一种用于鉴别刀鲚和短颌鲚的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种用于鉴别刀鲚和短颌鲚的分子标记及其应用。

背景技术：

刀鲚(Coilianasus)，俗名刀鱼，是长江下游人民所喜食的重要经济鱼类，其肉质肥美难以笔墨形容，为“长江三鲜”之一。刀鲚为洄游性鱼类，平时生活在海里，每年2～3月份由海入江，并溯江而上进行生殖洄游，主要分布于长江中下游的干流之中。短颌鲚(C.brachygnathus)是德国人Kreyenberg等(1908)依据采自洞庭湖的标本所确立的一个物种，其生长和繁殖均在长江中下游的江河湖泊内，属于淡水鱼类。短颌鲚与刀鲚亲缘关系很近，但是由于其不进行生殖洄游，品质与口感明显逊色于长江刀鲚，其经济价值与刀鲚相比差距很大。由于短颌鲚和刀鲚的外形较为接近，普通消费者难以区分，一些商家故意混淆，用短颌鲚冒充长江刀鲚进行出售，严重损害了消费者的利益。目前市场上对于长江刀鲚和短颌鲚的鉴别主要靠经验观察，一般通过观察其外部形态(体型、体色、鳍式、鳞式等)来确定待售个体是否为正宗的长江刀鲚。或者通过“品尝”(以鱼味鲜美度为标准)来判断是否为正宗的长江刀鲚，但是只有老渔民或经常吃鱼的人才能分辨真假。由于这些鉴别方法主观性较强，具体标准很难掌握，往往存在着很大的不确定性——不同人的观察结果往往不同，常会引起较大的争议。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于鉴别刀鲚和短颌鲚的分子标记。

本发明的另一目的是提供一种鉴别刀鲚和短颌鲚的方法。

一种用于鉴别刀鲚和短颌鲚的分子标记，该分子标记位于刀鲚和短颌鲚的线粒体COI基因上，具体位置为线粒体COI基因的236bp处，有一个单碱基变异位点，变异信息为T>C，刀鲚在此位点为T，短颌鲚在此位点为C。

本发明所述的分子标记在鉴别刀鲚和短颌鲚中的应用。

一种鉴别刀鲚和短颌鲚的方法，通过检测所述的分子标记来鉴别刀鲚和短颌鲚。

本发明方法优选检测所述的变异位点，此位点为T则是刀鲚，此位点为C则是短颌鲚。

作为本发明方法的一种优选方式，提取不同待鉴别鱼类个体的基因组DNA，采用PCR产物直接测序法获得不同个体的COI基因序列并进行比对，线粒体COI基因的236bp处为T则是刀鲚，此位点为C则是短颌鲚，从而鉴别刀鲚和短颌鲚。

作为本发明方法的进一步优选，提取待鉴别鱼个体的基因组DNA，通过PCR扩增包含该变异位点的线粒体COI基因片段，采用BspACI限制性内切酶对所得到的PCR产物进行酶切，用2％的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，短颌鲚产生大小分别为216bp和105bp的两个条带，而刀鲚的相应扩增片段不能被酶切(显示为321bp的单一条带)。

作为本发明方法的进一步优选，所述的PCR-RFLP中使用的PCR引物对为SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2；使用的限制性内切酶为BspACI限制性内切酶。

作为本发明方法的另一种优选方式，提取待鉴别鱼个体的基因组DNA，PCR扩增含有所述变异位点的基因片段，通过直接测序获得包含所述分子标记的序列，从而鉴别该个体是刀鲚还是短颌鲚。

用于鉴别刀鲚和短颌鲚的PCR引物，上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

用于鉴别刀鲚和短颌鲚的PCR引物，上游引物为SEQ ID NO.3，下游引物为SEQ ID NO.4。

有益效果：

本发明通过PCR扩增获得了长江刀鲚和短颌鲚的COI基因序列，对其进行比对后发现短颌鲚和刀鲚在该基因上存在着一个较为稳定的单碱基变异T>C(即在短颌鲚的COI基因上产生了一个BspACI限制性酶切位点)。在此基础上，我们设计了一对特异性PCR引物，该引物可扩增出刀鲚和短颌鲚COI基因上包含该变异位点的一段基因序列(321bp)。采用BspACI限制性内切酶对所得到的PCR产物进行酶切，对酶切产物进行电泳分离，可以方便快速地对刀鲚和短颌鲚进行区分(刀鲚为1条带，短颌鲚为2条带)。本方法克服了仅仅依靠经验观察来鉴别刀鲚和短颌鲚的诸多不足，为刀鲚和短颌鲚的准确鉴定提供了快速、可靠的分子生物学鉴定技术。

附图说明

图1.刀鲚与短颌鲚COI基因序列比对示意图(红色框表示所发现的碱基变异)

图2.刀鲚和短颌鲚COI基因酶切电泳图谱及测序验证图谱

注:采用以PCR为基础的限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对刀鲚和短颌鲚的COI基因片段进行分析，并通过PCR产物直接测序的方法加以确认。A:电泳图谱中1-10号泳道为短颌鲚COI基因的酶切电泳图谱，11-20号泳道为刀鲚COI基因的酶切电泳图谱，M泳道为DL2000marker；B:PCR产物直接测序验证图谱，*分别表示刀鲚和短颌鲚COI基因中的T>C变异位点。

具体实施方式

实施例1

(1)变异信息：位于刀鲚和短颌鲚的线粒体COI基因上，具体位置为线粒体COI基因的236bp处，碱基变异信息为T>C。

(2)变异位点的发现

以采集自洞庭湖的短颌鲚和采自长江南京段的长江刀鲚为研究对象(采样量均为100尾以上)，参照《中国动物志》所表述方法以及生态类型对样本进行鉴别确定。根据短颌鲚线粒体全序列(NC026912.1)设计引物用于扩增COI基因，

F-1:ACCTACCTGTGGCAATCA(SEQ ID NO.3)

R-1:TGGAGAACGATGTCAAGTG(SEQ ID NO.4)

从样本中分别随机取样5尾(刀鲚、短颌鲚各5尾)进行PCR扩增，PCR产物直接测序后进行比对分析，在线粒体COI基因的236bp处发现了一个稳定的碱基变异T>C(图1)，该变异位于编码苏氨酸(Thr)密码子的第3位，属于同义突变。

(3)检测方法

①PCR反应

对发现的碱基变异T>C进行限制性酶切位点分析，发现该变异在短颌鲚的COI基因上产生了一个BspACI限制性酶切位点(C^CGC)。

以此为基础，我们另外设计出了一对可以扩增较短COI基因序列的特异性PCR引物(扩增片段包含变异位点T>C)。

F-2：CTGAGCAGGAATAGTAGGAA(SEQ ID NO.1)

R-2：GGCGGATAGACTGTTCAT(SEQ ID NO.2)

PCR扩增序列信息如SEQ ID NO.5所示。

从所采集的刀鲚和短颌鲚样本中另外再随机选择10尾样本进行PCR扩增，反应体系如下：10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5μL，dNTP(2.5mM each)2uL，正反向引物各0.5μL(10nM)，Taq酶0.5U，DNA模板1μL(100ng/μL)，ddH₂O补足体积至25μL。PCR反应共计30个循环，循环前95℃预变性3min，每个循环包括95℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后于72℃延伸5min。

扩增产物用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测合格后的PCR产物于-20℃保存用于后续的酶切反应。

②酶切条件

采用BspACI限制性内切酶对所得到的PCR产物进行酶切，酶切体系包括10×NEB缓冲液1μL，PCR产物5μL，BspACI 0.25μL，双蒸水补足体积至10μL。37℃酶切过夜后用2％的琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离。酶切以后，对部分样本的PCR产物进行直接测序验证，证明了酶切反应的准确性。

如图2所示，由于所扩增的短颌鲚COI基因序列上具有一个BspACI限制性酶切位点(C^CGC)，经BspACI酶切后，所有10尾样本均表现为2条带(大小分别为216bp和105bp)；而10尾刀鲚样本所扩增出来的COI基因序列均不能被BspACI酶进行限制性酶切，仍然表现为1条带(大小为321bp)。

实施例2

把样本量增加到100尾刀鲚，100尾短颌鲚，按照实施例1方法进行检测，结果显示准确率为100％，该标记仍然是可靠。

本方法克服了仅靠经验观察来鉴别长江刀鲚和短颌鲚的诸多不足，为刀鲚和短颌鲚的准确鉴定提供了快速、可靠的分子生物学鉴定技术。