用于甘薯亲子鉴定的引物体系及其筛选方法与试剂盒与流程

本发明涉及用于甘薯亲子鉴定的引物体系及其筛选方法与试剂盒,属于植物物种鉴定技术领域。

背景技术：

1949年以来，我国甘薯科技事业获得飞速发展，但在甘薯育种中，由于长期对产量和抗性等少数性状的人工选择以及仅用少数亲本进行品种选育，造成育种背景单一、遗传基础日益狭窄、遗传多样性下降。因此有必要对甘薯的种质资源进行遗传多样性的研究，以充分挖掘有价值的材料，为甘薯遗传育种服务。

亲子鉴定(Parentageidentification)是指应用医学、遗传学和生物学等理论、技术来检测分析父母与子女之间的遗传关联,判断他们是否存在亲生关系。在法医学上有广泛的应用。DNA分子标记技术,可直接揭示DNA分子水平上的差异,无器官、组织及发育阶段的特异性,是一种实验室区别和鉴定品种的有效方法。SSR即简单序列重复，也叫微卫星序列重复，是一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。与其他分子标记方法相比，SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)技术重复性好，易于操作，结果可靠。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种应用SSR技术的用于甘薯亲子鉴定的引物体系的筛选方法。

实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

用于甘薯亲子鉴定的引物体系的筛选方法，包括以下步骤：

1)分子标记设计：根据SSR位点两端的保守区域设计SSR分子标记引物，引物设计原则：Tm值为50-60℃；扩增产物大小100-400bp；引物长度18-24bp，扩增率大于80％；

2)DNA提取：采集供试材料的幼嫩叶片，提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，稀释，保存备用；

3)PCR扩增：以步骤2)得到的基因组DNA为模板，使用步骤1)得到的引物进行PCR扩增；

4)电泳分离：扩增产物用凝胶电泳检测，用AgNO₃溶液染色5min，漂洗，显影，选择多态性高、重复稳定性和遗传稳定性好、扩增条带清晰的引物对，得到引物体系。

作为优选，步骤3)中，PCR扩增体系为10μL，包括如下组分：0.15μL TaqDNA聚合酶、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、0.8μL dNTPs、1.0μL基因组DNA、1.0μL 10×PCR Buffer、补足至10μL的ddH₂O。

作为优选，步骤3)中，TaqDNA聚合酶的浓度为2.5U/μL、上游引物的浓度为20pmol/μL、下游引物的浓度为20pmol/μL、dNTPs的浓度为2.5mmol/L、基因组DNA的浓度为20ng/μL。

作为优选，步骤3)中，PCR扩增反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃-60℃退火温度30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃下延伸7min，4℃保存。

作为优选，步骤4)后还包括步骤5)检测遗传稳定性：检测步骤4)获得的引物对在亲代与子代间是否符合孟德尔遗传规律。

作为优选，步骤4)中，使用由3w.t.％NaOH和0.4w.t.％甲醛组成显影液显影。

本发明的另一目的在于提供上述方法获得的引物体系。

作为优选，所述引物体系包括以下引物对：

GDAAS0338上游引物如SEQ ID No.1所示；GDAAS0338下游引物如SEQ ID No.2所示；

GDAAS0354上游引物如SEQ ID No.3所示；GDAAS0354下游引物如SEQ ID No.4所示；

GDAAS0360上游引物如SEQ ID No.5所示；GDAAS0360下游引物如SEQ ID No.6所示；

GDAAS0782上游引物如SEQ ID No.7所示；GDAAS0782下游引物如SEQ ID No.8所示；

GDAAS0819上游引物如SEQ ID No.9所示；GDAAS0819下游引物如SEQ ID No.10所示；

GDAAS0843上游引物如SEQ ID No.11所示；GDAAS0843下游引物如SEQ ID No.12所示；

GDAAS0848上游引物如SEQ ID No.13所示；GDAAS0848下游引物如SEQ ID No.14所示；

GDAAS0858上游引物如SEQ ID No.15所示；GDAAS0858下游引物如SEQ ID No.16所示；

GDAAS0871上游引物如SEQ ID No.17所示；GDAAS0871下游引物如SEQ ID No.18所示；

GDAAS0911上游引物如SEQ ID No.19所示；GDAAS0911下游引物如SEQ ID No.20所示；

GDAAS0914上游引物如SEQ ID No.21所示；GDAAS0914下游引物如SEQ ID No.22所示；

GDAAS0922上游引物如SEQ ID No.23所示；GDAAS0922下游引物如SEQ ID No.24所示；

GDAAS0926上游引物如SEQ ID No.25所示；GDAAS0926下游引物如SEQ ID No.26所示；

GDAAS0940上游引物如SEQ ID No.27所示；GDAAS0940下游引物如SEQ ID No.28所示。

本发明的目的之三在于提供用于甘薯亲子鉴定的试剂盒，包括上述的引物体系。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明利用甘薯微卫星分子标记的多态性引物进行甘薯的亲子关系鉴定，所筛选出来的引物体系位点具有共显性、多态性高、重复性好、条带清晰、且遗传稳定性高等特点，能够准确客观的鉴定出甘薯的亲子关系，在甘薯亲缘关系的审定和辨别、亲缘关系的保护、产权纠纷等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为GDAAS0338的亲子鉴定扩增图谱；

图2为GDAAS0354的亲子鉴定扩增图谱；

图3为GDAAS0360的亲子鉴定扩增图谱；

图4为GDAAS0782的亲子鉴定扩增图谱；

图5为GDAAS0819的亲子鉴定扩增图谱；

图6为GDAAS0843的亲子鉴定扩增图谱；

图7为GDAAS0848的亲子鉴定扩增图谱；

图8为GDAAS0858的亲子鉴定扩增图谱；

图9为GDAAS0871的亲子鉴定扩增图谱；

图10为GDAAS0911的亲子鉴定扩增图谱；

图11为GDAAS0914的亲子鉴定扩增图谱；

图12为GDAAS0922的亲子鉴定扩增图谱；

图13为GDAAS0926的亲子鉴定扩增图谱；

图14为GDAAS0940的亲子鉴定扩增图谱。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

本发明通过以下步骤筛选用于甘薯亲子鉴定的引物体系：

1)分子标记设计：根据SSR位点两端的保守区域设计SSR分子标记引物，引物设计原则：Tm值为50-60℃；扩增产物大小100-400bp；引物长度18-24bp，扩增率大于80％；

2)DNA提取：采集供试材料的幼嫩叶片，提取基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，稀释，保存备用；

3)PCR扩增：以步骤2)得到的基因组DNA为模板，使用步骤1)得到的引物进行PCR扩增；

4)电泳分离：扩增产物用凝胶电泳检测，用AgNO₃溶液染色5min，双蒸水漂洗2次，显影，选择多态性高、重复稳定性好、扩增条带清晰的引物对，得到引物体系。

实施例1：

1)分子标记设计：根据SSR位点两端的保守区域采用Primer Premier软件设计SSR分子标记引物，引物设计原则：Tm值为50-60℃；扩增产物大小100-400bp；引物长度18-24bp，扩增率大于80％；

2)DNA提取：采集供试材料的幼嫩叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，超微量分光光度计精确测定DNA样品浓度，稀释至100ng/μL，-20℃保存备用；

3)PCR扩增：以步骤2)得到的基因组DNA为模板，使用步骤1)得到的引物进行PCR扩增；PCR扩增体系10μL，如下：0.15μL(2.5U/μL)TaqDNA聚合酶、上游引物0.3μL(20pmol/μL)、下游引物0.3μL(20pmol/μL)、0.8μL dNTPs(2.5mmol/L)、1.0μL基因组DNA(20ng/μL)、1.0μL 10×PCR Buffer、补足至10μL的ddH₂O。

PCR扩增反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃-60℃退火温度30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃下延伸7min，4℃保存；

4)电泳分离：扩增产物用6.0％聚丙烯凝胶电泳检测，用0.12w.t.％AgNO₃溶液染色5min，双蒸水漂洗2次，用3w.t.％NaOH和0.4w.t.％甲醛组成的显影液显影，选择多态性高、重复稳定性好、扩增条带清晰的引物对，即得到引物体系。

本实施例中，采用的供试材料如下所示：

表1 供试的41份甘薯种质资源

采用本实施例共筛选出22对候选引物，其信息如下表所示：

表2 22对候选引物信息

实施例2：

采用普宁菜种(P1)和台农27(P2)及其238(编号1-238)个F1子代群体检测实施例1中筛选出的22个候选引物的遗传稳定性，即分子标记在亲代与子代间是否符合孟德尔遗传规律。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物。

在22对候选引物中，有4对引物在亲子间出现了矛盾等位基因位点，其余18对引物则完全符合孟德尔遗传规律，其中又有4对引物因在子代群体中扩增条带不清晰，在亲代及子代的遗传分析中容易出现错误的判读，也不是理想的亲子鉴定引物。所以最后筛选了14对引物，作为用于甘薯亲子鉴定的引物体系。这14对引物名称如下所示：GDAAS0338、GDAAS0354、GDAAS0360、GDAAS0782、GDAAS0819、GDAAS0843、GDAAS0848、GDAAS0858、GDAAS0871、GDAAS0911、GDAAS0914、GDAAS0922、GDAAS0926、GDAAS0940。

实施例3:

本单位承担着国家甘薯产业技术体系南方区育种岗位工作，保有100多份常用杂交亲本，以105份常用杂交亲本的指纹数据为主，结合实施例1中的41份资源和实施例2中的240个全同胞群体亲子材料，统计14个亲子鉴定基因座的个体识别率DP、累计个体识别率CDP、三联体非父排除率PE(已知一个亲本，求得另一个亲本)和三联体累计非父排除率CPE。DP、CDP、PE和CPE的计算参照公式如下：

个体识别率

$DP=1-\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{P}_i^2;$

累计个体识别率

$CDP=1-\underset{k=1}{\overset{n}{\mathrm{\Π}}}(1-{\mathrm{DP}}_k);$

非父排除率

$PE=1-2\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{P}_i^2+\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{P}_i^3+2\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{P}_i^4-3\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{P}_i^5-2{\left(\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{P}_i^2\right)}^2+3\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{P}_i^2\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{P}_i^3;$

累计非父排除率

$CPE=1-\underset{k=1}{\overset{n}{\mathrm{\Π}}}(1-{\mathrm{PE}}_k);$

表3 引物对的识别、排除性能参数

初步结果显示，10个位点时累计个体识别率即达到了1.000000，累计非父排除率达到了0.999986；13个位点时累计非父排除率达到了1.000000。

实施例4

本发明采集了一个已经父本和母本的组合，同时选择和待测子代非亲生关系的7个假设候选父本进行模拟三联体亲子鉴定。在本次模拟三联体亲子鉴定中，根据母亲与子代的基因型，确定子代基因中来自亲生母亲的等位基因位点，继而判定必须来自亲生父亲的等位基因位点。例如，子代基因型为11001，母本基因型为01010，那么子代中的第一和第五个等位位点必须来自父亲，待测定父亲中如果没有其中的任何一条或两条带，都可被排除掉。模拟亲子鉴定结果如下表所示，引物体系中14对引物的亲子鉴定扩增图谱如图1-14所示。

表4 亲子鉴定结果

注：加粗数字为亲生父亲必须提供给待测子代的等位基因位点，根据候选父亲是否具有此位点判断其是真父还是假父，即加粗数字出现0的候选父亲为假父，加粗数字全部为1的为真父。

初步结果显示，亲生父亲具备了全部的生父必须提供的基因位点，而其他7个假设候选父亲则在1-5个基因座上存在无法满足生父必须提供的等位基因位点。以上分析结果证实本发明获得的14对甘薯微卫星分子标记用于甘薯亲子鉴定是可行的。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。