一种解淀粉芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶及基因和应用的制作方法

本发明涉及一种亚硝酸盐还原酶基因，尤其是一种Bacillus amyloliquefaciens H47亚硝酸盐还原酶基因的克隆表达及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

亚硝酸盐可引发婴儿高铁血红蛋白症，婴儿先天畸形，甲状腺肿并与蛋白质分解产物二级胺反应生成强致癌物亚硝胺。水体及食品中亚硝酸盐有限量标准。亚硝酸还原酶广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或铵，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

按照参与途径和反应产物的不同可将亚硝酸还原酶分为三类:(1)铜型亚硝酸还原酶(Cu-NiRs)和细胞色素cd1型亚硝酸还原酶(cd1NiRs)分别由nirK和NirS编码参与反硝化途径，催化亚硝酸盐降解为NO。(2)NirBD和NrfAH参与亚硝酸盐异化途径，催化亚硝酸盐降解为铵。(3)NIT-6和NirA参与亚硝酸盐同化途径，催化亚硝酸盐降解为铵。不同微生物中含有亚硝酸盐还原酶的种类及种数不尽相同。本实验室从蜂蜜中分离得到一种解淀粉芽孢杆菌可降解亚硝酸盐并测定其降解亚硝酸盐产物为铵盐。反硝化细菌中含有铜型亚硝酸还原酶(Cu-NiRs)或细胞色素cd1型亚硝酸还原酶(cd1NiRs)，已被广泛研究。然而国内外未见关于解淀粉芽孢杆菌所含有的亚硝酸盐还原酶的种类及性质的报道。

技术实现要素：

为研究解淀粉芽孢杆菌中亚硝酸盐还原酶的种类及解淀粉芽孢杆菌降解亚硝酸盐的机理。本发明通过对Bacillus amyloliquefaciens H47中亚硝酸盐还原酶基因编码基因在大肠杆菌中克隆表达及酶活性测定来研究该菌中含有亚硝酸盐还原酶的种类及降解亚硝酸盐的途径，并通过亲和层析纯化出较高纯度的亚硝酸盐还原酶，为研究其酶学性质，改良Bacillus amyloliquefaciens H47亚硝酸盐降解率奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种解淀粉芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并表达SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重组蛋白。

一种解淀粉芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶，由权利要求1所述基因编码的蛋白质。

含有上述解淀粉芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒，该重组质粒中含组氨酸标签。

所述基因编码的蛋白质及含有所述基因的转基因细胞系、基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本发明保护的范围。

一种产亚硝酸盐还原酶的重组大肠杆菌及其构建、表达方法，包括如下步骤：

(1)以解淀粉芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，进行上下游引物的设计，设计酶切位点为NdeI、BamHI；

(2)提取解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens H47的总基因DNA，以其为模版，通过PCR扩增得到2830bp的亚硝酸盐还原酶的基因片段nirBD；

(3)利用NdeI、BamHI工具酶将扩增片段和质粒pColdⅡ于37℃下分别切成具有两个粘性末端的片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段,并用T4DNA连接酶连接，构建重组表达载体pColdⅡ-NiRBD，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化并测序验证；

(4)分别将阳性克隆，加IPTG诱导的含有空质粒的BL21组(阴性对照组)，不加IPTG诱导的含重组质粒的BL21组(阳性对照组)接种到LB液体培养基中(含0.15g/L NaNO₂，50mg/L氨苄青霉素)于37℃条件下培养至OD₆₀₀＝0.4，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导表达24h，转速200rpm。4℃，8000rpm离心10min得发酵液上清，按照GB 5009.33—2010所述方法2——分光光度法(略微改动)对发酵液中亚硝酸盐含量进行测定，并收集菌体。

(5)所述分光光度法测定发酵液中亚硝酸盐含量的方法为：取3mL上清液加去离子水至28.5mL，加亚铁腈化钾(106g/L)0.75mL，乙酸锌溶液(106g/L)0.75mL，混匀反应30min。8000r/min离心10min。取2mL上清于25mL比色管中加2mL对氨基苯磺酸钠溶液(4g/L)颠倒均匀反应3min再加1mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，用去离子水定容至25mL，颠倒均匀，反应15min，于波长538nm处测吸光度。

所述Bacillus amyloliquefaciens H47是从蜂蜜中筛选出的，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2013283，保藏日期2013年6月24日。

所述PCR引物为：

m1：5’-GCCGCATATGATGGGAAAAAAACAGCTAGTC-3’，(SEQ ID NO.3)

m2：5’-GCCGGGATCCTCAATACAGGATGTATACATTCTC-3’(SEQ ID NO.4)。

所述重组菌生产亚硝酸盐还原酶的步骤为：利用IPTG对重组菌产亚硝酸盐还原酶进行诱导表达，诱导表达后，超声破碎菌体，利用Ni⁺柱亲和层析法纯化得到可溶性酯酶，咪唑洗脱浓度为500mM；所述诱导表达条件为将含重组表达质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃、200rpm条件下培养至OD600＝0.4，随后转入15℃培养至加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导表达24h，转速200rpm；

酶活测定方法：以NaNO₂为底物，以甲基紫精为电子供体，2mL反应体系包含50mM磷酸缓冲液1.6mL，甲基紫精(0.01％)100μL，酶液50μL，NaNO₂(1mM)50μL，NaHCO₃及低亚硫酸钠溶液(0.8％)200μL，37℃反应30min。剧烈震荡终止反应，加1mL对氨基苯磺酸钠溶液(4g/L)颠倒均匀反应3min再加0.5mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，颠倒均匀，反应15min，以不加酶液组调零，于波长538nm处测吸光度。

LB培养基成分为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，pH7.2。

与其他技术相比，该发明的积极效果在于：

(1)本发明从Bacillus amyloliquefaciens H47中分离、纯化了亚硝酸盐还原酶基因。该基因包括两个相邻的开放阅读框。通过对经IPTG诱导的含空质粒和重组质粒的大肠杆菌及不加IPTG诱导的含重组质粒的大肠杆菌粗酶液进行SDS-PAGE分析及亲和层析技术来验证工程菌可以诱导表达NiRBD重组蛋白。

(2)本发明可以通过IPTG诱导表达得到大量的细胞内NiRBD，可以应用到工业中进行大量生产。

(3)本发明利用亲和层析作用纯化得到纯度较高的NiRBD重组蛋白，解决了从解淀粉芽孢杆菌中分离亚硝酸盐还原酶和含量较高NiRBD的难题。

(4)本发明得到的工程菌表达纯化的重组蛋白要添加电子供体才能有效地降解亚硝酸盐。

(5)本发明为研究Bacillus amyloliquefaciens H47降解亚硝酸盐的机制及调控提供了保障。

附图说明

图1为实施例1中利用Bacillus amyloliquefaciens H47基因组DNA为模版进行PCR扩增产物鉴定图，其中1为PCR扩增产物，M为DNA分子质量标准。

图2为重组质粒pColdII-NiRBD酶切验证图。

图3为Bacillus amyloliquefaciens H47亚硝酸盐还原酶的大肠杆菌重组表达。

图4为纯化后NiRBD蛋白质的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

一般性说明：实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司，操作完全按照相应说明进行。引物合成与质粒测序由上海桑尼公司完成。

实施例1：Bacillus amyloliquefaciens H47亚硝酸盐还原酶基因的克隆表达，步骤如下：

应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取Bacillus amyloliquefaciens H47菌体基因组总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。根据全基因测序设计上下游引物：m1(SEQ ID NO:3,5’-GCCGCATATGATGGGAAAAAAACAGCTAGTC-3’)与m2(SEQ ID NO:4,5’-GCCGGGATCCTCAATACAGGATGTATACATTCTC-3’)，应用PCR方法，以上述Bacillus amyloliquefaciens H47基因组为模板，以上述m1和m2为特异性引物，扩增Bacillus amyloliquefaciens H47亚硝酸盐还原酶基因全长编码框序列。PCR反应条件为：以基因组DNA为模板，在50μL反应体系中，加入10×ExTaqBuffer 5μL、25mM MgCl₂ 2μL、2.5mM dNTP混合物4μL、20μM上下游引物各1μL、Ex Taq酶(Takara公司)1μL及DNA模板1μL、补水至50μL。PCR循环参数为：94℃预变性5min，再进行30个循环(98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸3min)，最后于72℃延伸10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，在2000与3000bp之间有明显的DNA条带，大小约为2800。用割胶回收试剂盒回收该DNA条带，经测序，结果如序列。

将割胶回收所得的NiRBD基因的DNA序列与商业化表达质粒pColdII分别进行NdeI、BamHI双酶切，于37℃反应1h，接着分别回收片段DNA和质粒DNA。

将上述两个片段进行连接，在连接反应体系中，于16℃下进行连接14～16h，即获得重组质粒pColdⅡ-NiRBD，所述的连接体系为：回收酶切pColdII 2μL，回收目的基因片段6μL，T4DNA连接酶1μL，T4DNA连接酶缓冲液2μL，补水至20μL；

将20μL连接产物转化至100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，然后混匀，冰浴30min，然后42℃热激90s，再冰浴5min，加入880μL的LB培养基用于感受态细胞的复苏。细胞培养液放置在37℃，200rpm的摇床中培养40min后，取75μL涂布于Amp抗性平板上，37℃培养8～12h后，对长出的单菌落进行验证，并进一步测序验证基因序列是否正确。

质粒pColdⅡ-NiRBD用单酶切和双酶切方法鉴定，鉴定结果如图2所示，泳道1为双酶切产物，泳道2为双酶切产物。从图中清楚可见重组质粒经单酶切后有一个条带，且分子量与理论中重组质粒大小7200bp吻合；重组质粒经双酶切后有两条条带，且一条约为4300bp，一条约为2800bp，说明构建好的载体经酶NdeI、BamHI双酶切成两条片段，重组质粒pColdⅡ-NiRBD构建成功。

实施列2：Bacillus amyloliquefaciens H47亚硝酸盐还原酶的大肠杆菌诱导表达，具体如下：

将实施例1所得的阳性克隆菌接种于3mlLB液体培养基中(含50mg/L氨苄青霉素)于37℃，200rpm下过夜培养，然后以2％接种量接种到LB液体培养基中(含0.15g/L NaNO₂及50mg/L氨苄青霉素)于37℃条件下培养至OD₆₀₀＝0.4，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导表达24h，转速200rpm。4℃，8000rpm离心10min得发酵液上清按照GB 5009.33—2010所述方法2——分光光度法(略微改动)对发酵液中亚硝酸盐含量进行测定。并收集菌体。同时设立对照组，一组为加IPTG诱导的含有空质粒的BL21组(阴性对照组)，另一组为不加IPTG诱导的含重组质粒的BL21组(阳性对照组)，按本实施例的诱导表达过程进行诱导表达，对阴性对照组和阳性对照组的菌体发酵液进行相同条件的操作，测定发酵液亚硝酸盐含量结果如表1。可以得出含重组质粒的BL21组亚硝酸盐还原酶基因成功进行诱导表达并具有酶学活性。

表1

所述分光光度法测定发酵液中亚硝酸盐含量的方法为：取3mL上清液加去离子水至28.5mL，加亚铁腈化钾(106g/L)0.75mL，乙酸锌溶液(106g/L)0.75mL，混匀反应30min。8000r/min离心10min。取2mL上清于25mL比色管中加2mL对氨基苯磺酸钠溶液(4g/L)颠倒均匀反应3min再加1mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，用去离子水定容至25mL，颠倒均匀，反应15min，于波长538nm处测吸光度。

LB培养基成分为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，pH 7.2。

实施例3：重组菌中粗蛋白的提取，纯化及酶活测定

将实施例2中所获得的重组菌体及对照组菌体用无菌水洗涤两次，按每100ml培养液加10ml，4℃预冷的0.02M的磷酸缓冲液(pH7.0)冰浴超生破碎5min，破碎后于4℃8000rpm离心5min，取其上清为NiR粗蛋白液，在相同浓度下进行SDS-PAGE检测，结果如图3所示，泳道1为加IPTG诱导的含空质粒的BL21组粗酶液，泳道3为不加IPTG诱导的含重组质粒的BL21组粗酶液，泳道5为加IPTG诱导的含重组质粒的BL21组粗酶液，说明基因工程菌经诱导后有两条明显的特异表达条带，且条带分子量与预期大小分子量一致。

利用Ni+柱亲和层析法纯化得到可溶性亚硝酸盐还原酶，咪唑洗脱浓度为500mM。纯化后的产物以亚硝酸钠为底物，甲基紫精为电子供体测其酶活，重组蛋白检测到活性，并通过SDS-PAGE检测其纯度，结果如图4所示。泳道6为纯化后蛋白，泳道7为不加IPTG诱导的含有重组质粒的BL21组菌体破壁后上清液，泳道8为加IPTG诱导的含有重组质粒的BL21组菌体破壁后上清液。对照泳道6，7，8条带说明泳道6中箭头所指的条带为重组蛋白的两个亚基。

酶活测定方法：以NaNO₂为底物，以甲基紫精为电子供体，2mL反应体系包含50mM磷酸缓冲液1.6mL，甲基紫精(0.01％)100μL，酶液50μL，NaNO₂(1mM)50μL，NaHCO₃及低亚硫酸钠溶液(0.8％)200μL，37℃反应30min。剧烈震荡终止反应，加1mL对氨基苯磺酸钠溶液(4g/L)颠倒均匀反应3min再加0.5mL盐酸萘乙二胺溶液(2g/L)，颠倒均匀，反应15min，以不加酶液组调零，于波长538nm处测吸光度。