用于甘薯亲子鉴定的引物体系及其筛选方法与试剂盒与流程

文档序号:12346608阅读:来源:国知局

技术特征:

1.用于甘薯亲子鉴定的引物体系的筛选方法,包括以下步骤:

1)分子标记设计:根据SSR位点两端的保守区域设计SSR分子标记引物,引物设计原则:Tm值为50-60℃;扩增产物大小100-400bp;引物长度18-24bp,扩增率大于80%;

2)DNA提取:采集供试材料的幼嫩叶片,提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度,稀释,保存备用;

3)PCR扩增:以步骤2)得到的基因组DNA为模板,使用步骤1)得到的引物进行PCR扩增;

4)电泳分离:扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,用AgNO3溶液染色,漂洗,显影,选择多态性高、重复稳定性和遗传稳定性好、扩增条带清晰的引物对,即得到引物体系。

2.如权利要求1所述的筛选方法,其特征在于,步骤3)中,PCR扩增体系为10μL,包括如下组分:0.15μL TaqDNA聚合酶、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、0.8μL dNTPs、1.0μL基因组DNA、1.0μL10×PCR Buffer、补足至10μL的ddH2O。

3.如权利要求2所述的筛选方法,其特征在于,步骤3)中,TaqDNA聚合酶的浓度为2.5U/μL、上游引物的浓度为20pmol/μL、下游引物的浓度为20pmol/μL、dNTPs的浓度为2.5mmol/L、基因组DNA的浓度为20ng/μL。

4.如权利要求1所述的筛选方法,其特征在于,步骤3)中,PCR扩增反应程序如下:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃-60℃退火温度30s,72℃延伸40s,35个循环,72℃下延伸7min,4℃保存。

5.如权利要求1所述的筛选方法,其特征在于,步骤4)中,使用由3w.t.%NaOH和0.4w.t.%甲醛组成的显影液显影。

6.如权利要求1所述的筛选方法,其特征在于,步骤4)后还包括步骤5)检测遗传稳定性:检测步骤4)获得的引物对在亲代与子代间是否符合孟德尔遗传规律。

7.如权利要求1-6任一项获得的引物体系。

8.如权利要求5任一项所述的引物体系,其特征在于,包括以下引物对:

GDAAS0338上游引物如SEQ ID No.1所示;GDAAS0338下游引物如SEQ ID No.2所示;

GDAAS0354上游引物如SEQ ID No.3所示;GDAAS0354下游引物如SEQ ID No.4所示;

GDAAS0360上游引物如SEQ ID No.5所示;GDAAS0360下游引物如SEQ ID No.6所示;

GDAAS0782上游引物如SEQ ID No.7所示;GDAAS0782下游引物如SEQ ID No.8所示;

GDAAS0819上游引物如SEQ ID No.9所示;GDAAS0819下游引物如SEQ ID No.10所示;

GDAAS0843上游引物如SEQ ID No.11所示;GDAAS0843下游引物如SEQ ID No.12所示;

GDAAS0848上游引物如SEQ ID No.13所示;GDAAS0848下游引物如SEQ ID No.14所示;

GDAAS0858上游引物如SEQ ID No.15所示;GDAAS0858下游引物如SEQ ID No.16所示;

GDAAS0871上游引物如SEQ ID No.17所示;GDAAS0871下游引物如SEQ ID No.18所示;

GDAAS0911上游引物如SEQ ID No.19所示;GDAAS0911下游引物如SEQ ID No.20所示;

GDAAS0914上游引物如SEQ ID No.21所示;GDAAS0914下游引物如SEQ ID No.22所示;

GDAAS0922上游引物如SEQ ID No.23所示;GDAAS0922下游引物如SEQ ID No.24所示;

GDAAS0926上游引物如SEQ ID No.25所示;GDAAS0926下游引物如SEQ ID No.26所示;

GDAAS0940上游引物如SEQ ID No.27所示;GDAAS0940下游引物如SEQ ID No.28所示。

9.一种用于甘薯亲子鉴定的试剂盒,包括如权利要求7或8所述的引物体系。

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