本发明公开了一种玻璃酸酶的制备方法，属于玻璃酸酶制备技术领域。
背景技术：
玻璃酸酶又名透明质酸酶，是一种能够降低体内透明质酸的活性，从而提高组织中液体渗透能力的酶。玻璃酸酶主要存在于哺乳动物睾丸、蛇毒以及其他动物毒液中。玻璃酸酶根据其种类、分子量大小、最适pH值、降解底物的机理不同被分离。玻璃酸酶用于肿瘤治疗可以降低人膀胱癌的复发率；用于心肌梗塞治疗可使心肌透明质酸含量显著降低，增加血流量；另外用玻璃酸酶的酶液滴注眼前房可以降低白内障病人术后过高的眼内压。玻璃酸酶不但在医药领域有着广泛的应用，而且在保健品领域也有卓越的贡献，人为补充玻璃酸酶可消除皱纹或使局部器官增厚增高，使皮肤保持弹性，从而达到整容效果。
玻璃酸酶的稳定性较好，42℃加热60分钟活力不损失；100℃加热5分钟，活力可保留80%。受热失活后进行冷却可恢复部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍较稳定。在低浓度水溶液中较易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯胶或0.2%明胶保护。Fe2+、Cu2+对酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等对酶活性没有明显影响。高浓度玻璃酸酶对酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化钠或硫酸鱼精蛋白所逆转。
目前传统的玻璃酸酶生产工艺，采用酸液提取和硫酸铵盐析的方法制得玻璃酸酶粗品，粗品再经过透析、除热原、冻干工序得到玻璃酸酶精品；该生产工艺普遍采用的提取剂为乙酸或乙酸与盐酸的混合液，这类提取剂不利于保护酶的活力，且使得玻璃酸酶提取率较低。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题：针对目前传统方法在制备玻璃酸酶的过程中，往往采用酸液提取和硫酸铵盐析的方法，且加入的提取剂不利于保护酶的活力，使得玻璃霉菌提取率较低的现状，提供了一种将注入碳酸氢钠的猪睾丸蒸煮后绞碎成糜浆，随后利用萝卜发酵酸液浸泡猪睾丸糜浆，使其自然长除霉菌，之后收集长出的霉菌，并用乙醇进行提取，最后将提取物进行冷冻干燥，从而得到玻璃酸酶的制备方法。该方法操作简便，原料易得，在制备的过程中避免过多的酸液提取剂，使得制得的玻璃酸酶活力高、纯度高且提取率达到88％以上，在医药和保健品领域具有良好的应用前景。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
（1）选取3～5个猪睾丸，放入清水中，反复搓洗，去除表层残留污物后，剥去内外皮层及副睾丸，待处理结束，用注射器抽取质量浓度为60％的碳酸氢钠溶液，缓慢注入处理后的猪睾丸中，其中每个猪睾丸中注射量为7～9mL，待注射结束，将注射后的猪睾丸放置在蒸炉中，在85～95℃下蒸煮35～45min，随后将煮后的猪睾丸取出放于菠萝筛中，自然冷却至室温后，倒入绞碎机中，绞成糜浆；
（2）称取500～600g无霉斑、无病虫害、无腐烂的白萝卜，用清水洗净外皮残留污泥后，用刀将其均匀切成条状，放入转速为250r/min的离心机中进行甩干操作，直至萝卜表面无自然滴水，随后将甩干后的萝卜条放于发酵罐中，并向其中加入质量浓度为37％氯化钠溶液，直至完全浸没萝卜条为止，之后在80～90℃下密封发酵8～12天，待发酵结束，提升发酵温度为85～95℃，再次密封发酵5～7天，得发酵混合物，随后将得到的发酵混合物放入高速离心机中，在1200～1300r/min的转速下离心处理20～25min，去渣留液，得发酵液；
（3）将上述得到的发酵液放入容器中，并向其中加入上述步骤（1）制得的猪睾丸糜浆，充分混合均匀，用纱布遮盖，在温度为25～32℃，空气相对湿度为65～68％下自行发霉，当混合物变质产生霉菌时，选取浓度为1.5mol/L的亚硫酸钠溶液，调节pH值为5.7～6.3，每隔一天对霉菌进行1～3次淋洗，直至混合物表层长出一层3～5cm的青褐色菌丝；
（4）用质量浓度为75％乙醇溶液冲洗上述长出的青褐色菌丝2～4次，收集冲洗后的混合液，得到菌丝悬浮液，置于微波提取装置中，在温度30～40℃，功率为50～60W下进行微波提取45～55min，随后将混合物放入离心机中，在1000～1200r/min的转速下离心处理10～15min，取下层沉淀，得菌丝提取物；
（5）将上述得到的菌丝提取物放入真空冻干机中，抽真空至15～18kPa，同时启动制冷，在1～2h内将真空冷冻干燥机温度降至-10～-8℃，保持时间35～45min，随后在3～5h内将菌丝提取物升温至0～3℃，使得菌丝提取物干燥，即可得到一种玻璃酸酶。
本发明的原理：本发明利用将萝卜切条，加入氯化钠溶液进行发酵处理，得萝卜酸液作为提取剂，代替传统乙酸或乙酸与盐酸的混合液，并且在洗净的猪睾丸中注入碳酸氢钠溶液，使得酸碱中和，保护了酶的活力，另外将直接从猪睾丸中提取转变为从霉菌中提取，更加提高了玻璃酸酶的提取率，使得纯度也得到了提高。
本发明制得的玻璃酸酶颜色为淡黄色；易溶于水，不易溶于丙酮和乙醇；酪氨酸含量为0.03～0.08mg；酸度为6.2；玻璃酸酶效价≥1600单位。
本发明的应用方法是：将本发明制得的玻璃酸酶放入制囊机中，制成玻璃酸酶胶囊，其中每个胶囊中含有1～2g玻璃酸酶，食用时，配以250～300mL温开水送服，每天三餐后食用，每次食用1～3粒，长期食用，可以降低肿瘤治疗者膀胱癌的复发率，在医药和保健品领域具有良好的应用前景。
本发明的有益效果是：
（1）本发明操作简便，在制备的过程中避免过多的酸液提取剂，使得玻璃酸酶的活力得到了保护；
（2）本发明在制备的过程中无需特殊设备，生产时间短，且对于环境无任何危害，最终使得制得的玻璃酸酶性能稳定、纯度和提取效率均得到了显著提高。
具体实施方式
首先选取3～5个猪睾丸，放入清水中，反复搓洗，去除表层残留污物后，剥去内外皮层及副睾丸，待处理结束，用注射器抽取质量浓度为60％碳酸氢钠溶液，缓慢注入处理后的猪睾丸中，其中每个猪睾丸中注射量为7～9mL，待注射结束，将注射后的猪睾丸放置在蒸炉中，在85～95℃下蒸煮35～45min，随后将煮后的猪睾丸取出放于菠萝筛中，自然冷却至室温后，倒入绞碎机中，绞成糜浆；然后称取500～600g无霉斑、无病虫害、无腐烂的白萝卜，用清水洗净外皮残留污泥后，用刀将其均匀切成条状，放入转速为250r/min的离心机中进行甩干操作，直至萝卜表面无自然滴水，随后将甩干后的萝卜条放于发酵罐中，并向其中加入质量浓度为37％氯化钠溶液，直至完全浸没萝卜条为止，之后在80～90℃下密封发酵8～12天，待发酵结束，提升发酵温度为85～95℃，再次密封发酵5～7天，得发酵混合物，随后将得到的发酵混合物放入高速离心机中，在1200～1300r/min的转速下离心处理20～25min，去渣留液，得发酵液；接下来将上述得到的发酵液放入容器中，并向其中加入上述制得的猪睾丸糜浆，充分混合均匀，用纱布遮盖，在温度为25～32℃，空气相对湿度为65～68％下自行发霉，当混合物变质产生霉菌时，选取浓度为1.5mol/L的亚硫酸钠溶液，调节pH值为5.7～6.3，每隔一天对霉菌进行1～3次淋洗，直至混合物表层长出一层3～5cm的青褐色菌丝；之后用质量浓度为75％乙醇溶液冲洗上述长出的青褐色菌丝2～4次，收集冲洗后的混合液，得到菌丝悬浮液，置于微波提取装置中，在温度30～40℃，功率为50～60W下进行微波提取45～55min，随后将混合物放入离心机中，在1000～1200r/min的转速下离心处理10～15min，取下层沉淀，得菌丝提取物；最后将上述得到的菌丝提取物放入真空冻干机中，抽真空至15～18kPa，同时启动制冷，在1～2h内将真空冷冻干燥机温度降至-10～-8℃，保持时间35～45min，随后在3～5h内将菌丝提取物升温至0～3℃，使得菌丝提取物干燥，即可得到一种玻璃酸酶。
实例1
首先选取3个猪睾丸，放入清水中，反复搓洗，去除表层残留污物后，剥去内外皮层及副睾丸，待处理结束，用注射器抽取质量浓度为60％碳酸氢钠溶液，缓慢注入处理后的猪睾丸中，其中每个猪睾丸中注射量为7mL，待注射结束，将注射后的猪睾丸放置在蒸炉中，在85℃下蒸煮35min，随后将煮后的猪睾丸取出放于菠萝筛中，自然冷却至室温后，倒入绞碎机中，绞成糜浆；然后称取500g无霉斑、无病虫害、无腐烂的白萝卜，用清水洗净外皮残留污泥后，用刀将其均匀切成条状，放入转速为250r/min的离心机中进行甩干操作，直至萝卜表面无自然滴水，随后将甩干后的萝卜条放于发酵罐中，并向其中加入质量浓度为37％氯化钠溶液，直至完全浸没萝卜条为止，之后在80℃下密封发酵8天，待发酵结束，提升发酵温度为85℃，再次密封发酵5天，得发酵混合物，随后将得到的发酵混合物放入高速离心机中，在1200r/min的转速下离心处理20min，去渣留液，得发酵液；接下来将上述得到的发酵液放入容器中，并向其中加入上述制得的猪睾丸糜浆，充分混合均匀，用纱布遮盖，在温度为25℃，空气相对湿度为65％下自行发霉，当混合物变质产生霉菌时，选取浓度为1.5mol/L的亚硫酸钠溶液，调节pH值为5.7，每隔一天对霉菌进行1次淋洗，直至混合物表层长出一层3cm的青褐色菌丝；之后用质量浓度为75％乙醇溶液冲洗上述长出的青褐色菌丝2次，收集冲洗后的混合液，得到菌丝悬浮液，置于微波提取装置中，在温度30℃，功率为50W下进行微波提取45min，随后将混合物放入离心机中，在1000r/min的转速下离心处理10min，取下层沉淀，得菌丝提取物；最后将上述得到的菌丝提取物放入真空冻干机中，抽真空至15kPa，同时启动制冷，在1h内将真空冷冻干燥机温度降至-10℃，保持时间35min，随后在3h内将菌丝提取物升温至0℃，使得菌丝提取物干燥，即可得到一种玻璃酸酶。
本实例操作简单易行，使用时，将本发明制得的玻璃酸酶放入制囊机中，制成玻璃酸酶胶囊，其中每个胶囊中含有1g玻璃酸酶，食用时，配以250mL温开水送服，每天三餐后食用，每次食用1粒，长期食用，可以降低肿瘤治疗者膀胱癌的复发率，在医药和保健品领域具有良好的应用前景。
实例2
首先选取4个猪睾丸，放入清水中，反复搓洗，去除表层残留污物后，剥去内外皮层及副睾丸，待处理结束，用注射器抽取质量浓度为60％碳酸氢钠溶液，缓慢注入处理后的猪睾丸中，其中每个猪睾丸中注射量为8mL，待注射结束，将注射后的猪睾丸放置在蒸炉中，在90℃下蒸煮40min，随后将煮后的猪睾丸取出放于菠萝筛中，自然冷却至室温后，倒入绞碎机中，绞成糜浆；然后称取550g无霉斑、无病虫害、无腐烂的白萝卜，用清水洗净外皮残留污泥后，用刀将其均匀切成条状，放入转速为250r/min的离心机中进行甩干操作，直至萝卜表面无自然滴水，随后将甩干后的萝卜条放于发酵罐中，并向其中加入质量浓度为37％氯化钠溶液，直至完全浸没萝卜条为止，之后在85℃下密封发酵10天，待发酵结束，提升发酵温度为90℃，再次密封发酵6天，得发酵混合物，随后将得到的发酵混合物放入高速离心机中，在1250r/min的转速下离心处理23min，去渣留液，得发酵液；接下来将上述得到的发酵液放入容器中，并向其中加入上述制得的猪睾丸糜浆，充分混合均匀，用纱布遮盖，在温度为30℃，空气相对湿度为67％下自行发霉，当混合物变质产生霉菌时，选取浓度为1.5mol/L的亚硫酸钠溶液，调节pH值为6.1，每隔一天对霉菌进行2次淋洗，直至混合物表层长出一层4cm的青褐色菌丝；之后用质量浓度为75％乙醇溶液冲洗上述长出的青褐色菌丝3次，收集冲洗后的混合液，得到菌丝悬浮液，置于微波提取装置中，在温度35℃，功率为55W下进行微波提取50min，随后将混合物放入离心机中，在1100r/min的转速下离心处理13min，取下层沉淀，得菌丝提取物；最后将上述得到的菌丝提取物放入真空冻干机中，抽真空至17kPa，同时启动制冷，在1.5h内将真空冷冻干燥机温度降至-9℃，保持时间40min，随后在4h内将菌丝提取物升温至2℃，使得菌丝提取物干燥，即可得到一种玻璃酸酶。
本实例操作简单易行，使用时，将本发明制得的玻璃酸酶放入制囊机中，制成玻璃酸酶胶囊，其中每个胶囊中含有1.5g玻璃酸酶，食用时，配以280mL温开水送服，每天三餐后食用，每次食用2粒，长期食用，可以降低肿瘤治疗者膀胱癌的复发率，在医药和保健品领域具有良好的应用前景。
实例3
首先选取5个猪睾丸，放入清水中，反复搓洗，去除表层残留污物后，剥去内外皮层及副睾丸，待处理结束，用注射器抽取质量浓度为60％碳酸氢钠溶液，缓慢注入处理后的猪睾丸中，其中每个猪睾丸中注射量为9mL，待注射结束，将注射后的猪睾丸放置在蒸炉中，在95℃下蒸煮45min，随后将煮后的猪睾丸取出放于菠萝筛中，自然冷却至室温后，倒入绞碎机中，绞成糜浆；然后称取600g无霉斑、无病虫害、无腐烂的白萝卜，用清水洗净外皮残留污泥后，用刀将其均匀切成条状，放入转速为250r/min的离心机中进行甩干操作，直至萝卜表面无自然滴水，随后将甩干后的萝卜条放于发酵罐中，并向其中加入质量浓度为37％氯化钠溶液，直至完全浸没萝卜条为止，之后在90℃下密封发酵12天，待发酵结束，提升发酵温度为95℃，再次密封发酵7天，得发酵混合物，随后将得到的发酵混合物放入高速离心机中，在1300r/min的转速下离心处理25min，去渣留液，得发酵液；接下来将上述得到的发酵液放入容器中，并向其中加入上述制得的猪睾丸糜浆，充分混合均匀，用纱布遮盖，在温度为32℃，空气相对湿度为68％下自行发霉，当混合物变质产生霉菌时，选取浓度为1.5mol/L的亚硫酸钠溶液，调节pH值为6.3，每隔一天对霉菌进行3次淋洗，直至混合物表层长出一层5cm的青褐色菌丝；之后用质量浓度为75％乙醇溶液冲洗上述长出的青褐色菌丝4次，收集冲洗后的混合液，得到菌丝悬浮液，置于微波提取装置中，在温度40℃，功率为60W下进行微波提取55min，随后将混合物放入离心机中，在1200r/min的转速下离心处理15min，取下层沉淀，得菌丝提取物；最后将上述得到的菌丝提取物放入真空冻干机中，抽真空至18kPa，同时启动制冷，在2h内将真空冷冻干燥机温度降至-8℃，保持时间45min，随后在5h内将菌丝提取物升温至3℃，使得菌丝提取物干燥，即可得到一种玻璃酸酶。
本实例操作简单易行，使用时，将本发明制得的玻璃酸酶放入制囊机中，制成玻璃酸酶胶囊，其中每个胶囊中含有2g玻璃酸酶，食用时，配以300mL温开水送服，每天三餐后食用，每次食用3粒，长期食用，可以降低肿瘤治疗者膀胱癌的复发率，在医药和保健品领域具有良好的应用前景。