一种TaqPlus聚合酶试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Taq Plus聚合酶试剂盒及其使用方法。

背景技术：

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是体外合成双链DNA的一种方法，技术基本原理是根据DNA双螺旋模型所建立的细胞复制的机制，以及双链DNA在体外复制的特点设计的。以DNA为模板，以小片段的DNA为引物，在DNA聚合酶的催化下将dNTPs合成为DNA新链。因此DNA聚合酶是实现DNA复制的关键。因此Taq DNA聚合酶广泛应用于PCR技术中，但是Taq DNA聚合酶缺乏校正功能，在PCR链的延伸反应中常因为发生错配或因为DNA模板高GC含量而终止,不能识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸使延伸反应继续。扩增片段的长度很难超过6kb,限制了PCR技术更为广泛的应用。人们又从古细菌分离出一种具有高保真性能的DNA聚合酶，其3’-5’外切酶校正活性能识别错误掺入延伸链中的碱基，并将其切下，利用DNA聚合酶活性添加为与模板互补的碱基，从而保证了新扩增链与模板的高度一致性。但是高保真聚合酶对引物和样品的结构、纯度和浓度要求比较高，反应灵敏度较低，扩增效率较低，限制了Pfu DNA聚合酶的使用和推广。

技术实现要素：

针对以上现有技术问题，本发明的目的在于提供一种Taq Plus聚合酶试剂盒及其使用方法，具体技术方案如下：

一种Taq Plus聚合酶试剂盒，包括方盒，泡沫垫以及试剂瓶，其中，所述方盒內置所述泡沫垫；所述泡沫垫上开设有四个孔；所述试剂瓶分别为1号试剂瓶、2号试剂瓶、3号试剂瓶、4号试剂瓶，放置于所述四个孔内；所述1号试剂瓶内盛放Taq Plus聚合酶，所述2号试剂瓶和3号试剂瓶内盛放缓冲液，所述4号试剂瓶内盛放增强剂溶液。

进一步地，所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶为PCR反应体系的复合酶，酶活比为1:1-4:3。

进一步地，所述复合酶有5’-3’外切核酸酶活性和3’-5’外切酶活性。

进一步地，所述增强剂溶液为Enhancer溶液，所述所述2号试剂瓶内盛放10×HP缓冲液，所述3号试剂瓶内盛放10×HF缓冲液。

进一步地，所述方盒为塑料方盒，所述试剂瓶均为透明试剂瓶。

进一步地，所述四个试剂瓶具有瓶盖，所述瓶盖的颜色均不相同，且其上均设有圆形标识。

进一步地，所述塑料方盒的内尺寸为150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，所述泡沫板尺寸为150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)。

上述Taq Plus聚合酶试剂盒的使用方法，包含如下步骤：

(1)准备试剂盒复合酶；

(2)准备试剂盒反应液；

(3)设置长片段扩增PCR反应体系；

(4)设置复杂模板扩增PCR反应体系；

(4)设置PCR反应条件；

(5)1％琼脂糖凝胶电泳。

进一步地，包含如下步骤：

(1)准备试剂盒复合酶：Taq DNA聚合酶(5U/μl)和高保真聚合酶(5U/μl)，酶活比为1:1-4:3；

(2)准备试剂盒反应液：10×HP缓冲液，10×HF溶液；

(3)长片段扩增PCR反应体系：模板2μl，10×HP缓冲液5μl，dNTPs 1μL，复合酶1μL，上游、下游引物各2μL，加ddH2O至50μl；

(4)复杂模板扩增PCR反应体系：模板2μl，10×HF缓冲液5μl，dNTPs 1μL，复合酶1μL，上游、下游引物各2μL，加ddH2O至50μl；

(4)PCR反应条件：92℃预变性2min，然后进行30个循环92℃变性15s，58℃复性15s，68℃延伸2min，最后68℃延伸3min；

(5)1％琼脂糖凝胶电泳。

进一步地，步骤(2)中同时准备Enhancer溶液，步骤(3)和(4)中，还根据需要加入Enhancer溶液，步骤(3)和(4)中，引物对包含上引物和下引物。

与目前现有技术相比，本发明试剂盒操作简单，减少操作过程中污染的产生，同时试剂盒内使用的试剂瓶都是透明的，瓶盖的颜色都不一样，瓶盖上有圆形标识，缩短了挑选试剂的时间，使用方便。具体来说：

1、本发明独创的复合酶使PCR具有扩增长度增加(简单模板可有效扩增长达45kb，对复杂模板也可达20kb)、且保真度好。

2、与单一的高保真聚合酶比较，具有扩增速度快，反应灵敏性和产量高的优势

3、本试剂盒操作简单，减少操作过程中污染的产生。

4、试剂盒内使用的试剂瓶都是透明的，瓶盖的颜色都不一样，瓶盖上有圆形标识，缩短了挑选试剂的时间，使用方便。

附图说明

图1为Taq Plus聚合酶试剂盒结构示意图

图2为检测条带图

具体实施方式

下面根据附图对本发明进行详细描述，其为本发明多种实施方式中的一种优选实施例。

在一个优选实施例中，参见图1，一种Taq Plus聚合酶试剂盒及其应用，包括塑料方盒，所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶为PCR反应体系的复合酶，酶活比为1:1-4:3。所述塑料方盒內置大小合适的泡沫垫(5)，所述泡沫垫有四个孔，所述孔内放置四个试剂瓶，分别为1号试剂瓶(1)、2号试剂瓶(2)、3号试剂瓶(3)、4号试剂瓶(4)，所述1号试剂瓶(1)内盛放Taq Plus聚合酶，所述2号试剂瓶(2)内盛放10×HP缓冲液，所述3号试剂瓶(3)内盛放10×HF溶液，所述4号试剂瓶(4)内盛放Enhancer溶液。

所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶为PCR反应体系的复合酶，酶活比为1:1-4:3，所述2号试剂瓶内盛放10×HP缓冲液，所述3号试剂瓶内盛放10×HF缓冲液，所述增强剂溶液为Enhancer溶液，所述泡沫板尺寸为150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，但是不限于此，所述塑料方盒的内尺寸为150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，但是不限于此，所述试剂盒内使用的试剂瓶都是透明的，瓶盖的颜色都不一样，并且瓶盖上有圆形标识。

在另一个优选实施例中，可以采用如下方案：一种Taq Plus聚合酶试剂盒，其复合酶有5’-3’外切核酸酶活性和3’-5’外切酶活性。与Taq DNA聚合酶相比，具有扩增长度增加(简单模板可有效扩增长达45kb，对复杂模板也可达20kb)、且保真度好；与单一的高保真聚合酶比较，具有扩增速度快，反应灵敏性和产量高的优势，解决现有技术中的缺陷。

一种Taq Plus聚合酶试剂盒及其应用，包括塑料方盒，所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶为PCR反应体系的复合酶，酶活比为1:1-4:3。所述塑料方盒內置大小合适的泡沫垫，所述泡沫垫有四个孔，所述孔内放置四个试剂瓶，分别为1号试剂瓶、2号试剂瓶、3号试剂瓶、4号试剂瓶，所述1号试剂瓶内盛放Taq DNA聚合酶，所述2号试剂瓶内盛放10×HP缓冲液，所述3号试剂瓶内盛放10×HF溶液，所述4号试剂瓶内盛放Enhancer溶液。

所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶为PCR反应体系的复合酶，酶活比为1:1-4:3，所述2号试剂瓶内盛放10×HP缓冲液，所述3号试剂瓶内盛放10×HF缓冲液，所述增强剂溶液为Enhancer溶液，所述塑料方盒的内尺寸为150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，但是不限于此，所述泡沫板尺寸为150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，但是不限于此，所述试剂盒内使用的试剂瓶都是透明的，瓶盖的颜色都不一样，并且瓶盖上有圆形标识。本发明方法包含如下步骤：

(1)复合酶：Taq DNA聚合酶(5U/μl)和高保真聚合酶(5U/μl)，酶活比为1:1-4:3。

(2)反应液：10×HP缓冲液，10×HF溶液，Enhancer溶液。

(3)长片段扩增PCR反应体系：模板2μl，10×HP缓冲液5μl，dNTPs 1μL，复合酶1μL，上游、下游引物各2μL，Enhancer溶液5μl(根据个人需要加入)，加ddH2O至50μl。

(4)复杂模板扩增PCR反应体系：模板2μl，10×HF缓冲液5μl，dNTPs 1μL，复合酶1μL，上游、下游引物各2μL，Enhancer溶液2.5μl(根据个人需要加入)，加ddH2O至50μl。

(4)PCR反应条件：92℃预变性2min，然后进行30个循环92℃变性15s，58℃复性15s，68℃延伸2min，最后68℃延伸3min。

(5)1％琼脂糖凝胶电泳

本发明中，(3)、(4)步骤中引物对包含上引物和下引物，根据本试剂盒的具体应用可进行单独设计合成。

下述实施案例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施案例：各种大片段复杂模板的扩增。

1、PCR体系

*Optional

2、PCR条件

X*：predicted product length in kb.

3、1％琼脂糖凝胶电泳：检测条带。

上面结合附图对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。