一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法与流程

本发明属于基因工程领域的基因重组表达
技术领域：
，具体涉及一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法。
背景技术：
：大肠杆菌重组蛋白表达体系因其遗传背景清晰、生长周期短、待选质粒资源大等优点已经被广泛的应用于表达外源蛋白。但大肠杆菌重组蛋白表达体系也有一定的局限性，比如：对于过短或过长的外源蛋白无法有效表达，二硫键形成能力偏低，不具备真核表达体系翻译后修饰的能力，表达的外源蛋白聚集形成包涵体(CabritaLD.,BottomleySP.Proteinexpressionandrefolding-Apracticalguidetogettingthemostoutofinclusionbodies[J].BiotechnologyAnnualReview,2004,10(4):31-50)。由于包涵体不具有生物学活性或活性很低，所以需要经过变性和复性才能得到有活性的蛋白。不同外源蛋白的理化性质存在一定的差异，目前并不存在一个可以提高外源蛋白可溶表达的通用策略，虽然目前国内外有大量针对蛋白质胞外复性的研究，但是复性过程费力耗时，成功率不高，经济效益较低。因此研究外源蛋白的可溶性表达具有较高的经济效益和学术意义。hEGF不仅能刺激细胞增殖、分化和迁移，在伤口愈合、器官发生和细胞信号传导中扮演着极其重要的角色。目前，hEGF已被广泛应用于医药和化妆品领域，具有很高的经济价值。由于分子内有三个二硫键，难以通过大肠杆菌表达体系高水平生产具有生物活性的hEGF蛋白。由于SUMO蛋白具有高度疏水核心，SUMO蛋白与目的蛋白进行融合表达，为融合蛋白的折叠提供成核位点，促进目的蛋白正确折叠，可有效提高融合蛋白的可溶性表达。SUMO具有良好的热稳定性，有效地阻遏大肠杆菌内源蛋白酶水解，进一步提高融合蛋白的表达量，SUMO与hEGF融合表达可以显著促进目的蛋白的可溶性表达(SuZ.,HuangY.,ZhouQ.,etal.High-levelexpressionandpurificationofhumanepidermalgrowthfactorwithSUMOfusioninEscherichiacoli[J].ProteinPeptLett,2006,13(8):785-92)。SUMO蛋白的去除可以依靠特异性强的SUMO蛋白酶，但是SUMO蛋白酶的添加与去除会增加工艺步骤，提高生产成本。利用内含肽在不同环境下具有形成和切除特异肽键的能力，在与目的蛋白的结合部位发生自剪切，有效地切除各种目的蛋白的融合标签(ChongS.,MershaFB.,CombDG.,etal.Single-columnpurificationoffreerecombinantproteinsusingaself-cleavableaffinitytagderivedfromaproteinsplicingelement[J].Gene,1997,192(2):271-81)。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法。该方法实现人源EGF(hEGF)蛋白在大肠杆菌的高效功能性表达，显著降低蛋白质纯化成本，同时为复杂的真核生物蛋白质在原核表达系统的高效生产提供了新的设计思路，具有一定的科研意义和社会效益。构建了在N端融合内含肽表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO，实现了不带任何外源氨基酸的hEGF蛋白在大肠杆菌工程菌高效功能性表达。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种促进人表皮细胞生长因子在大肠杆菌高效功能性表达的方法，包括如下步骤：构建表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO，实现了不带任何外源氨基酸的hEGF蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效可溶表达。所述的hEGF的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述的Mxe的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述的SUMO的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。融合蛋白依次由人表皮细胞生长因子(hEGF，核苷酸序列为SEQIDNO：1)、内含肽(Mxe，核苷酸序列为SEQIDNO：2)和小泛素相关修饰物蛋白(SUMO，核苷酸序列为SEQIDNO：3)组成。所述的表达载体的构建方法，通过酶切连接方法将人表皮细胞生长因子hEGF基因克隆到pET21a载体，构建pET21a-hEGF载体，通过RestrictionSite-Free(RF)克隆技术将SUMO基因融合到hEGF基因的C端，内含肽Mxe基因插入hEGF和SUMO基因中间，构建表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO。包括以下步骤：a.以人工合成的SUMO-hEGF载体为模板，扩增hEGF基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，将PCR产物与表达载体pET21a进行连接，连接产物pET21a-hEGF转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α；b.以人工合成的SUMO-hEGF载体为模板，用RFES引物扩增SUMO基因，RF克隆构建pET21a-hEGF-SUMO表达载体，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α；c.以PTWIN1载体为模板，用RFEMSH引物扩增Mxe基因，RF克隆构建pET21a-hEGF-Mxe-SUMO表达载体，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α。步骤b中所述的RFES引物的序列如下：RFES-S：5′-TGAAGTGGTGGGAACTGCGCTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3′；RFES-A：5′-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGACCTCCAATCTGTTCGCGGT-3′。步骤c中所述的RFEMSH引物的序列如下：RFEMSH-S：5′-CTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGCATCACGGGAGATGCACTA-3′；RFEMSH-A：5′-CTTGATTGACTTCTGAGTCCGAAGCGTGGCTGACGAACCCGTT-3′。所述的表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO的表达方法，包括如下步骤：a.将表达载体转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)；b.诱导工程菌表达重组融合蛋白hEGF-Mxe-SUMO将步骤a中工程菌接种于含有氨苄青霉素的LB培养基，置于37℃、220rpm培养12h；然后按1：100的比例接种于含有氨苄青霉素的TB培养基中置于37℃、220rpm培养，当OD600达到0.4～0.8时加入终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，置于25℃、180rpm培养24h。所述的hEGF蛋白获得的步骤如下：a.纯化BindingBuffer重悬表达融合蛋白的工程菌株，高压破碎，12000rpm离心后收集上清，0.22μm滤膜过滤后进行镍柱亲和层析，收集洗脱样品透析至BindingBuffer，添加终浓度为20mM的二硫苏糖醇(DTT)，室温放置过夜；b.将上述样品透析至BindingBuffer，进行第二次镍柱亲和层析，收集穿过液样品即为hEGF蛋白。通过分子生物学技术建立一种促进hEGF在大肠杆菌高效功能性表达的方法。所述方法是采用RF克隆技术构建hEGF的融合表达载体pET21a-hEGF-Mxe-SUMO，通过大肠杆菌工程菌表达融合蛋白hEGF-Mxe-SUMO，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测融合蛋白的表达水平，在蛋白缓冲液中添加20mM的DTT诱导内含肽发生自剪切，纯化获得具有生物活性的hEGF蛋白(产量达29.4mg/L)。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：本发明的方法是通过酶切连接方法将人表皮细胞生长因子hEGF基因克隆到pET21a载体上，构建pET21a-hEGF载体，通过RestrictionSite-Free(RF)克隆技术将SUMO基因融合到hEGF基因的C端，以及内含肽Mxe基因插入hEGF和SUMO基因中间，构建pET21a-hEGF-Mxe-SUMO表达载体。将重组载体转化菌株E.coliBL21(DE3)，实现了融合蛋白的高效功能性表达。本发明为促进外源蛋白在大肠杆菌可溶表达提供了一种有效的思路和方法，SUMO标签融合到目的蛋白C端，能够有效地提高融合蛋白的功能性表达效率，进一步在融合蛋白中间加入可以自剪切的内含肽，在还原环境中切除融合蛋白的内含肽和SUMO蛋白，获得不带任何外源氨基酸序列且具有生物学活性的人表皮细胞生长因子。本方法实现了hEGF在大肠杆菌中高效功能性表达，同时为复杂的真核生物蛋白质在原核表达系统的高效生产提供了理论基础与设计新思路。附图说明图1是pET21a-hEGF载体构建菌落PCR鉴定图，泳道M：DNAMarker；泳道9～11：阳性克隆。图2是pET21a-hEGF-SUMO载体构建菌落PCR鉴定图，泳道M：DNAMarker；泳道2～15：阳性克隆。图3是pET21a-hEGF-SUMO小量表达结果图，泳道M：蛋白Marker；泳道1～2：hEGF-SUMO全液、上清液。图4是pET21a-hEGF-Mxe-SUMO载体(EMSH)构建的菌落PCR鉴定图，泳道M：DNAMarker；泳道1～3：阳性克隆。图5是EMSH小量表达结果图，泳道M：蛋白Marker；泳道1～2：EMSH全液、上清液。图6是EMSH大量表达及纯化结果图，泳道M：蛋白Marker；泳道1～2：EMSH全液、上清液；泳道3：穿过液；泳道4：50mM咪唑洗脱液；泳道5：500mM咪唑洗脱液。图7是EMSH的WesternBlotting结果图，泳道M：蛋白Marker；泳道1：纯化的EMSH蛋白。图8是Tricine-SDS-PAGE电泳检测EMSH蛋白自剪切后纯化样品结果图，泳道M：蛋白Marker，泳道1：上清液；泳道2：穿过液；泳道3：洗脱液。图9是重组表达和商业化hEGF促进Balb/c3T3细胞增殖效果图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1：pET21a-hEGF载体的构建(1)扩增引物序列的设计，含酶切位点NdeⅠ(EGF-s)和XhoⅠ(EGF-a)，下划线标记部分引物名称序列EGF-s5′-GGAATTCCATATGAATAGTGACTCTGAATGTCC-3′EGF-a5′-CCCTCGAGAGGCGCAGTTCCCACCACTT-3′(2)PCR反应体系(50μL)：反应组分含量SUMO-EGF2μLPrimeSTARHS(Premix)50μLEGF-s(10μM)2μLEGF-a(10μM)2μLddH2O44μL(3)PCR扩增反应程序：(4)PCR反应结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收200bp目的片段。(5)PCR产物37℃双酶切2h，体系如下：反应组分体积EGF基因1μgNdeⅠ2μLXhoⅠ2μL10×FastDigestbuffer5μLddH2OUpto50μL(6)载体37℃双酶切2h，体系如下：(7)16℃连接过夜，连接体系如下：反应组分体积pET21a双酶切产物60μghEGF双酶切产物40μgT4DNALigase1μL10×T4DNALigaseBuffer2μLddH2OUpto20μL(8)将连接产物转化到E.coliDH5α，挑选阳性克隆进行菌落PCR鉴定，体系如下：反应组分含量菌落单个菌2×PCRReactionMix10μLT7通用引物上游1μLT7通用引物下游1μLddH2OUpto20μL结果：如图1所示，菌落PCR产生条带大小约为350bp(通用引物长度加上部分载体序列)与理论结果一致，测序结果也显示与预期核苷酸序列完全一致。结论：pET21a-hEGF重组质粒构建成功。实施例2：pET21a-hEGF-SUMO载体的构建(1)扩增引物序列的设计引物名称序列RFES-S5′-TGAAGTGGTGGGAACTGCGCTCGGACTCAGAAGTCAATCA-3′RFES-A5′-TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGACCTCCAATCTGTTCGCGGT-3′(2)PCR扩增SUMO片段反应体系：反应组分含量SUMO-EGF2μLPrimeSTARHS(Premix)50μLRFES-S(10μM)2μLRFES-A(10μM)2μLddH2O44μL(3)PCR扩增SUMO片段反应程序：(4)PCR扩增pET21a-EGF载体反应体系：反应组分含量pET21a-EGF10ngPrimeSTARMAX(Premix)5μL上述PCR产物30ngddH2OUpto20μL(5)PCR扩增pET21a-EGF载体反应程序：(6)DpnⅠ消化亲本质粒反应体系：反应组分体积上述PCR产物16μLDpnI2μL10×FastDigestbuffer2μL(7)将连接产物转化到E.coliDH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行菌落PCR检验，体系如下：反应组分含量菌落少量2×PCRReactionMix10μLT7通用引物上游1μLT7通用引物下游1μLddH2OUpto20μL(8)将测序结果正确的重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)中，25℃诱导表达。结果：如图2所示，菌落PCR产生条带大小约为600bp(通用引物长度加上部分载体序列)与理论结果一致，测序结果也显示与预期核苷酸序列完全一致。如图3所示，hEGF-SUMO融合蛋白成功表达且部分可溶。结论：pET21a-hEGF-SUMO重组质粒构建成功，且在hEGF的C端融合SUMO标签，不影响SUMO的促可溶性表达效果。实施例3：pET21a-hEGF-Mxe-SUMO载体构建(1)扩增引物序列的设计：引物名称序列RFEMSH-S5′-CTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGCATCACGGGAGATGCACTA-3′RFEMSH-A5′-CTTGATTGACTTCTGAGTCCGAAGCGTGGCTGACGAACCCGTT-3′(2)PCR扩增Mxe片段反应体系：反应组分含量pTWIN12μLPrimeSTARHS(Premix)50μLRF-SEMSH(10μM)2μLRF-AEMSH(10μM)2μLddH2OUpto100μL(3)PCR扩增Mxe片段反应程序：(4)PCR扩增pET21a-hEGF-SUMO载体反应体系：反应组分含量hEGF-SUMO10ngPrimeSTARMAX(Premix)5μL上述PCR产物30ngddH2OUpto20μL(5)PCR扩增pET21a-hEGF-SUMO载体反应程序：(6)DpnⅠ消化亲本质粒反应体系：反应组分体积上述PCR产物16μLDpnⅠ2μL10×FastDigestbuffer2μL(7)将连接产物转化到E.coliDH5α，挑选阳性克隆进行菌落PCR鉴定，体系如下：反应组分含量菌落少量2×PCRReactionMix10μLT7通用引物上游1μLT7通用引物下游1μLddH2OUpto20μL(8)将测序结果正确的重组质粒转化到E.coliBL21(DE3)中，25℃诱导表达。结果：如图4所示，菌落PCR鉴定所产生条带大小约为1000bp(通用引物长度加上部分载体序列)与理论结果一致，测序结果也显示与预期核苷酸序列完全一致。如图5所示，hEGF-Mxe-SUMO融合蛋白在E.coliBL21(DE3)中成功实现了可溶性表达。结论：pET21a-hEGF-Mxe-SUMO重组质粒构建成功，且内含肽的插入进一步提高了重组蛋白的可溶表达量。实施例4：EMSH融合蛋白的纯化及诱导内涵肽自剪切后的二次纯化(1)EMSH在25℃，180rpm的情况下诱导表达24h。(2)收集菌体，纯化BindingBuffer重悬，进行镍柱亲和层析纯化，收集纯化前后的样品，SDS-PAGE检测，并将上样样品进行WesternBlot检测。(3)将纯化得到的重组蛋白透析到BindingBuffer，添加终浓度为20mMDTT室温过夜诱导内含肽自剪切。(4)将自剪切后的蛋白透析至BindingBuffer，进行二次镍柱亲和层析，Tricine-SDS-PAGE检测纯化样品。结果：如图6所示，500mM咪唑洗脱下来的蛋白条带大小为45kDa与重组蛋白理论大小一致，分子量略小的条带为体内自剪切后产生的MSH蛋白。如图7WesternBlotting检测结果进一步证明了存在轻微的体内自剪切现象，但大部分的重组蛋白没有发生体内自剪切。如图8所示，在穿过液样品中发现约为6kDa大小的蛋白条带与hEGF大小一致。结论：成功纯化到重组蛋白，且产量达到281mg/L，经过DTT诱导内含肽自剪切后进行二次纯化，收集穿过液可得到产量为29.4mg/L的hEGF蛋白。实施例5：重组hEGF的活性检验(1)参照《中华人民共和国药典》关于重组人表皮细胞生长因子的生物学活性检测标准。(2)Balb/c3T3细胞株(市售)用含10％(V/V)新生牛血清的1640培养基在37℃、5％二氧化碳条件下培养，控制细胞浓度为每1mL含1.0×105～5.0×105个细胞，传代后24～36小时用于生物学活性鉴定。(3)弃去培养皿中的培养液，消化和收集细胞，用10％新生牛血清的1640培养基稀释成没1mL含5.0×104～8.0×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时。(4)换培养基为含0.4％(V/V)新生牛血清的1640培养基，37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时。(5)弃去培养基，换成添加不同浓度的hEGF的含0.4％(V/V)新生牛血清的1640培养基，37℃、5％二氧化碳条件下培养64～72小时。(6)每孔加入20μLMTT溶液，37℃、5％二氧化碳条件下培养5小时，弃去培养板中的液体后，每孔加入100μLDMSO，充分混匀后在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果并分析。结果：如图9所示，随着hEGF的浓度增加，Balb/c3T3的增殖效果明显，其中500μg/L的hEGF的促增殖效果最好，Balb/c3T3细胞数量是对照组的1.43倍。且重组的hEGF与商业化的hEGF对Balb/c3T3的细胞增殖效果基本一致，说明重组的hEGF与商业化的hEGF具有相同促进Balb/c3T3细胞增殖的功能。结论：重组hEGF具有促进哺乳动物Balb/c3T3细胞增殖的生物活性。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3