Gⅰ型诺如病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种GⅠ型诺如病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。检测引物组包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP，分别如SEQ?ID?NO.1、2、3和4所示。本发明建立了GⅠ型诺如病毒的LAMP检测方法，本检测方法针对GⅠ型诺如病毒的RNA多聚酶基因，设计和筛选了一套特异性引物（4条引物），包括两个特异性内引物和两个特异性外引物。本发明采用LAMP技术，特异性强，且比RT-PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，可用于GⅠ型诺如病毒的检测，特别适合于基层现场应用。
【专利说明】G I型诺如病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种G I型诺如病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。
【背景技术】:
[0002]诺如病毒感染性腹泻具有发病急、传播速度快、涉及范围广等特点，是引起非细菌性腹泻暴发的主要病因。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。不同地区、不同时间流行的诺如病毒，其基因RNA多聚酶区序列相对保守。根据RNA多聚酶区核苷酸序列的相似性，诺如病毒被分为5个基因群(genogroup)。同一基因群内的诺如病毒，其主要衣壳蛋白(major capsid protein)氨基酸序列的异质性约为30%,但不同基因群间的诺如病毒，其主要衣壳蛋白(major capsid protein)氨基酸序列的异质性超过50%。目前已知，感染人类的诺如病毒至少包括基因I群、II群和IV群。诺如病毒对各种理化因素有较强的抗性，已知其耐热和耐冻，60°C孵育30min仍有感染性，冷冻数年后仍保持活性；对乙醚和酸稳定，20%乙醚4°C处理可存活18h，室温pH2.7环境下可存活3h。诺如病毒对处理污水的IOppm的氯浓度敏感,但对处理饮用水的3.75~6.25ppm的氯浓度耐受。此外，诺如病毒的感染剂量很低，10-100个病毒粒子即可使人致病，而且诺如病毒常呈暴发流行，因此，即使环境中存在的微量病毒，仍然对人得健康存在很大威胁。
[0003]诺如病毒遗传高度变异，在同一时期和同一社区内可能存在遗传特性不同的毒株流行。诺如病毒抗体没有显著的保护作用，尤其是没有长期免疫保护作用，极易造成反复感染。诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻暴发中，60-90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在发展中国家，诺如病毒感染性腹泻普遍存在，也常引起暴发流行。在我国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15%左右，血清抗体水平调查表明我国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。
[0004]目前诺如病毒病原的检测方法有电镜技术、病毒分离培养技术、免疫学技术及分子生物学技术，但上述的前三种技术往往存在灵敏度较低、操作繁琐耗时、需要大型昂贵的仪器设备等缺点，在应用时往往有其局限性，尤其不能适用于大规模的病原筛查和检测等实际应用。分子生物学技术，其中尤其以RT-PCR检测技术由于其快速、灵敏、适合处理大通量的样品等特点，在病毒检测中显示出其优越性并越来越多的得以应用，但该方法从检测到结果的判读仍然需要多种专用仪器，操作较为繁琐，所需时间仍然在5小时以上，常有非特异性出现等缺陷。LAMP方法是2000年Notomi等开发的一种新型核酸扩增技术,针对待测靶基因的6个区域设计4-6条特异性引物，在BstDNA聚合酶的作用下，在65°C左右等温条件Ih内可以进行特异高效快速的核酸扩增，达到IO9拷贝，扩增结果可直接观察焦磷酸镁沉淀或者加入显色剂进行判断。近年来LAMP方法已广泛用于细菌、病毒等致病微生物的检测，并在此基础上发展了 RT-LAMP检测方法，成功应用于多种RNA病毒的检测。
【发明内容】
:
[0005]本发明的第一目的是提供一种应用环介导等温扩增检测G I型诺如病毒(norovirus)的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测G I型诺如病毒(norovirus)。
[0006]本发明的应用环介导等温扩增检测G I型诺如病毒的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成: [0007]上游外引物F3:5’ -AGCATGGGACTCAACACA-3’ ；(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0008]下游外引物B3:5’ -ATGGGAATCCAGATGGCA-3’ ；(如 SEQ ID N0.2 所示)
[0009]上游内引物FIP:5 ’ -CAATTCTGGTGAGGCCGTAAG-TAGACAAATTATGACAGAATCCTTC-3，；(如 SEQ ID N0.3 所示)
[0010]下游内引物BIP:5’ -CGAGGTTGTGGCCCAAGATT-CCTCTTTGACCCTGATGAC-3，。(如 SEQID N0.4 所示)
[0011]本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的G I型诺如病毒的检测方法，其特征在于，对样品进行病毒RNA提取，再反转录成cDNA，然后通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对cDNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。
[0012]所述的样品可以为医院的腹泻样品，以及水、食品等。
[0013]所述的通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对cDNA进行选择性扩增具体为:环介导等温扩增体系为:体系总体积20-100 μ L，包括IOXThermopol反应缓冲液、10mmol/LdNTPsU0 μ mol/L 上游外引物 F3、10 μ mol/L 下游外引物 Β3、40 μ mol/L 上游内引物 FIP,40 μ mol/L 下游内引物 BIP、IOOmmoI/L MgS04、2mol/L 甜菜碱、1-5 μ L8U/ μ L BstDNA聚合酶和1-5 μ L cDNA,加灭菌双蒸水ddH20至反应总体积，反应条件为在温度为63°C孵育 40-70min。
[0014]所述的确认是否存在有扩增产物可以利用电泳检测、荧光显色检测或浊度检测环介导等温扩增反应产物是否具有扩增产物，优选用荧光显色检测，具体是在终止反应的反应管中加入lyL10%SYBR Green I显色剂，IOmin后观察结果，如果颜色为黄色，则样品G I型诺如病毒阴性，无G I型诺如病毒，如果颜色为绿色，则样品G I型诺如病毒阳性，含有G I型诺如病毒。
[0015]所述的lOXThermopol反应缓冲液是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买至丨J，其含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L 硫酸铵(NH4) 2S04、20mmol/L 硫酸镁(MgSO4)和 1% 曲拉通 X-100(TtitonX-100)，余量为水。
[0016]本发明的第三个目的是提供一种G I型诺如病毒的检测试剂盒，包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成:
[0017]上游外引物F3:5’ -AGCATGGGACTCAACACA-3’ ；(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0018]下游外引物B3:5’ -ATGGGAATCCAGATGGCA-3’ ；(如 SEQ ID N0.2 所示)
[0019]上游内引物FIP:5 ’ -CAATTCTGGTGAGGCCGTAAG-TAGACAAATTATGACAGAATCCTTC-3 ’ ；(如 SEQ ID N0.3 所示)
[0020]下游内引物BIP:5’ -CGAGGTTGTGGCCCAAGATT-CCTCTTTGACCCTGATGAC-3，。(如 SEQID N0.4 所示)
[0021]本发明建立了 G I型诺如病毒的LAMP检测方法，本检测方法针对G I型诺如病毒的RNA多聚酶基因，设计和筛选了一套特异性引物(4条引物)，包括两个特异性内引物和两个特异性外引物。本发明采用LAMP技术，特异性强，且比RT-PCR检测方法有更高的灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的水浴箱即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，可用于G I型诺如病毒的检测，特别适合于基层现场应用。
[0022]环介导等温扩增(Loop-mediatedIsothermal Amplif ication, LAMP)技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是对靶基因的6个部位设计4种引物，利用链置换反应在恒温下使靶基因高效扩增。由于其反应是多种引物共同启动，使得反应结果比PCR更特异，另外，由于实行的等温扩增，反应在恒温水浴箱内便可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适用于现场快速检测。
[0023]本发明解决了现有技术中检测G I型诺如病毒的方法所需周期长、灵敏度较低、成本高等缺陷，可广泛应用于医院、食品行业、出入境检验检疫及质量监督等部门及领域。
【具体实施方式】:
[0024]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0025]实施例1:检测腹泻样本中G I型诺如病毒
[0026]本实施例收集了 2份医院收集的临床腹泻样本，分别按照以下方法进行检测。
[0027]( I)样本处理
[0028]取医院收集的临床腹泻样本，用pH7.4的PBS稀释成10%的悬液，4°C、1000Og离心取上清，用于提取病毒RNA。
[0029](2)病毒RNA提取
[0030](a)取200 μ L步骤(1)的上清，加800 μ L Trizol试剂，用移液器反复混匀几次后静置5min ；
[0031](b)加入200yL氯仿，用力振摇15S，再静置2~3min ;
[0032](c) 4°C, 12000g,离心 15min,弃去上层液体；
[0033](d)加入500 μ L异丙醇，充分混匀，室温放置IOmin ；
[0034](e) 4°C, 12000g,离心 IOmin,再次弃去上清；
[0035]Cf)加入75 %的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；
[0036](g) 4°C, 7500g,离心 5min,小心弃去乙醇；
[0037](h)充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于适量的无RNA酶的水中，由此得到RNA样品。
[0038](3)病毒RNA反转录
[0039]取2yL RNA 样品，IyL dNTP,0.5μ L RNasin, I μ L MLV，各 I μ L 的随机引物，
2.5 μ LlO X RT buffer, 1.5 μ LMgCl2,加入RNase free水至终体积为25 μ L，反转录反应条件为:42°C，30min，然后 95°C，2min，由此得到 cDNA。
[0040](4)环介导等温扩增[0041]环介导等温扩增体系为体系总体积25 μ L，包括2.5 μ LlOXThermopol反应缓冲液、0.4μ L10mmol/L dNTPs.0.5 μ LlO μ mol/L 上游外引物 F3、0.5 μ LlO μ mol/L 下游外引物 B3、I μ L40 μ mol/L 上游内引物 FIP、I μ L40 μ mol/L 下游内引物 BIP,0.6 μ LIOOmmoI/LMgS04、12.5 μ L2mol/L 甜菜喊、4 μ L 灭菌双蒸水 ddH20,1 μ L Bst DNA 聚合酶(8U/μ L)和I μ L步骤(3)的cDNA，反应条件为在温度为63°C孵育60min。
[0042]检测引物组为:
[0043]上游外引物F3:5’ -AGCATGGGACTCAACACA-3’ ；
[0044]下游外引物B3:5 ’ -ATGGGAATCCAGATGGCA-3，；
[0045]上游内引物FIP: 5 ’ -CAATTCTGGTGAGGCCGTAAG-TAGACAAATTATGACAGAATCCTTC-3 ’ ；
[0046]下游内引物BIP:5’ -CGAGGTTGTGGCCCAAGATT-CCTCTTTGACCCTGATGAC-3，。
[0047](5)扩增产物的显色检测
[0048]在上述反应管中加入I μ L10%SYBR Green I显色剂，室温放置lOmin，用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有G I型诺如病毒；如果颜色为黄色，说明待检样品不含有G I型诺如病毒。
[0049]其结果为:阴性对照(模板为水)黄色，不含有G I型诺如病毒，2号样品为本实施例的临床腹泻样本，其颜色都为黄色，不含有G I型诺如病毒，3号样品是本实施例的另外一份临床腹泻样本，其颜色都为绿色，含有G I型诺如病毒。这与通过常规RT-PCR检测方法检测得到的结果相同。
[0050]实施例2:人工污染纯净水中诺如病毒的检测
[0051](I)模拟水样制备
[0052]取100 μ L腹泻样本稀释液添加到1000mL灭菌的纯净水中，混合均匀，即得到人工
污染水样。
[0053](2)病毒浓缩富集
[0054]往人工污染水样中添加2mL CaCl2溶液(lmol/L),再加入2mL Na2HPO4 (lmol/L),充分搅拌均匀，负压过滤，过普通混合纤维素滤膜(孔径0.45 μ m,直径47mm)，取下滤膜，用4mL0.3mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液洗溶3min,最后用4mL超滤管在7500 X g下离心IOmin,再用无菌蒸馏水定容至100 μ L，即得浓缩10000倍的病毒浓缩液。
[0055](3) RNA 提取
[0056](a)将上述浓缩所得的IOOyL步骤(1)的病毒浓缩液，加800 μ L Trizol试剂，用移液器反复混匀几次后静置5min ；
[0057](b)加入200 μ L氯仿，用力振摇15S，再静置2~3min ;
[0058](c) 4°C, 12000g,离心 15min,弃去上层液体；
[0059](d)加入500 μ L异丙醇,充分混匀，室温放置IOmin ；
[0060](e) 4°C, 12000g,离心 IOmin,再次弃去上清；
[0061](f)加入75 %的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；
[0062](g) 4°C, 7500g,离心 5min,小心弃去乙醇；
[0063](h)充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于适量的无RNA酶的水中，由此得到RNA样品。
[0064](3)病毒RNA反转录
[0065]取2yL RNA 样品，IyL dNTP,0.5μ L RNasin, I μ L MLV，各 I μ L 的随机引物，2.5 μ LlO X RT buffer, 1.5 μ LMgCl2,加入RNase free水至终体积为25 μ L，反转录反应条件为:42°C，30min，然后 95°C，2min，由此得到 cDNA。
[0066] (4)环介导等温扩增
[0067]环介导等温扩增体系为体系总体积25 μ L，包括2.5 μ LlOXThermopol反应缓冲液、0.4μ L10mmol/L dNTPs.0.5 μ LlO μ mol/L 上游外引物 F3、0.5 μ LlO μ mol/L 下游外引物 B3、I μ L40 μ mol/L 上游内引物 FIP、I μ L40 μ mol/L 下游内引物 BIP,0.6 μ LIOOmmoI/LMgS04、12.5 μ L2mol/L 甜菜喊、4 μ L 灭菌双蒸水 ddH20,1 μ L Bst DNA 聚合酶(8U/μ L)和I μ L步骤(3)的cDNA，反应条件为在温度为63°C孵育60min。
[0068]检测引物组为:
[0069]上游外引物F3:5’ -AGCATGGGACTCAACACA-3’ ；
[0070]下游外引物B3:5 ’ -ATGGGAATCCAGATGGCA-3，；
[0071 ]上游内引物 FIP: 5 ’ -CAATTCTGGTGAGGCCGTAAG-TAGACAAATTATGACAGAATCCTTC-3 ’ ；
[0072]下游内引物BIP:5’ -CGAGGTTGTGGCCCAAGATT-CCTCTTTGACCCTGATGAC-3，。
[0073](5)扩增产物的显色检测
[0074]在上述反应管中加入I μ L10%SYBR Green I显色剂，室温放置lOmin，用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有G I型诺如病毒；如果颜色为黄色，说明待检样品不含有G I型诺如病毒。
[0075]其结果为:1号为阴性对照(未接种诺如病毒的纯净水样)黄色，不含有G I型诺如病毒，2号为阳性对照(经确定的阳性诺如病毒腹泻样本)，其颜色都为绿色，含有G I型诺如病毒，3-5号样品是本实施例的人工污染水样(腹湾样本中确认含有诺如病毒腹)经病毒浓缩富集后的病毒浓缩液，其颜色均显示为绿色，表明含有G I型诺如病毒。
[0076]实施例3:特异性试验
[0077]将I个已知G I型诺如病毒阴性(轮状病毒)和3个已知G I型诺如病毒阳性的样品，按照实施例1的RT-LAMP法检测，结果表明，已知阴性的样品，在RT-LAMP检测结果中仍然呈现阴性，已知阳性的样品，在RT-LAMP检测结果中仍然呈现阳性，表明LAMP检测结果和PCR检测结果相吻合，验证了本发明所建立方法和试剂盒的特异性。
[0078]实施例4:灵敏度试验
[0079]将G I型诺如病毒RNA梯度稀释，按照实施例1中步骤(3)- (5)的方法进行反转录、环介导等温扩增和扩增产物的显色检测，验证本发明的灵敏度，检测结果为:阴性对照(模板为水)为黄色，不含有G I型诺如病毒,而100pg,50pg,25pg,5pg, Ipg模板量的G I诺如病毒RNA样品其颜色都为绿色,都为阳性,确定其检测灵敏度为lpg。
【权利要求】
1.一种应用环介导等温扩增检测G I型诺如病毒的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成: 上游外引物 F3:5’ -AGCATGGGACTCAACACA-3’ ； 下游外引物 B3:5’ -ATGGGAATCCAGATGGCA-3’ ； 上游内引物 FIP:5’ -CAATTCTGGTGAGGCCGTAAG-TAGACAAATTATGACAGAATCCTTC-3’ ； 下游内引物 BIP:5’ -CGAGGTTGTGGCCCAAGATT-CCTCTTTGACCCTGATGAC-3’。
2.一种非疾病的诊断和治疗目的的G I型诺如病毒的检测方法，其特征在于，对样品进行病毒RNA提取，再反转录成cDNA，然后通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对cDNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为医院的腹泻样品，水或食品。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对cDNA进行选择性扩增具体为:环介导等温扩增体系为:体系总体积 20-100 μ L，包括 IOXThermopol 反应缓冲液、lOmmol/LdNTPs、10 μ mol/L 上游外引物F3、10 μ mol/L下游外引物Β3、40 μ mol/L上游内引物FIP,40 μ mol/L下游内引物BIPUOOmmol/L MgS04、2mol/L 甜菜碱、1-5 μ L8U/μ L Bst DNA 聚合酶和 1-5 μ L c DNA，加 灭菌双蒸水ddH20至反应总体积，反应条件为在温度为63°C孵育40-70min。
5.根据权利要求2、3或4所述的检测方法，其特征在于，所述的确认是否存在有扩增产物是在终止反应的反应管中加入I μ L10%SYBR Green I显色剂，IOmin后观察结果，如果颜色为黄色，则样品G I型诺如病毒阴性，无G I型诺如病毒，如果颜色为绿色，则样品G I型诺如病毒阳性，含有G I型诺如病毒。
6.一种G I型诺如病毒的检测试剂盒，包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成: 上游外引物 F3:5’ -AGCATGGGACTCAACACA-3’ ； 下游外引物 B3:5’ -ATGGGAATCCAGATGGCA-3’ ； 上游内引物 FIP:5’ -CAATTCTGGTGAGGCCGTAAG-TAGACAAATTATGACAGAATCCTTC-3’ ； 下游内引物 BIP:5’ -CGAGGTTGTGGCCCAAGATT-CCTCTTTGACCCTGATGAC-3’。
【文档编号】C12N15/11GK103642943SQ201310690315
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】寇晓霞, 吴清平, 薛亮, 张菊梅 申请人:广东省微生物研究所, 广东环凯微生物科技有限公司