一种细胞免疫佐剂TSA‑41的制备方法及应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，特别是用于疫苗佐剂的一种细胞免疫佐剂TSA-41的制备方法及应用。

背景技术：

疫苗类的生物制品通过刺激机体免疫系统,产生免疫物质（如抗体）才发挥其功效，在人体内出现体液免疫、细胞免疫或细胞介导免疫。它是人类对事物认识的深入和科技的进步所带来的产物，是人类抵御外界不利因素的威胁、提高健康质量的一大利器。然而，单一疫苗的有效成分在进行免疫提呈的过程中，往往受到各种生物途径的影响，使得其无法实现预期的免疫效果，因此需要一些可增强机体对疫苗抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的佐剂作为辅助。

目前，临床上已广泛应用的疫苗佐剂有氢氧化铝等，这些佐剂对很多预防性疫苗的接种起到了很好的免疫增强效果。这些佐剂主要通过改变抗原的物理形状，延长抗原在机体内保留时间；刺激单核吞噬细胞对抗原的提呈能力；刺激淋巴细胞分化，增加扩大免疫应答能力等机制来增强免疫应答。

随着疫苗研究的不断深入，传统疫苗通过诱导机体产生中和抗体而激发保护性免疫反应的作用方式已远远不能满足人类健康的需求。许多新型疫苗，如TAA（肿瘤相关抗原）疫苗等，以诱发机体产生特异性细胞免疫反应为手段，从而实现病变细胞在体内得到生物清除的目的。这类疫苗对于一些肿瘤患者的生物治疗有着极其重大的临床意义。但是这类新型疫苗在临床研究中往往面临诱发特异性细胞免疫水平低下的困扰，造成临床试验结果不理想。因此，迫切需要有一种佐剂来增强这些细胞免疫类疫苗的临床效果。研究表明，氢氧化铝无法对这类疫苗产生有效的佐剂功能，而实验室研究中被证明能有效提高细胞免疫水平的佐剂有非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤核苷酸基序的寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN）等，但是CpG ODN作为一种核酸其安全性还存在很大的隐患，故而迟迟未能获批上市。

因此，寻找一种安全、有效的佐剂来增强疫苗的细胞免疫反应对于细胞免疫类疫苗的研发有着巨大的推动作用。

技术实现要素：

本发明的目的是通过基因工程技术提供一种细胞免疫佐剂TSA-41的制备方法，并将该佐剂用于增强疫苗的细胞免疫水平。

本发明为人工设计一种基因序列SEQ ID NO.1，通过基因工程技术，将SEQ ID NO.1重组基因序列插入大肠杆菌表达系统，通过大肠杆菌高效表达出具有二聚体结构的可溶性重组蛋白TSA-41，所得TSA-41重组蛋白通过分离、纯化，最终得到高纯度、高活性的重组蛋白。该重组蛋白作为佐剂可以有效提高细胞免疫类生物疫苗的免疫效果，避免了重组蛋白复性折叠的工艺步骤，大大提高了制备效率，有利于工业化生产。

本发明细胞免疫佐剂TSA-41的制备方法，通过人工基因合成技术合成SEQ ID NO.1基因序列，以SEQ ID NO.1基因序列，该基因序列在重组大肠杆菌中能够表达出具有二聚体结构的可溶性重组蛋白，获得的重组蛋白命名为TSA-41，以TSA-41重组蛋白作为佐剂的有效成分，SEQ ID NO.1基因序列为：

ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCTGGCTTGTCCGTGGGCTGTATCTGGCGCACGTGCGTCTCCAGGCTCCGCAGCATCTCCGCGCCTGCGTGAAGGCCCGGAACTGTCCCCGGACGATCCGGCTGGTCTGCTGGATCTGCGTCAGGGCATGTTCGCACAACTGGTGGCACAGAACGTACTGCTGATTGATGGCCCGCTGTCTTGGTACTCCGATCCGGGTCTGGCAGGCGTGTCCCTGACCGGCGGTCTGAGCTATAAAGAGGATACTAAGGAACTGGTAGTTGCTAAAGCGGGCGTGTACTACGTGTTCTTCCAACTGGAGCTGCGTCGCGTTGTTGCAGGTGAGGGCAGCGGTTCTGTTAGCCTGGCGCTGCACCTGCAACCACTGCGCTCTGCGGCTGGTGCGGCAGCTCTGGCGCTGACCGTAGACCTGCCGCCAGCATCCAGCGAGGCGCGTAACTCCGCGTTCGGCTTCCAGGGCCGCCTGCTGCACCTGTCCGCAGGCCAGCGTCTGGGCGTACATCTGCATACCGAAGCGCGTGCACGTCACGCTTGGCAACTGACCCAGGGCGCTACCGTGCTGGGTCTGTTCCGTGTAACTCCAGAGATTCCGGCCGGTCTGCCGTCTCCGCGTTCCGAATAA。

本发明涉及细胞免疫佐剂TSA-41用SEQ ID NO.1基因序列经过下列步骤得到TSA-41细胞免疫增强佐剂：

(1) 通过基因工程技术将SEQ ID NO.1基因序列插入大肠杆菌表达系统，获得表达SEQ ID NO.1基因的重组大肠杆菌；

(2) 将步骤(1)所得重组大肠杆菌进行37℃培养，15-25℃诱导其表达重组蛋白TSA-41，获得诱导后的重组大肠杆菌；

(3) 将步骤(2)所得诱导后的重组大肠杆菌进行细胞破碎，通过离心获得重组大肠杆菌破碎上清液；

(4) 将步骤(3)所得重组大肠杆菌破碎上清液通过镍离子亲和层析柱进行分离纯化，得到TSA-41重组蛋白初步纯化液；

(5) 将步骤(4)所得TSA-41重组蛋白初步纯化液通过凝胶排阻层析柱进行分离纯化，得到TSA-41重组蛋白纯化液；

(6)将步骤 (5)所得TSA-41重组蛋白纯化液置于透析袋中，用透析液进行透析，获得稳定的TSA-41重组蛋白，该蛋白即为所需的TSA-41佐剂；所述透析液配方为：甘氨酸1-3克，氯化钠5-20克，甘油20-100克，加水溶解定容至1升，调节pH值至7.0-9.0。

本发明涉及SEQ ID NO.1基因表达的TSA-41重组蛋白作为疫苗佐剂的有效成分，能有效刺激淋巴细胞的体外增殖。

本发明涉及SEQ ID NO.1基因表达的TSA-41重组蛋白作为疫苗佐剂的有效成分，能增强疫苗的细胞免疫效果。

本发明的优点和效果：通过基因工程技术提供一种细胞免疫佐剂TSA-41的制备方法，SEQ ID NO.1基因序列通过大肠杆菌快速、高效表达具有细胞免疫佐剂活性的重组蛋白。该重组蛋白在大肠杆菌中以可溶的形式表达，表达过程中直接形成二聚体结构，避免了重组蛋白复性折叠的工艺步骤，大大提高了制备效率，有利于工业化生产。通过本发明所制备的佐剂TSA-41可以显著提高细胞免疫类生物疫苗的免疫效果。

附图说明

图1.为TSA-41重组蛋白的表达纯化电泳图谱

M：蛋白分子量Marker；

1：诱导表达前；

2：诱导表达后；

3：诱导后破菌液；

4：破菌液上清；

5：柱层析上样；

6：柱层析流穿；

7：柱层析洗脱。

图2.为TSA-41重组蛋白纯化样品聚体分析

M：蛋白分子量Marker；

1：样品还原处理；

2：样品非还原处理。

图3. TSA-41佐剂对小鼠淋巴细胞体外增殖作用的结果

图4.为酶联斑点免疫法检测TSA-41佐剂对治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗的免疫增强作用（原始结果）；

图5.为酶联斑点免疫法检测TSA-41佐剂对治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗的免疫增强作用（柱状图分析）；

图6.为小鼠肿瘤模型检测TSA-41佐剂对治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗的免疫增强作用。

具体实施方式

以下实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

实施例1 TSA-41佐剂的制备

(1)通过人工基因合成技术合成SEQ ID NO.1基因序列，并通过NdeⅠ和XbaⅠ两个酶切位点将SEQ ID NO.1基因插入pET28a大肠杆菌表达质粒，得到表达SEQ ID NO.1基因序列的重组质粒SEQ ID NO.1-pET28a。

(2)取装有BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞50微升的1.5毫升离心管置于冰上放置5分钟，加入50纳克SEQ ID NO.1-pET28a重组质粒，轻轻混匀，并在冰上培养30分钟；将离心管置于42℃水浴锅中放置90秒，迅速取出置于冰上放置 5分钟；向离心管中加入900微升LB液体培养基，37℃震荡培养45分钟，取培养产物200微升涂布于直径10厘米的LB固体培养基平皿中，37℃培养过夜。最终得到表达SEQ ID NO.1基因序列的重组大肠杆菌单克隆菌落。

(3)挑取表达SEQ ID NO.1基因序列的重组大肠杆菌单克隆菌落，置于100毫升LB液体培养基中，37℃培养过夜进行活化；按1：100的接种比例将活化

后的菌液接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃下培养菌体OD600至0.8，然后加IPTG浓度至1毫摩尔进行诱导，在25℃条件下继续培养20小时，诱导前、诱导后样品取样进行电泳分析（见图1所示）。

(4)用离心机离心收集诱导表达后的菌落，离心条件为：8000转/分钟离心15分钟。弃去上清，所得沉淀用破菌缓冲液以1：10的质量体积比（g/v）重悬，并用超音仪超声破菌，超声后菌液用离心机14000 转/分钟离心30分钟收集上清。

(5)将破菌离心上清液用通用公司的5ml柱体积的镍离子亲和层析柱进行层析纯化，层析条件如下：先用50毫升破菌缓冲液平衡层析柱，然后取40毫升破菌离心上清液以4毫升/分钟的流速上样至层析柱中，再用50毫升破菌缓冲液平衡层析柱，最后用洗脱液洗脱得到TSA-41重组蛋白初步纯化液（图1所示）。

(6) 将所得TSA-41重组蛋白纯化液同时进行还原性和非还原性蛋白电泳，结果显示（见图2所示）所得TSA-41重组蛋白单体分子量为23千道尔顿（kD）左右，聚体分子量为46kD左右。

(7) 将所得TSA-41重组蛋白初步纯化液用东曹公司的凝胶排阻层析柱进行分离纯化，去除未形成聚体的蛋白。

(8)将所得TSA-41重组蛋白纯化液置于8000道尔顿透析袋中，用透析液进行透析，获得稳定的TSA-41重组蛋白，该蛋白即为所需的TSA-41佐剂。

所用溶液如下：

LB液体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，加水溶解定容至1升。

LB固体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，琼脂粉15克，加水定容至1升。

破菌缓冲液：三羟甲基氨基甲烷2.4克,氯化钠29.22克，咪唑3.4克，加水溶解定容至1升，调节pH值至8.5。

洗脱液：三羟甲基氨基甲烷2.4克,氯化钠29.22克，咪唑34克，加水溶解定容至1升，调节pH值至8.5。

透析液：甘氨酸1.5克，氯化钠9克，甘油50克，加水溶解定容至1升，调节pH值至8.0。

实施例2 TSA-41佐剂对小鼠淋巴细胞的体外增殖作用

（1）取C57/BL小鼠处死，在无菌条件下取脾脏轻轻碾压，获得脾脏细胞悬液。

（2）所得脾脏细胞悬液用红细胞裂解液作用5分钟，1000转/分钟离心弃上清，再用无血清RPMI-1640培养基洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于一定量的血清RPMI-1640培养基中，获得小鼠脾淋巴细胞悬液。

（3）将小鼠脾淋巴细胞悬液稀释至5×10⁶个细胞/毫升，接种于96孔细胞培养板中，每孔100微升。

（4）将TSA-41佐剂用细胞培养液稀释成系列浓度4毫克/毫升、2毫克/毫升、1毫克/毫升、0.5毫克/毫升、0.25毫克/毫升、0.125毫克/毫升、0.063毫克/毫升、0.032毫克/毫升、0.016毫克/毫升，分别取各个浓度的佐剂1微升加至步骤（3）所述的含有淋巴细胞的孔板中，每个浓度的佐剂做三个细胞复孔，并且以佐剂透析缓冲液作为阴性对照。

（5）将用TSA-41佐剂刺激的淋巴细胞在细胞培养箱中培养24小时。

（6）在每个细胞培养孔中加入15微升CCK-8细胞增殖检测试剂，细胞培养箱中继续培养2小时，取出细胞培养板，在酶标仪中用以630纳米为参比波长读取各孔的OD450（450纳米波长下的吸光度值）。

（7）加入TSA-41佐剂的淋巴细胞其OD450要明显高于未加佐剂的对照组（见图3所示），说明加入TSA-41佐剂的淋巴细胞其生长水平要明显高于未加佐剂的对照组。

实施例3 酶联斑点免疫法检测TSA-41佐剂对治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗的免疫增强作用

（1）实验动物每组设三只C57/BL小鼠，分为三个组： TSA-41佐剂组、治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗组以及治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗和TSA-41佐剂共同免疫组。其中，治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗接种量为100微克，TSA-41佐剂接种量为5微克，每只小鼠间隔两天加强免疫，共接种三次。

（2）在初次免疫第10天处死小鼠，在无菌条件下取脾脏轻轻碾压，获得脾脏细胞悬液。

（3）所得脾脏细胞悬液用红细胞裂解液作用5分钟，1000转/分钟离心弃上清，再用无血清RPMI-1640培养基洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于一定量的血清RPMI-1640培养基中，获得小鼠脾淋巴细胞悬液。

（4）将小鼠脾淋巴细胞悬液稀释至5×10⁶个细胞/毫升，按照酶联斑点免疫检测说明书进行操作。

（5）结果显示：TSA-41佐剂自身不会引起小鼠产生特异性γ干扰素表达水平，但是TSA-41佐剂与治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗联合免疫可以有效提高小鼠特异性γ干扰素的表达水平（见图4、图5所示）。

实施例4 小鼠肿瘤模型检测TSA-41佐剂对治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗的免疫增强作用

(1)小鼠肿瘤模型的建立

将TC-1肿瘤模型细胞以1:4传代，待细胞长至约90%融汇度时，用37℃预热的0.25% 胰酶消化20秒，含10%新生牛血清的1640培养基中和后，1000转/分钟离心5分钟，弃上清，重悬于无菌等渗磷酸盐缓冲液，再次离心去上清并重悬于磷酸盐缓冲液后，牛鲍氏计数板充池计数至目的浓度。所得细胞用磷酸盐缓冲液稀释至2.5×10⁵个/毫升，对实验小鼠C57/BL左腿内侧腹股沟处皮下接种肿瘤细胞100微升/只。

(2)分别用磷酸盐缓冲液、TSA-41佐剂、治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗以及治疗用人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗和TSA-41佐剂混合物分四个实验组接种已建立的小鼠肿瘤模型，间隔两天加强免疫，共接种三次，每个实验组设10只肿瘤模型小鼠。

(3)定期对各个小鼠的程瘤情况进行观察并记录。

(4)结果显示：单独的TSA-41佐剂不对小鼠肿瘤模型产生作用，TSA-41佐剂与疫苗联合接种所得抗肿瘤效果要远远高于单独的疫苗接种（见图6所示）。