一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法。该方法从抗肿瘤的淋巴细胞和来自癌症患者的外周血单个核细胞提取RNA样品，然后合成cDNA；再利用通用引物和T细胞受体特定引物来扩增T细胞受体β链基因可变区段；扩增后的T细胞受体β链基因可变区段产物，经纯化后克隆到pcDNA3.1／TA载体。然后克隆的载体转化到感染态细菌细胞，培养形成单克隆细菌群落。单克隆细菌群落进一步进行液体培养，分离纯化质粒DNA，用TCR-CB-50R引物进行T细胞受体β链基因可变区段的序列测定；或者单克隆细菌群落不经液体培养直接进行测序；最后进行序列比对，确定输入癌症患者体内的抗肿瘤淋巴细胞是否在病人存活，从而早期判断肿瘤免疫治疗的效果。
【专利说明】一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其涉及的是一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法。
【背景技术】
[0002]环境污染和遗传因素会导致DNA和基因的突变。癌细胞起源于人体内细胞由于DNA和基因突变的无控制生长。通常，癌细胞生长形成肿瘤，癌细胞还会转移到别处继续生长，从而破坏正常的组织器官，导致病人的死亡。据统计，目前癌症是继心血管之后的第二位导致人类死亡的因素，大约一半的男人和三分之一多的女人会产生癌症。《2012中国肿瘤登记年报》对外发布，报道全国每6分钟就有一人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每年新发癌症病例约350万，每七到八人中就有一人死于癌症，每年因癌症死亡约250万。
[0003]肿瘤的免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型生物技术治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤的免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
[0004]利用特异的杀伤性淋巴细胞进行肿瘤免疫治疗起源于八十年代，利用抗肿瘤的淋巴细胞进行肿瘤免疫治疗是一种特异、有效而先进的癌症治疗手段。近年来，这一技术在皮肤癌晚期病人的治疗上得到成功的应用。临床试验证明，四分之三的皮肤癌晚期病人经过治疗后癌症肿块明显消退，一半的皮肤癌晚期病人完全康复。因此，利用抗肿瘤的淋巴细胞进行肿瘤细胞免疫治疗是一种非常有效的癌症治疗新技术，有着广阔的应用前景。
[0005]如果能早期判断肿瘤免疫治疗的效果，那对癌症病人的治疗有着极其重要的意义。研究表明，肿瘤免疫治疗的效果很大程度上取决于抗肿瘤淋巴细胞(主要是T淋巴细胞)在输入癌症患者后在病人体内的存活时间。也就是说，如果能够早期测定抗肿瘤淋巴细胞在癌症病人体内的存在状况，就可以早期判断肿瘤免疫治疗的效果。
[0006]T淋巴细胞在发育分化过程中，都会在细胞表面产生一种特定的受体，即T细胞受体。每一个T淋巴细胞克隆或每一种T淋巴细胞种群，都含有一种特异的T细胞受体。因此，如果能够测定T淋巴细胞上的T细胞受体，就可以正确判断特定的抗肿瘤淋巴细胞在癌症病人体内的存活状况。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术在判定肿瘤免疫治疗效果中存在的不足，提供了一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法。
[0008]本发明的技术方案如下:
[0009]一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法，其步骤如下:
[0010](I)取五百万用于肿瘤免疫治疗的抗肿瘤淋巴细胞备用；在肿瘤免疫治疗之前、治疗后的7天、一个月和两个月，从癌症病人静脉抽取10毫升外周血，置于抗血凝的试管，4°C短暂保存；
[0011](2)根据产品使用说明书，用淋巴细胞分离液从⑴所述外周血分离外周血单个核细胞；
[0012](3)使用美国QIAGEN公司的RNeasy试剂盒和产品使用说明书，从五百万抗肿瘤淋巴细胞和外周血单个核细胞中提取总RNA ；
[0013](4)取每个样品100微克总RNA，使用美国CLONTECH公司的5’ -RACE试剂盒和产品使用说明书，用5 ’ -RACE CDS引物合成eDNA ；
[0014](5)将2.5微升cDNA产物与I毫摩尔dNTP底物、0.4微摩尔3’ TCRBCN引物、一倍浓度扩增缓冲液和DNA聚合酶混合，在PCR扩增仪进行94°C 30秒和72°C 2分钟热循环5次，然后94°C 30秒、65°C 30秒和72°C 2分钟热循环25次，最后在72°C保温10分钟，得到T细胞受体β链基因可变区段；
[0015](6)使用美国Zymoclean公司的DNA凝胶回收试剂盒并根据产品说明书对T细胞受体β链基因可变区段进行DNA纯化；纯化后，使用美国Invitrogen公司的TA克隆试剂盒并根据产品说明书，将纯化后产物克隆到pcDNA3.1 / V5-His?TOPO? TA载体；
[0016](7)将克隆的载体通过化学转导法将其转化到T0P10感染态细菌细胞，在LB细菌平板培养基上37°C过夜培养16小时后形成单克隆细菌群落；
[0017](8)挑选单克隆细菌群落，将一个细菌菌落转入1.5毫升LB液体培养基中，然后37 °C震荡培养，转速为每分钟250转；液体培养15小时后，使用美国QIAGEN公司的质粒DNA分离试剂盒并根据产品说明书，从细菌中分离纯化质粒DNA ；
[0018](9)将从细菌中分离·纯化的质粒DNA，用TCR-CB-50R引物对其进行T细胞受体β链基因可变区段的序列测定；或者将(7)所述单克隆细菌群落不经液体培养直接进行测序;
[0019](10)序列分析:序列测定后的T细胞受体β链基因可变区段，与已知的T细胞受体β链基因可变区段基因库进行序列对比，以确定T细胞受体β链基因的特定种类；从而确定抗肿瘤淋巴细胞和外周血单个核细胞的T细胞组成。
[0020]所述的淋巴细胞分离液为美国MP公司的Lymphocyte Separation Medium, 6.2克聚蔗糖Ficoll和9.4克泛影酸钠/ 100ml。
[0021]本发明能够在利用特异的杀伤性淋巴细胞进行肿瘤免疫治疗的早期，判断癌症病人的治疗效果。利用本发明早期发现肿瘤免疫治疗无效，有助于赢得时间，为癌症病人实施其它有效的治疗手段和方法。因此，利用本发明可以缩短疗效观测时间、减轻癌症病人的痛苦以及降低病人的经济负担。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为利用肿瘤免疫治疗的基因检测法测定抗肿瘤淋巴细胞在癌症病人(CR)的外周血组织(PBL)中所含有的T细胞种类，所具有的T细胞受体β链基因可变区段序列及其与抗肿瘤的T细胞克隆TRBV29-1序列的比较。
[0023]图2为利用肿瘤免疫治疗的基因检测法测定抗肿瘤淋巴细胞在癌症病人(CR)体内的存活。[0024]图3为经肿瘤免疫治疗后抗肿瘤淋巴细胞存活于癌症病人的临床效果。
【具体实施方式】
[0025]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0026]实施例
[0027]从黑色素瘤癌症病人(CR)中静脉抽取10毫升外周血。根据产品使用说明书，用淋巴细胞分离液(Lymphocyte Separation Medium,美国MP公司产品，6.2克聚鹿糖Ficoll和
9.4克泛影酸钠/ 100mL)从外周血分离外周血单个核细胞。然后,取五百万外周血单个核细胞，使用美国QIAGEN公司的RNeasy试剂盒和产品使用说明书，用于总RNA的提取。使用美国CLONTECH公司的5’-RACE试剂盒和产品使用说明书，用5’-RACE⑶S引物合成cDNA。下一步，利用通用引物(Universal primerAmix,UPM)和T细胞受体特定引物(3’TCRBCN),将2.5微升cDNA产物与I毫摩尔dNTP底物、0.4微摩尔3’TCRBCN引物、一倍浓度扩增缓冲液和DNA聚合酶混合，在PCR扩增仪进行94°C 30秒和72°C 2分钟热循环5次，然后94°C 30秒、65°C 30秒和72°C 2分钟热循环25次，最后在72°C保温10分钟，因而从cDNA扩增得到T 细胞受体 β 链基因可变区段(Τ cell receptor beta chain variable region, TRBV)。使用美国Zymoclean公司的DNA凝胶回收试剂盒并根据产品说明书对T细胞受体β链基因可变区段进行DNA纯化。经纯化后，DNA扩增产物克隆到pcDNA3.1 / V5-His?TOPO?' TA载体，并通过化学转导法将其转化到T0P10感染态细菌细胞，在LB细菌平板培养基上培养形成单克隆细菌群落。挑选单克隆细菌群落，在LB液体培养基中进一步进行液体培养。经15小时液体培养，从细菌中分离纯化质粒DNA。然后，用TCR-CB-50R引物对纯化的质粒DNA进行T细胞受体β链基因可变区段的序列测定。序列测定后的T细胞受体β链基因可变区段，与已知的T细胞受体β链基因可变区段基因库进行序列对比，以确定T细胞受体β链基因的特定种类，并与抗肿瘤淋巴细胞克隆(TRBV29-1)序列比较(图1)。
[0028]如图1所示，肿瘤免疫治疗的基因检测法可以用于抗肿瘤淋巴细胞的T细胞种类在癌症病人中的检测和判断。结果表明，抗肿瘤淋巴细胞中的TRBV29-1淋巴细胞克隆与癌症病人外周血组织中的大多淋巴细胞的T细胞受体β链基因可变区段的序列不一样。只有一种T淋巴细胞(CR-PBL-26)与抗肿瘤淋巴细胞中的T细胞克隆TRBV29-1是同一种。
[0029]在使用抗肿瘤淋巴细胞进行肿瘤免疫治疗黑色素瘤癌症病人(CR)之前一周以及免疫治疗后一星期、一个月和两个月，分别从黑色素瘤癌症病人(CR)静脉抽取外周血各10毫升。根据产品使用说明书，用淋巴细胞分离液(Lymphocyte Separation Medium,美国MP公司产品，6.2克聚鹿糖Ficoll和9.4克泛影酸钠/ 100ml)从外周血分离外周血单个核细胞样品。然后，每个样品各取五百万外周血单个核细胞和五百万用于肿瘤免疫治疗的抗肿瘤淋巴细胞，使用美国·QIAGEN公司的RNeasy试剂盒和产品使用说明书，进行总RNA的提取。使用美国CLONTECH公司的5’ -RACE试剂盒和产品使用说明书，用5’ -RACE⑶S引物合成cDNA。下一步,利用通用引物(Universal primer Amix, UPM)和T细胞受体特定引物(3，TCRBCN)，将2.5微升cDNA产物与I毫摩尔dNTP底物、0.4微摩尔3’ TCRBCN引物、一倍浓度扩增缓冲液和DNA聚合酶混合，在PCR扩增仪进行94°C 30秒和72°C 2分钟热循环5次，然后94°C 30秒、65°C 30秒和72°C 2分钟热循环25次，最后在72°C保温10分钟，因而从每个样品的cDNA扩增得到T细胞受体β链基因可变区段(Τ cell receptor betachain variable region, TRBV)。使用美国Zymoclean公司的DNA凝胶回收试剂盒并根据产品说明书对T细胞受体β链基因可变区段进行DNA纯化。经纯化后，DNA扩增产物克隆到pcDNA3.1 / V5-His?TOPO? TA载体，并转化到TOPlO感染态细菌细胞，在LB细菌平板培养基上培养形成单克隆细菌群落。挑选单克隆细菌群落，在LB液体培养基中进一步进行液体培养。经15小时液体培养，从细菌中分离纯化质粒DNA。然后，用TCR-CB-50R引物对纯化的质粒DNA进行T细胞受体β链基因可变区段的序列测定。序列测定后的T细胞受体β链基因可变区段，与已知的T细胞受体β链基因可变区段基因库进行序列对比，以确定T细胞受体β链基因的特定种类，并与抗肿瘤淋巴细胞克隆(TRBV29-1)序列比较，计算抗肿瘤淋巴细胞克隆(TRBV29-1)在每个外周血单个核细胞样品和用于肿瘤免疫治疗的抗肿瘤淋巴细胞中所占的百分率，作图比较抗肿瘤淋巴细胞克隆(TRBV29-1)在每个样品中的差另IJ (图2)。
[0030]图2所示，肿瘤免疫治疗的基因检测法可以用于抗肿瘤淋巴细胞经肿瘤免疫治疗后在癌症病人(CR)体内的存活。结果表明，用于肿瘤免疫治疗的抗肿瘤淋巴细胞含有一种T细胞种类-TRBV29-1，可以在肿瘤免疫治疗后的第一星期、第一个月和第二个月，可以从癌症病人(CR)外周血淋巴细胞中检测到。结果说明，抗肿瘤淋巴细胞中至少有一种T细胞种群经肿瘤免疫治疗后在癌症病人中存活两个月以上。这一种T细胞，在癌症病人经肿瘤免疫治疗后一星期时就可以在外周血淋巴细胞中检测到，表明肿瘤免疫治疗的基因检测法可以用于早期肿瘤免疫治疗效果的测定。
[0031]黑色素瘤癌症病人(CR)在接受肿瘤免疫细胞治疗之前一周，在肺部、右侧腋下淋巴结、腹部内壁和臀部进行电脑断层扫描，参见图3左列扫描照片。黑色素瘤癌症病人(CR)在接受肿瘤免疫细胞治疗之后两个月，在肺部、右侧腋下淋巴结、腹部内壁和臀部再次进行电脑断层扫描，参见图3右 列扫描照片。
[0032]图3显示,经肿瘤免疫治疗后有两种T淋巴细胞存活的癌症病人(CR),与治疗前(左图所示)相比，肿瘤组织明显缩小以至于完全消失(右图所示)。图中最上面第一排比较了肺部肿瘤块经肿瘤免疫治疗后的消失结果，图中第二排比较了右侧腋下淋巴结中的肿瘤块经肿瘤免疫治疗后的消失结果，图中第三排比较了腹部内壁肿瘤块经肿瘤免疫治疗后的明显缩小结果，图中最下面第四排比较了臀部肌肉中的肿瘤块经肿瘤免疫治疗后的明显缩小结果。结果证明，经肿瘤免疫治疗后抗肿瘤淋巴细胞在癌症病人体内的存活可以预示肿瘤免疫治疗的效果。因此，肿瘤免疫治疗的基因检测法可以用于测定抗肿瘤淋巴细胞经肿瘤免疫治疗后在癌症病人体内的存活，从而，可以早期判断肿瘤免疫治疗的效果。
[0033]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种肿瘤免疫治疗效果的基因检测方法，其特征是，其步骤如下: (1)取五百万用于肿瘤免疫治疗的抗肿瘤淋巴细胞备用；在肿瘤免疫治疗之前、治疗后的7天、一个月和两个月，从癌症病人静脉抽取10毫升外周血，置于抗血凝的试管，4°C短暂保存； (2)根据产品使用说明书，用淋巴细胞分离液从(I)所述外周血分离外周血单个核细胞； (3)使用美国QIAGEN公司的RNeasy试剂盒和产品使用说明书，从五百万抗肿瘤淋巴细胞和外周血单个核细胞中提取总RNA ； (4)取每个样品100微克总RNA，使用美国CLONTECH公司的5’-RACE试剂盒和产品使用说明书，用5’ -RACE CDS引物合成cDNA ； (5)将2.5微升cDNA产物与I毫摩尔dNTP底物、0.4微摩尔3’TCRBCN引物、一倍浓度扩增缓冲液和DNA聚合酶混合，在PCR扩增仪进行94°C 30秒和72°C 2分钟热循环5次，然后94°C 30秒、65°C 30秒和72°C 2分钟热循环25次，最后在72°C保温10分钟，得到T细胞受体β链基因可变区段； (6)使用美国Zymoclean公司的DNA凝胶回收试剂盒并根据产品说明书对T细胞受体β链基因可变区段进行DNA纯化；纯化后，使用美国Invitrogen公司的TA克隆试剂盒并根据产品说明书，将纯化后产物克隆到pcDNA3.1 / V5-His?TOPO? TA载体； (7)将克隆的载体通过化学转导法将其转化到TOPlO感染态细菌细胞，在LB细菌平板培养基上37°C过夜培养16小时后形成单克隆细菌群落； (8)挑选单克隆细菌群 落，将一个细菌菌落转入1.5毫升LB液体培养基中，然后37°C震荡培养，转速为每分钟250转；液体培养15小时后，使用美国QIAGEN公司的质粒DNA分离试剂盒并根据产品说明书，从细菌中分离纯化质粒DNA ； (9)将从细菌中分离纯化的质粒DNA，用TCR-CB-50R引物对其进行T细胞受体β链基因可变区段的序列测定；或者(7)所述单克隆细菌群落不经液体培养直接进行测序； (10)序列分析:序列测定后的T细胞受体β链基因可变区段，与已知的T细胞受体β链基因可变区段基因库进行序列对比，以确定T细胞受体β链基因的特定种类；从而确定抗肿瘤淋巴细胞和外周血单个核细胞的T细胞组成。
2.根据权利要求1所述的基因检测方法，其特征是，淋巴细胞分离液为美国MP公司的Lymphocyte Separation Medium,6.2 克聚鹿糖 Ficoll 和 9.4 克泛影酸钠 / 100ml。
【文档编号】C12Q1/68GK103865998SQ201310690714
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】周菊华 申请人:周菊华