步骤S4获得的cDNA为模板(以水为阴性对照，设置空白对照)，进行qRT-PCR扩增；

2)根据仪器扩增情况，直接观测各抗原特异性引物扩增情况，并根据脑组织中GAPDH(GAPDH)的表达情况，得出各个抗原相对的表达情况，指导免疫治疗的进行；

S6检测结果的测序验证：qRT-PCR的产物直接测序验证qRT-PCR的检测结果。

进一步的，在步骤S1中，相关抗原的基因包括：GAPDH、AIM2、Art-4、BCAN、BSG、CD133、CHI3L2、COX-1、COX-2、CSPG4、EphA2、Ezh2、FABP7、Fosl1、FOXP3、Glast(天冬氨酸转运体)、GnT-V、gp100、HB-EGF、HNRPL、HO-1、IDO1、IDO2、IGF2BP3、IL13-Rα2、IQGAP1、ITGAV、KIF1C、KIF21B、KIFC3、Lck、Mart-1、MELK、MRP3、NLGN4X、NrCAM、NY-ESO-1、OFA/iLRP、PCNA、PDL1、PDL2、PGE2、PIK3R1、Prame(黑色素瘤特异性抗原)、PTH-rP、PTPRZ1、Sart-1、Sart-2、Sart-3、SEC61G、Sox10、Sox11、Sox2、SPANX-B、STAT3、Survivin(存活素)、TDO2、TNC、TRP-1、TRP2、Tyrosinase(酪氨酸酶)、Ube2V、Whsc2、WT1、YKL-40。

本发明的有益效果：本发明对于脑肿瘤的多抗原基因检测具有灵敏度高、准确性高的优点，且耗时短，结果直观，可以在短时间内检测脑肿瘤相关抗原的表达情况，为肿瘤特异性抗原mRNA负载DC的免疫治疗提供良好的前提和基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是根据本发明实施例所述的GAPDH扩增各组织样品，用qPCR仪扩增结果，其中，A为GAPDH的扩增曲线，B为GAPDH的溶解曲线；A中，从左至右依次是样品P1、P2、阴性对照、空白对照样品的GAPDH扩增曲线；B中，从左至右依次是样品P1、P2、阴性对照、空白对照样品的GAPDH溶解曲线；

图2为以PTPRZ1为例的抗原基因扩增情况，其中，A为基因的扩增曲线，B为基因的溶解曲线；A中，从左至右依次是样品P1、P2、阴性对照、空白对照样品的PTPRZ1扩增曲线；B中，从左至右依次是样品P1、P2、阴性对照、空白对照样品的PTPRZ1溶解曲线；

图3为以PTPRZ1为例的抗原基因测序鉴定结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

根据本发明实施例所述的一种用于脑肿瘤免疫治疗的多抗原检测方法，包括以下步骤：

1脑肿瘤相关抗原的归纳总结

对已有文献报道及Clinical trail网站注册临床试验中脑肿瘤相关抗原进行调研，充分搜索资料后，确定如PTPRZ1等可用于DC致敏的肿瘤相关抗原。

2各肿瘤相关抗原基因序列分析和引物设计

利用编写的序列分析程序对各个抗原基因进行逐个碱基扫描，得到各个抗原基因的保守性区域，并根据这些区域设计出特异性扩增引物。利用NCBI引物搜索软件检测各个抗原基因引物在人基因组中的特异性，得到如下表1的检测引物(包括正向引物SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:65以及相应的反向引物SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:130)。

表1肿瘤相关抗原基因qRT-PCR检测引物

3检测模板的获得

已有报道肿瘤相关抗原检测多采用免疫组化的方法，虽然能直接检测肿瘤组织中相关蛋白的表达情况，但免疫组化耗时长，假阳性结果等诸多因素限制了其在DC免疫治疗中的适用性。因此，我们采用qRT-PCR的方法，在分子水平得到较正常组织中肿瘤相关抗原的表达情况，为脑肿瘤的靶向DC治疗打下基础。

1)组织样品RNA的提取，包括如下步骤：

1.1)组织样品的选取和制备：手术切下的肿瘤组织，切除边缘，选取中间完好的组织块在最短的时间内放置于RNAlater中在-80℃下保存，防止RNA降解；

1.2)取30mg RNAlater保存样品，加1ml TRIzol充分研磨，使组织块充分裂解，按200μl/ml TRIzol的比例加入氯仿，充分震荡混匀，4℃，12000rpm离心15分钟；

1.3)取上层水相于另一EP(离心)管中，加入等体积异丙醇沉淀RNA，4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀的RNA；

1.4)用75％乙醇清洗沉淀得到的RNA，4℃，12000rpm离心10分钟；

1.5)弃掉乙醇，待乙醇挥发殆尽，适量DEPC水溶解组织样品RNA；

2)模板cDNA的获得，包括：

2.1)准确测得组织样品RNA浓度；

2.2)按照高容量cDNA反转录试剂盒说明书严格在冰上配置好反转体系；

表2：cDNA获得反应体系

轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，PCR反应，获得模板cDNA；

表3：cDNA获得反应程序

2.3)用Select Master Mix配置反应体系，引物为正向引物(SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:65)和反向引物(SEQ ID NO:66-SEQ ID NO:130)，用人内参基因(GAPDH)进行qRT-PCR扩增各组织样品，以确保RNA的提取质量及获得的cDNA质量；

表4：GAPDH扩增体系

表5：GAPDH扩增程序

3.肿瘤相关抗原的qRT-PCR检测

3.1)以步骤2中获得cDNA链为模板，参照GAPDH扩增体系配制各个肿瘤相关抗原体系进行qRT-PCR扩增：

表6：PCR扩增程序

3.2)根据qRT-PCR扩增情况，得到相应抗原基因的Ct值，根据该样品GAPDH的扩增情况，计算出相对该肿瘤样品GAPDH的相对表达，也可以采用2^-ΔΔC的计算方法计算出不同肿瘤相关抗原相对自身正常组织的表达情况，为特异抗原致敏DC的免疫治疗提供依据。

如图1所示，A：从左至右依次是样品P1、P2、阴性对照、空白对照样品的GAPDH扩增曲线；B：从左至右依次是样品P1、P2、阴性对照、空白对照样品的GAPDH溶解曲线。如图1A中所示，其中，样品P1、P2的Ct值分别约为15和18个循环，而阴性对照和空白对照样品的Ct值>39，表明扩增反应没有污染，若有污染，阴性对照和空白对照样品也会检测到Ct值在18-30之间。如图1B中所示，其中，样品P1、P2溶解曲线温度单峰，表明引物特异性很好，同时，其溶解曲线温度为87摄氏度，在qRT-PCR溶解曲线要求范围内，表明扩增的结果准确可靠，而阴性对照和空白对照样品没有溶解曲线单峰，说明没有污染。

如图2所示，A：从左至右依次是样品P1、P2、阴性对照、空白对照样品的PTPRZ1扩增曲线；B：从左至右依次是样品P1、P2、阴性对照、空白对照样品的PTPRZ1溶解曲线。如图2A中所示，其中，样品P1、P2扩增PTPRZ1基因时，Ct值分别为24个循环和25个循环左右，而内参基因分别为15和18个循环，说明该基因表达水平比内参基因要低。如图2B中所示，其中，样品P1、P2溶解曲线温度单峰，表明引物特异性很好，同时，其溶解曲线温度为83摄氏度，在qRT-PCR溶解曲线要求范围内，表明扩增的结果准确可靠，而阴性对照和空白对照样品没有溶解曲线单峰，表明没有污染。

S4.检测结果的测序验证，包括步骤：

4.1)测序样品获得：回收各个肿瘤相关性抗原基因的qRT-PCR产物作为测序底物；

4.2)测序确定qRT-PCR结果；

4.3)根据测序结果，及各个肿瘤相关性抗原基因序列进行整体的序列分析，以确定qRT-PCR扩增的准确性。

如图3所示，对各个肿瘤相关性抗原基因的qRT-PCR产物测序分析，并利用序列分析软件比对测序结果。其中，P1和P2为待检测肿瘤样品，PTPRZ1为目的基因序列，第四行是前三个序列的共有序列。结果表明，测序出的序列和目的基因序列完全一致，即qRT-PCR产物就是PTPRZ1基因的一段，大小为160bp，说明引物的特异性良好，且qRT-PCR产物就是PTPRZ1序列。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。